牦牛卵巢小RNA高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

熊顯榮，蘭道亮，2，李　鍵，2*，字向東，林亞秋，馬　力

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041)

?

牦牛卵巢小RNA高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

熊顯榮1，蘭道亮1，2，李鍵1，2*，字向東1，林亞秋1，馬力1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041)

摘要：本研究旨在利用高通量測(cè)序技術(shù)描繪牦牛卵巢sRNA圖譜，為探析牦牛繁殖性能提供基礎(chǔ)。以牦牛卵巢組織作為研究對(duì)象，構(gòu)建牦牛sRNA文庫(kù)，進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，最后利用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證miRNA在牦牛卵巢組織中的表達(dá)。經(jīng)測(cè)序后得到包含12 126 208 條clean reads，其中特異序列為212 757條；比對(duì)分析顯示，只有7 383 536 (60.89%) 條總序列及80 981(38.06%) 條特異序列能與牦?；蚪M匹配。與黃牛相比，牦牛sRNA中有56個(gè)表達(dá)量上調(diào)，其中miR-135a表達(dá)上調(diào)最顯著；有33個(gè)表達(dá)下調(diào)，其中miR-2316表達(dá)下調(diào)最顯著。RT-qPCR驗(yàn)證6個(gè)miRNA在牦牛卵巢組織中的表達(dá)情況，定量結(jié)果和測(cè)序結(jié)果基本一致。與牦牛EST序列信息比對(duì)后共預(yù)測(cè)出5個(gè)新miRNA。本研究成功繪制牦牛卵巢sRNA圖譜，同時(shí)證實(shí)RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)在完善sRNA信息及挖掘新miRNA方面的優(yōu)勢(shì)，對(duì)研究sRNA在牦牛遺傳育種以及以牦牛為重要高原動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行高原適應(yīng)性和抗逆性等相關(guān)領(lǐng)域的研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：牦牛；卵巢；高通量測(cè)序；小RNA；生物信息學(xué)

牦牛被稱(chēng)作高原之舟，主要分布在中國(guó)青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)。在長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇的共同作用下，牦牛對(duì)高海拔、低溫、低氧牧區(qū)具有良好適應(yīng)性，能充分利用高寒草場(chǎng)資源。牦牛是當(dāng)?shù)啬撩褓?lài)以生存和發(fā)展的生產(chǎn)、生活資料，也是牧區(qū)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)和牧民經(jīng)濟(jì)收入的主要來(lái)源[1]。但與普通牛種相比，牦牛生長(zhǎng)速度慢、性成熟較晚，而且繁殖性能低，成為高原畜牧業(yè)發(fā)展及生態(tài)保護(hù)的主要瓶頸之一。近期牦?；蚪M的測(cè)序工作基本完成[2]，為下一步開(kāi)展保護(hù)牦牛遺傳資源、提高牦牛生產(chǎn)性能、研究牦牛生長(zhǎng)發(fā)育及探析繁殖性能等諸多方面工作提供可靠的依據(jù)。

小分子RNA(Small RNA，sRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)20～30核苷酸(Nucleotide，nt)的非編碼RNA分子。sRNA最初在秀麗線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，且廣泛存在于真核生物中，是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子[3-4]。大量研究表明小RNA具有廣泛的生物學(xué)功能，對(duì)個(gè)體發(fā)育調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生物過(guò)程起重要作用[5-6]。sRNA主要是通過(guò)抑制靶基因翻譯或者是直接降解靶基因mRNA達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)，由此可知sRNA對(duì)大多數(shù)的靶基因都是起負(fù)調(diào)控作用。鑒于sRNA的生物學(xué)重要性，準(zhǔn)確鑒定其序列及表達(dá)時(shí)空性是當(dāng)務(wù)之急。然而sRNA序列短、同源性高，因此利用傳統(tǒng)的克隆法、基因芯片技術(shù)等檢測(cè)sRNA非常困難。此外，sRNA的數(shù)量巨大，相應(yīng)的工作較復(fù)雜、費(fèi)用高、效率低等；再次假陽(yáng)性高、靈敏度低、速度慢，難以發(fā)現(xiàn)低表達(dá)量和低拷貝的新sRNA。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)相繼誕生并逐漸成熟。高通量測(cè)序技術(shù)不但能夠克服以上難題，而且在發(fā)現(xiàn)新的sRNA上具有顯著優(yōu)勢(shì)。目前高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于擬南芥[7]、水稻[8]、小麥[9]、黑猩猩[10]、人[11]等生物sRNA的研究。

