許　丹，鄭煒望

(1. 江南大學醫(yī)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214071)

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綜述

欖香烯治療原發(fā)性肝癌作用機制研究進展

許丹1，鄭煒望2

(1. 江南大學醫(yī)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214071)

欖香烯；原發(fā)性肝癌；作用機制

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，簡稱肝癌)是臨床最常見的惡性腫瘤之一，以肝細胞肝癌(HCC)最為常見。2012年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)肝癌新發(fā)病例78.25萬，死亡病例74.55萬，男性肝癌發(fā)病率在各種癌癥中居第5位，女性居第9位，死亡率男性居第2位，女性居第6位[1]。我國是肝癌高發(fā)國家，肝癌發(fā)病率為28.71/10萬，死亡率為26.04/10萬，分別位居所有惡性腫瘤的第4位和第2位[2]。目前肝癌常用的治療方法包括手術(shù)(肝切除術(shù)、肝移植和姑息治療手術(shù))及非手術(shù)治療，如肝動脈化療栓塞、射頻消融、化療、放療、生物治療、靶向治療及中醫(yī)藥治療等。由于肝癌起病隱襲，進展迅速，大多數(shù)患者就診時已達局部晚期或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，因此治療難度大，臨床療效有限，急需尋求突破。中醫(yī)中藥在晚期肝癌的綜合治療中發(fā)揮著重要作用，近年來有關(guān)中藥制劑的抗腫瘤研究已成為肝癌治療研究中的熱點之一。欖香烯(Elemene)是從我國傳統(tǒng)中藥姜科植物溫郁金(溫莪術(shù))中提取的萜烯類化合物，主要成分為β-欖香烯，具有廣譜、高效、低毒等特點，臨床已廣泛運用于多種惡性腫瘤的綜合治療中。本文就近年來欖香烯治療原發(fā)性肝癌的機制研究作一綜述。

1　抑制肝癌細胞增殖，誘導肝癌細胞凋亡

肝癌細胞增殖旺盛、凋亡減少，增殖和凋亡的失衡是導致肝癌迅速進展的重要機制之一。因此，觀察欖香烯能否有效抑制肝癌細胞增殖并誘導凋亡，是評估欖香烯對肝癌治療效果的重要指標之一。

通過MTT法檢測，可觀察到欖香烯對人肝癌HepG2、SMMC7721、H22、BEL-7402、小鼠BNL等多種肝癌細胞具有增殖抑制作用，多呈劑量和時間依賴性；通過TUNEL法檢測、Annexin V-FITC/PI雙染法及應(yīng)用熒光顯微鏡觀察、流式細胞儀分析，可見肝癌細胞經(jīng)欖香烯處理后出現(xiàn)典型凋亡特征，部分亦呈濃度依賴[3-9]。進一步實驗提示欖香烯抗肝癌細胞的作用可能與上調(diào)Caspase-3、Caspase-8、Fas、FasL，下調(diào)NF-κB、P65、P53、bcl-2、TRAF6等細胞凋亡相關(guān)基因的表達相關(guān)[6，8，10-11]。

細胞凋亡是受多種因素觸發(fā)后、由多種基因調(diào)控下所發(fā)生的細胞主動死亡的過程。細胞凋亡的機制相當復雜，涉及多種促細胞凋亡基因異常失活以及抑制細胞凋亡的基因異常激活、高度表達。其中Caspase、Fas/FasL、NF-κB、P53、Bcl-2等基因均被認為與細胞凋亡具有密切關(guān)系，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起了較為重要的作用[12]。根據(jù)以上體外實驗結(jié)果，提示欖香烯可以干擾肝癌細胞自主增殖并誘導凋亡，作用顯著。

以H22肝癌細胞株小鼠皮下腫瘤模型進行研究，欖香烯單藥注射或聯(lián)合化療藥物如5-FU、順鉑等均能夠獲得明顯的抑瘤效果，并且在生活質(zhì)量方面優(yōu)于單純化療組[7，11]。戚曉軍等[13]通過構(gòu)建兔VX2肝癌模型，觀察欖香烯單藥灌注及聯(lián)合碘油栓塞的療效，發(fā)現(xiàn)欖香烯聯(lián)合碘油組比單純碘油栓塞組的凋亡指數(shù)上升，增殖指數(shù)下降，具有協(xié)同作用。欖香烯輔助化療或介入治療能取得增效減毒的功效，為臨床欖香烯的聯(lián)合應(yīng)用提供了理論依據(jù)。此外，欖香烯單藥抗腫瘤作用顯著，為部分體質(zhì)虛弱、不能耐受化療或介入化療的晚期肝癌患者提供了新的治療選擇。