目前有關(guān)sRNA生物學(xué)作用的研究不斷深入，表明其在動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞死亡、細(xì)胞分化和應(yīng)答外界脅迫等方面具有重要功能[5，12-14]，并在生物合成和功能研究方面取得了一定的研究進(jìn)展[15]，但在高原動(dòng)植物上的相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究利用新二代的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)牦牛卵巢sRNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序并做了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，以期反映高通量測(cè)序技術(shù)在加速高原動(dòng)物sRNA的發(fā)現(xiàn)、促進(jìn)高原動(dòng)物sRNA的功能研究以及提高人們對(duì)動(dòng)物sRNA進(jìn)化的認(rèn)識(shí)等優(yōu)勢(shì)。此外，為深入研究sRNA在參與調(diào)節(jié)卵泡生成及排卵過(guò)程中所起作用提供基礎(chǔ)性工作，對(duì)研究sRNA在牦牛遺傳育種以及以牦牛為重要高原動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行高原適應(yīng)性和抗逆性等相關(guān)領(lǐng)域的研究具有重要意義。

1材料與方法

1.1樣品采集

從四川紅原縣屠宰場(chǎng)隨機(jī)選取5頭年齡、個(gè)體、體質(zhì)基本一致的成年(約3周歲)麥洼母牦牛，屠宰后立即采集卵巢，用生理鹽水沖洗干凈，液氮速凍后，存于-80 ℃?zhèn)溆?，用于?RNA的提取。用同樣的方法，在成都青白江屠宰場(chǎng)選取5頭健康的成年黃牛(約3周歲)的卵巢，作為對(duì)照組。

1.2總RNA提取

參照Invitrogen公司的Trizol法分別提取5頭牦牛卵巢組織的總RNA，為保證RNA的純度，向各RNA樣本中加入適量的DNase I (Invitrogen，USA)，37 ℃孵育10 min，然后各取2 μg混合均勻組成一個(gè)RNA樣品池(Sample pool)。通過(guò)Nanodrop ND-1000 (LabTech，USA) 檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。

1.3小RNA文庫(kù)的構(gòu)建及Illumina-Solexa 高通量測(cè)序

采用Ambion公司SOLiD Small RNA Expression試劑盒構(gòu)建牦牛卵巢的sRNA文庫(kù)。首先，sRNA在連接酶的作用下加5′和3′接頭，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。向cDNA中加入適量的RNase用于消除未被轉(zhuǎn)錄的RNA。為了獲得足夠的高質(zhì)量cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到測(cè)序文庫(kù)。構(gòu)建好的文庫(kù)用2100 Bioanalyzer (Agilent)和Nanodrop ND-1000進(jìn)行質(zhì)量和濃度的檢測(cè)，然后送深圳華大基因公司測(cè)序。

1.4小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序所得的數(shù)據(jù)(Raw reads)經(jīng)除去接頭序列、空讀序列以及低質(zhì)量序列(Phred quality < 5)后得到純凈序列(Clean reads)。使用SOAPaligner/SOAP 2.0軟件將序列比對(duì)到牦?；蚪M，統(tǒng)計(jì)reads在參考基因組及基因序列上的分布情況及覆蓋度，與牦?；蚪M至少有3次匹配的reads作為潛在的sRNA及進(jìn)一步分析。

將sRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)及Sanger中心的Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)中的ncRNA (非編碼RNA)分別進(jìn)行比對(duì)，識(shí)別sRNA序列中的rRNA、tRNA、snRNA等ncRNA；與miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBase)中的miRNA進(jìn)行比對(duì)，鑒定樣品中的已知miRNA；通過(guò)片段互相比對(duì)，確定與重復(fù)序列相關(guān)的siRNA；與外顯子、內(nèi)含子的比對(duì)鑒定mRNA降解片段。按照優(yōu)先級(jí)(rRNA等>已知miRNA>重復(fù)序列>外顯子>內(nèi)含子)，應(yīng)用WEGO程序?qū)@些sRNA涉及的主要生物學(xué)功能進(jìn)行GO分類(lèi)注釋。將未獲得注釋的sRNA作為潛在的新miRNA，利用Mireap和miRanda對(duì)這些sRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、酶切位點(diǎn)以及靶基因等，具體分析流程見(jiàn)圖1。通過(guò)比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)測(cè)序序列的分布情況及頻率，同時(shí)利用RPKM法計(jì)算miRNA的表達(dá)量。

1.5小RNA表達(dá)的驗(yàn)證

采用RT-qPCR法對(duì)高通量測(cè)序部分sRNA的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。利用Ambion mirVanaTMKit試劑盒取提總RNA，RNase-free DNase I去除基因組DNA，然后根據(jù)成熟miRNA的序列設(shè)計(jì)引物，以18S rRNA為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR。采用Stratagene公司的High-Specificity miRNA RT-qPCR Detection Kit試劑盒及CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)。所有定量PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，65～95 ℃每隔0.5 ℃讀板1次，繪制熔解曲線。檢測(cè)結(jié)果采用表達(dá)量差異△△Ct法對(duì)目的sRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6miRNA靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及其功能分類(lèi)

通過(guò)miRNA序列與牦牛已公布EST的比對(duì)，預(yù)測(cè)潛在的miRNA靶位點(diǎn)，具體方法參照文獻(xiàn)[16-17]。預(yù)測(cè)遵循miRNA與靶基因錯(cuò)配不超過(guò)4個(gè)堿基、相鄰堿基不錯(cuò)配等原則。然后將預(yù)測(cè)的所有靶基因進(jìn)行GO注釋分析，預(yù)測(cè)其可能參與的生物學(xué)過(guò)程和功能，進(jìn)行相應(yīng)分類(lèi)及統(tǒng)計(jì)。

1.7統(tǒng)計(jì)與分析

所有組別的試驗(yàn)至少重復(fù)3次，SPSS13.0進(jìn)行ONEWAY ANOVA檢驗(yàn)，用SSR法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1牦牛小RNA

為了獲得牦牛小RNA，構(gòu)建了牦牛卵巢sRNA文庫(kù)，并用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。去除接頭并濾去低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，獲得長(zhǎng)度分布在16～30 nt的大量牦牛sRNA序列，其中以22 nt的序列居多，是由Dicer酶途徑產(chǎn)生的sRNA的典型長(zhǎng)度，具有一定的保守性(圖2)。去掉小于18 nt的序列后，最

終獲得12 126 208條純凈序列(表1)，其中特異序列的數(shù)目為 212 757 條。經(jīng)SOAP 軟件將這些sRNA與牦牛、黃牛基因組比對(duì)后，其中只有7 383 536 (60.89%)的總序列及80 981(38.06%) 的特異序列能匹配牦牛基因組。將牦牛sRNA與GenBank、Rfam、miRBase進(jìn)行多重比對(duì)，最后依次注釋(圖3，表2)。由于牦牛全基因組序列的不夠完全，約69%的sRNA序列未能注釋。所注釋的sRNA中，rRNA最多，占總數(shù)的13.4%，其次是外顯子正義(5.8%)、內(nèi)含子正義(3.23%)、tRNA (3.27%)，其余都只占很少一部分。

2.2miRNA的分析

為了尋找牦牛卵巢中的已知miRNA，將牦牛sRNA與miRBase中的miRNA進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，總共有9 161 081條能匹配，其中5 035條特異序列與牦牛miRNA有同源性(表2)。表達(dá)豐度差異分析后發(fā)現(xiàn)，在牦牛sRNA中有56個(gè)miRNA表達(dá)量比黃牛顯著上調(diào)，有33個(gè)miRNA表達(dá)顯著下調(diào)(圖4)。其中miR-135a表達(dá)上調(diào)極顯著(P<0.01)，miR-2316表達(dá)下調(diào)極顯著(P<0.01)。

表1黃牛與牦牛小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)處理及片段長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)

Table 1Summary of data cleaning and distribution of tags produced by yak and cattle small RNA sequencing

表2牦牛sRNA注釋結(jié)果

Table 2Annotation of yak small RNAs

2.3新miRNA的預(yù)測(cè)與分析

miRNA初始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)多位于基因間隔區(qū)、內(nèi)含子以及編碼序列的反向重復(fù)序列上，其前體具有標(biāo)志性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，成熟體的形成是由Dicer酶的剪切實(shí)現(xiàn)的。利用這一顯著特征通過(guò)Mireap軟件來(lái)預(yù)測(cè)新的miRNA。初步預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，共發(fā)現(xiàn)27條候選miRNA，并且這些候選miRNA首位堿基具有一定的偏向性(圖5)。利用牦牛EST序列信息進(jìn)行牦牛新miRNA預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)出5個(gè)miRNA (依次命名為new miRNA1、new miRNA2、new miRNA3、new miRNA4和new miRNA5)，但其表達(dá)量都較低(表3)。

2.4已知miRNA的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測(cè)序所獲得的結(jié)果，隨機(jī)選擇6個(gè)表達(dá)量較高的miRNA，利用RT-qPCR檢測(cè)其在牦牛卵巢中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示與高通量測(cè)序結(jié)果基本吻合(圖6)，由此表明本次高通量測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性較高，可信度大。

2.5miRNA的潛在靶位點(diǎn)及功能分類(lèi)

為了進(jìn)一步深入研究miRNA在牦牛卵巢中的生物學(xué)功能，通過(guò)與已公布的牦牛EST序列比對(duì)，預(yù)測(cè)潛在的miRNA靶位點(diǎn)。結(jié)果顯示，已知的保守miRNA共預(yù)測(cè)出1 403個(gè)潛在靶基因，3 501個(gè)靶位點(diǎn)。如圖7所示，這些潛在靶基因涉及較廣的生物學(xué)過(guò)程及功能，涉及生物學(xué)過(guò)程(Biological processes)、細(xì)胞組分(Cellular components)及分子功能(Molecular functions)3大類(lèi)共47個(gè)小類(lèi)。由于牦牛EST數(shù)據(jù)的有限，未能對(duì)預(yù)測(cè)出的5個(gè)新miRNA進(jìn)行潛在靶位點(diǎn)分析。

表3利用牦牛EST 序列預(yù)測(cè)的新 miRNA

Table 3The novel miRNAs prediction with yak EST sequences

3討論

3.1牦牛卵巢sRNA輪廓及特點(diǎn)

牦牛是青藏高原地區(qū)及周邊群眾賴(lài)以生存的重要生產(chǎn)生活資料之一。但其性成熟較晚，且普遍繁殖性能低下，成為長(zhǎng)期制約牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題。sRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是動(dòng)植物的一種新型基因調(diào)控機(jī)制，它在個(gè)體發(fā)育調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生物過(guò)程中起著舉足輕重的作用。本研究將5頭牦牛的卵巢樣本RNA等量混勻，組成了一個(gè)牦牛卵巢樣本池，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)后一共獲得12 126 208條純凈序列，其中有212 757條特異序列，由此表明文庫(kù)構(gòu)建成功且測(cè)序質(zhì)量良好。這些sRNA長(zhǎng)度主要集中在20～23 nt，與M.M.Hossain等[18]研究結(jié)果基本一致。與牦牛基因組比對(duì)后發(fā)現(xiàn)共有60.89%的總序列及38.06%的特異序列能匹配。經(jīng)功能注釋后發(fā)現(xiàn)miRNA(75.55%)占總序列數(shù)的大部分，但卻只占特異序列數(shù)的2.37%，由此表明miRNA在牦牛卵巢組織中有較復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。此外未注釋的sRNA有21.12%的總序列及68.92%的特異序列，可能是由于牦牛基因組的不夠完善。當(dāng)然，隨著牦?；蚪M序列信息的不斷補(bǔ)充，可以進(jìn)一步利用其基因組信息進(jìn)行牦牛sRNA的相關(guān)研究，這樣獲得的結(jié)果將會(huì)更加豐富和完善。

3.2sRNA與卵巢的功能

卵巢的濾泡發(fā)生和早期胚胎發(fā)育需要大量基因表達(dá)的協(xié)調(diào)和信息交流。這些基因的表達(dá)需要時(shí)空上的精準(zhǔn)性，任何的表達(dá)改變均會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞和早期胚胎的發(fā)育異常。然而sRNA介導(dǎo)的調(diào)控通路可能是卵巢基因表達(dá)精準(zhǔn)性的保障。目前研究表明，在哺乳動(dòng)物卵巢組織中sRNA廣泛存在。S.Ro等[19]在成熟的老鼠卵巢中鑒定出122條成熟的miRNA，認(rèn)為這些sRNA在卵巢的發(fā)育以及卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用。此外，T.Mishima等[20]也在成年老鼠的卵巢中獲得已知miRNA，且一條新的miRNA，推測(cè)這些sRNA與小鼠的繁殖機(jī)能存在密切聯(lián)系。M.M.Hossain等[18]在牛的卵巢中發(fā)現(xiàn)了74條miRNA，其中有24條是新發(fā)現(xiàn)的miRNA。S.K.Tripurani等[21]在新生牛胎兒的卵巢中發(fā)現(xiàn)58條miRNA，其中有16條是首次發(fā)現(xiàn)。隨著測(cè)序技術(shù)以及計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的快速發(fā)展，sRNA在生殖領(lǐng)域的的研究也做得更廣泛更深入。H.W.Ahn等[22]利用Illumina Genome Analyzer在老鼠新生胎兒的卵巢中對(duì)miRNA進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)516條miRNA，其中有118條miRNA是首次發(fā)現(xiàn)的。此外，C.J.Creighton等[23]利用Illumina GenomeAnalyzer深度測(cè)序技術(shù)，從正常和疾病女性生殖器官得到的103個(gè)組織或者細(xì)胞系建立sRNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了404個(gè)已知的miRNA和132個(gè)新miRNA。由此推測(cè)，sRNA在卵巢中有著及其重要的作用。

卵泡的生長(zhǎng)與排卵過(guò)程的順利進(jìn)行與sRNA存在密切的聯(lián)系。F.Tang等[24]研究表明，miR 30、miR 16、let 7和miR l792家簇在卵子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式是動(dòng)態(tài)變化的。let 7家族的miRNA在多種細(xì)胞活動(dòng)包括細(xì)胞周期調(diào)控都有重要功能，隨著卵泡的生長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸增加。張曉東等發(fā)現(xiàn)let 7家族的多個(gè)成員在山羊卵巢中均有較高表達(dá)[25]。本研究中，let 7a、let 7b、let 7c、let 7f、let 7g和let 7e在牦牛卵巢中均有較高表達(dá)，其中l(wèi)et 7a表達(dá)量在所有sRNA中最高(187 666)。經(jīng)靶基因預(yù)測(cè)和KEGG通路分析表明，let 7家族可能與Wnt、TGF-β等信號(hào)通路有關(guān)，從而影響卵泡發(fā)育、排卵和激素釋放等生殖活動(dòng)[26]。目前已經(jīng)證實(shí)sRNA與原始卵泡在卵巢內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育到成熟排卵也存在一定的聯(lián)系。D.Tesfaye等[27]發(fā)現(xiàn)在牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，有31個(gè)sRNA表達(dá)下調(diào)，28個(gè)表達(dá)上調(diào)；其中miR-125、miR-127等的上調(diào)表達(dá)對(duì)卵泡發(fā)育具有重要作用。近年來(lái)，研究報(bào)道sRNA與卵巢病變有關(guān)，且miRNA已成為卵巢病理診斷的重要手段。M.V.Iorio等[28]通過(guò)比較分析卵巢的腫瘤組織和正常組織發(fā)現(xiàn)，miRNA在卵巢上皮組織中表達(dá)差異顯著，其中，卵巢癌組織中過(guò)表達(dá)的miRNA有miR-200a、miR-141、miR-200c等，而miR-199、miR-140等明顯下調(diào)。此外，在轉(zhuǎn)錄前這些下調(diào)的miRNA的基因組拷貝數(shù)明顯低于正常值。經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些miRNA家簇的靶基因主要調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和免疫反應(yīng)。這就意味著這些miRNA家簇的下調(diào)導(dǎo)致卵巢腫瘤的生長(zhǎng)加速[29]。卵巢上皮細(xì)胞的異常增殖可能是卵巢癌發(fā)病的早期征兆。卵巢癌組織中miRNA-210和miRNA-214顯著下調(diào)，可能引起HIF和Akt信號(hào)通路的激活而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[30]。功能早衰的卵巢組織中，miR-202、miR-146a、miR-125b-2、miR-139-3p、miR-654-5p等都過(guò)表達(dá)，而let-7c和miR-144表達(dá)卻低于正常組織[28]。本研究中，所采集的卵巢組織均來(lái)自成年的空懷期健康牦牛，未發(fā)現(xiàn)卵巢異常。然而有關(guān)sRNA在卵巢發(fā)育、卵泡生長(zhǎng)、早期胚胎發(fā)育及卵巢病變中的功能研究還十分有限，有待進(jìn)一步深入研究。

3.3牦牛sRNA的驗(yàn)證及新miRNA的發(fā)現(xiàn)

牦牛卵巢中的sRNA與牛、人等的已知miRNA具有高度同源性，相似度在90%以上，表明牦牛的miRNA調(diào)控方式可能與其他動(dòng)物有一定的相似性。其中有些miRNA家族表達(dá)量特別高，如let-7，miR140，miR199及miR320等，它們可能在牦牛卵巢中起重要調(diào)控作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些miRNA在牦牛卵巢中的表達(dá)，用RT-qPCR的方法對(duì)測(cè)序豐度較高的6個(gè)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，與測(cè)序結(jié)果基本一致，說(shuō)明這些miRNA確實(shí)存在于牦牛卵巢中且表達(dá)量較高。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-135a和miR-2316變化極顯著。H.W.Ahn等[22]報(bào)道m(xù)iR-135a在新生小鼠卵巢中也大量表達(dá)，推測(cè)其在性腺的分化及發(fā)育過(guò)程中起重要作用。M.M.Hossain等[18]也在成年牛的卵巢中獲得miR-2316，推測(cè)miR-2316與牛的繁殖機(jī)能存在密切聯(lián)系，促使卵子細(xì)胞的分裂、胚胎的發(fā)育以及調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

盡管牦?；蚪M序列不夠完善，本研究利用數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST信息預(yù)測(cè)出5個(gè)新miRNA。當(dāng)然這5個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA有待進(jìn)一步驗(yàn)證。大部分動(dòng)物的miRNA靶位點(diǎn)分布在編碼區(qū)的某個(gè)互補(bǔ)位置，偶爾在5′端的非編碼區(qū)[31]。本研究所預(yù)測(cè)的新miRNA的注釋功能是參與細(xì)胞代謝以及一些生理加工過(guò)程，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[32]，但與植物方面相關(guān)報(bào)道存在較大差異[33]。由于牦牛的全基因組以及其EST序列信息有限，確定新miRNA的潛在靶位點(diǎn)以及其功能存在較大的困難。

4結(jié)論

本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)牦牛卵巢進(jìn)行了sRNA測(cè)序分析，研究其sRNA的表達(dá)譜。表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，在牦牛sRNA中有56個(gè)miRNA表達(dá)量比黃牛顯著上調(diào)，有33個(gè)miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。與牦牛EST序列信息共預(yù)測(cè)出5個(gè)新miRNA。這些miRNA在牦牛中到底起到何作用，是否在決定牦牛高原適應(yīng)性及繁殖性能中起調(diào)控作用，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]XIONG X R，LAN D L，LI J，et al.Zebularine and scriptaid significantly improve epigenetic reprogramming of yak fibroblasts and cloning efficiency[J].CellReprogram，2013，15(4)：293-300.

[2]QIU Q，ZHANG G J，MA T，et al.The yak genome and adaptation to life at high altitude[J].NatGenet，2012，44(8)：946-949.

[3]LEE R C，F(xiàn)EINBAUM R L，AMBROS V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell，1993，75(5)：843-854.

[4]BARTEL D P.MicroRNAs genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116(2)：281-297.

[5]CHEN X M.A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development[J].Science，2004，303(5666)：2022-2025.

[6]PERNAUTE B，SPRUCE T，RODRIGUEZ T A，et al.miRNA-mediated regulation of cell signaling and homeostasis in the early mouse embryo[J].CellCycle，2011，10(4)：584-591.

[7]LU C，TEJ S S，LUO S J，et al.Elucidation of the small RNA component of the transcriptome[J].Science，2005，309 (5740)：1567-1569.

[8]SUNKER R，ZHOU X F，ZHENG Y，et al.Identification of novel and candidate miRNAs in rice by high throughput sequencing[J].BMCPlantBiol，2008，8：25.

[9]YAO Y，GUO G，NI Z，et al.Cloning and characterization of microRNAs from wheat (Triticum aestivum L.)[J].GenomeBiol，2007，8(6)：R96.

[10]BEREZIKOV E，TETERING G V，VERHEUL M，et al.Many novel mammalian microRNA candidates identified by extensive cloning and RAKE analysis[J].GenomeRes，2006，16(10)：1289-1298.

[11]MORIN R D，O’CONNOR M D，GRIFFITH M，et al.Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells[J].GenomeRes，2008，18(4)：610-621.

[12]HUANG A Y，WANG G C，HE L W，et al.Characterization of small RNAs fromUlvaproliferaby high-throughput sequencing and bioinformatics analysis[J].ChineseSciBul，2011，56(27)：2916-2921.

[13]BAEHRECKE E H.miRNAs：micro managers of programmed cell death[J].CurrBiol，2003，13(12)：R473-475.

[14]HOUBAVIY H B，MURRAY M F，SHARP P A.Embryonic stem cell-specific microRNAs[J].DevCell，2003，5(2)：351-358.

[15]SUBRAMANIAN S，F(xiàn)U Y，SUNKAR R，et al.Novel and nodulation-regulated microRNAs in soybean roots[J].BMCGenomics，2008，9：160.

[16]ALLEN E，XIE Z X，GUSTAFSON A M，et al.microRNA-directed phasing duing trans-acting siRNA biogenesis in plants[J].Cell，2005，121(2)：207-221.

[17]SCHWAB R，PALATNIK J F，RIESTER M，et al.Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J].DevCell，2005，8(4)：517-527.

[18]HOSSAIN M M，GHANEM N，HOELKER M，et al.Identification and characterization of miRNAs expressed in the bovine ovary[J].BMCGenomics，2009，10：443.

[19]RO S，SONG R，PARK C，et al.Cloning and expression profiling of small RNAs expressed in the mouse ovary[J].RNA，2007，13(12)：2366-2380.

[20]MISHIMA T，TAKIZAWA T，LUO S S，et al.MicroRNA (miRNA) cloning analysis reveals sex differences in miRNA expression profiles between adult mouse testis and ovary[J].Reproduction，2008，136(6)：811-822.

[21]TRIPURANI S K，XIAO C D，SALEM M，et al.Cloning and analysis of fetal ovary microRNAs in cattle[J].AnimReprodSci，2010，120(1-4)：16-22.

[22]AHN H W，MORIN R D，ZHAO H，et al.MicroRNA transcriptome in the newborn mouse ovaries determined by massive parallel sequencing[J].MolHumReprod，2010，16(7)：463-471.

[23]CREIGHTON C J，BENHAM A L，ZHU H F，et al.Discovery of novel microRNAs in female reproductive tract using next generation sequencing[J].PLoSOne，2010，5(3)：e9637.

[24]TANG F，KANEDA M，O’CARROLL D，et al．Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development[J].GenesDev，2007，21(6)：644-648.

[25]ZHANG X D，LING Y H，ZHANG Y H，et al.MicroRNAs in ovaries of goats (Caprahircus) identified by solexa sequencing[J].ScientiaAgriculturaSinica，2013，46(1)：146-153.

[26]SIROTKIN A V，OVCHARENKO D，GROSSMANN R，et al.Identification of microRNAs controlling human ovarian cell steroidogenesis via a genome-scale screen[J].JCellPhysiol，2009，219(2)：415-420.

[27]TESFAYE D，WORKU D，RINGS F，et al.Identification and expression profiling of microRNAs during bovine oocyte maturation using heterologous approach[J].MolReprodDev，2009，76(7)：665-677.

[28]IORIO M V，VISONE R，DI LEVA G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer[J].CancerRes，2007，67(18)：8699-8707.

[29]ZHANG L，VOLINIA S，BONOME T，et al.Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer[J].ProcNatlAcadSciUSA，2008，105(19)：7004-7009.

[30]GIANNAKAKIS A，SANDALTZOPOULOS R，GRESHOCK J，et al.miR-210 links hypoxia with cell cycle regulation and is deleted in human epithelial ovarian cancer[J].CancerBiolTher，2008，7(2)：255-264.

[31]GORAVANAHALLY M P，SALEM M，YAO J，et al.Differential gene expression in the bovine corpus luteum during transition from early phase to midphase and its potential role in acquisition of luteolytic sensitivity to prostaglandin F2 alpha[J].BiolReprod，2009，80(5)：980-988.

[32]OBERNOSTERER G，MARTINEZ J，ALENIUS M.Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections[J].NatProtoc，2007，2(6)：1508-1514.

[33]LIANG C W，ZHANG X W，ZOU J，et al.Identification of miRNA from Porphyra yezoensis by high-throughput sequencing and bioinformatics analysis[J].PLoSOne，2010，5(5)：e10698.

(編輯程金華)

Solexa Sequencing of Small RNAs in Yak (Bosgrunniens) Ovaries and Bioinformatics Analysis

XIONG Xian-rong1，LAN Dao-liang1，2，LI Jian1，2*，ZI Xiang-dong1，LIN Ya-qiu1，MA Li1

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China；2.InstituteofQinghai-TibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Key words:yak；ovary；Solexa sequencing；small RNA；bioinformatics

Abstract:The small RNA transcriptome profile of yak ovary was described by Solexa deep sequencing，and provided the basic data for future study on yak breeding performance.In this study，yak ovaries were used for building small RNAs library，and then Solexa sequencing and bioinformatics were applied to analysis.Meanwhile，the expression of selected miRNAs was validated by RT-qPCR.After Solexa sequencing，a total of 12 126 208 clean reads were obtained from the ovary library，which contained 212 757 distinct sequences.Alignment analysis showed that 7 383 536 (60.89%) of total sequences and 80 981 (38.06%) distinct sequences were mapped to the yak reference genome.The results of differential expression analysis showed that 56 small RNAs were up-regulated and 33 small RNAs were down-regulated in yak ovary compared to the cattle counterparts.Among these RNA，miR-135a and miR-2316 had the largest fold-change.The expression of 6 selected miRNAs in yak ovary tissues obtained by RT-qPCR was consistent with the Solexa sequencing results.Furthermore，5 novel small RNAs were predicted after compared to the yak EST sequence information.All above suggested the small RNAs transcriptome profile of yak ovary was successfully described，and our results confirmed that Solexa sequencing technology has a great advantage in facilitating small RNA information and mining new miRNAs，and provide valuable small RNA data for further facilitate the yak genetic breeding and study the adaptation and resistance to high altitude and other related fields of highland animal.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.008

收稿日期：2015-04-21

基金項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃(2014NZ0114);西南民族大學(xué)牦牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(13CXTD01)

作者簡(jiǎn)介：熊顯榮(1984-)，男，江西贛州人，碩士，主要從事牦牛細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail: xianrongxiong@163.com *通信作者：李鍵，教授，主要從事牦牛細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail: jianli_1967@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S823.8+5.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0055-09