2　阻斷細胞周期

正常細胞周期是指連續(xù)分裂細胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個過程，是細胞生命活動的基本過程之一。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞周期調(diào)控的異常有著密切的關(guān)系。阻斷細胞周期，可有效抑制腫瘤增殖。

Gong等[14]研究發(fā)現(xiàn)欖香烯可阻滯HepG2細胞于S期，誘導細胞凋亡，呈時間和劑量依賴性，其機制可能與下調(diào)拓撲異構(gòu)酶Ⅰ、拓撲異構(gòu)酶Ⅱ表達及抑制其活性有關(guān)。也有研究表明，經(jīng)不同濃度欖香烯作用后的HepG2細胞可出現(xiàn)微管網(wǎng)絡(luò)異常，α微管蛋白mRNA及蛋白的表達、細胞內(nèi)聚合微管蛋白的表達均受抑制，HepG2細胞阻滯于S期的比例明顯增加[15]。微管系統(tǒng)對細胞分裂、細胞形態(tài)維持、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導等起著重要作用，通過干擾微管的聚合或解聚、破壞其動態(tài)平衡、阻斷腫瘤細胞分裂，能有效達到抑瘤效果。

近年來，隨著計算機、放射治療和影像技術(shù)的進展，放射性肝臟疾病等肝區(qū)放療相關(guān)的不良反應(yīng)已逐漸得到改善，放療已越來越多的應(yīng)用于肝癌患者。由于肝臟對放療的敏感性不高，因此研究放射増敏也是較熱門的課題。楊道科等[16]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)10，100，1 000 nmol/L等不同濃度的欖香烯作用于經(jīng)直線加速器照射過的人肝癌細胞后，均具有放射増敏作用，流式細胞儀檢測提示欖香烯對細胞的S期、G2/M期有阻滯作用，以G2/M期明顯。100，1 000 nmol/L欖香烯作用24 h后，G2/M期比率明顯升高，其中100 nmol/L欖香烯作用24 h對人肝癌細胞的放射増敏作用最大。提示因治療方式或治療劑量的不同，欖香烯對細胞周期的阻滯作用亦不同。

3　降低腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移

肝癌惡性程度高，易侵襲和轉(zhuǎn)移，迅速惡化，難以治愈，其侵襲和轉(zhuǎn)移的機制與癌基因調(diào)控、降解細胞外基質(zhì)、黏附力下降、逃避宿主免疫監(jiān)視等多種因素有關(guān)。其中，癌細胞對細胞外基質(zhì)和血管基底膜的降解是首要步驟，起著重要作用，而蛋白酶類在其中扮演著重要角色，其中以基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)最為重要。經(jīng)欖香烯處理過的人肝癌SK-hep-1細胞，MMP-2 mRNA表達明顯減弱、穿膜細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯減少[17]。欖香烯干預人肝癌細胞HepG-2之后產(chǎn)生類似的效果，可降低細胞黏附能力，減少侵襲和遷移細胞數(shù)目，下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達[18]。由此可見，欖香烯能降低肝癌細胞的侵襲、遷移能力，下調(diào)MMPs的表達可能是其機制之一。

4　抑制腫瘤血管生成

肝癌是典型的富血管腫瘤，其生長和轉(zhuǎn)移依賴腫瘤血管生成，肝癌組織內(nèi)的血管化程度與其惡性程度相關(guān)?？鼓[瘤血管生成治療是21世紀以來迅速發(fā)展的腫瘤治療方法，在肝癌治療領(lǐng)域已取得矚目的成效。有關(guān)中藥提取物抗肝癌血管生成治療的研究也已經(jīng)廣泛開展。

實體腫瘤初期階段都處于無血管期，而一旦完成血管化可使腫瘤快速生長，其中新生血管的生成是關(guān)鍵步驟。循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(circulating endothelial progenitors，CEPs)由骨髓中的內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)衍生，經(jīng)相關(guān)因子如VEGF等動員后進入外周血液循環(huán)并進一步分化，之后遷移至血管生長正在發(fā)生的部位，并分化成為成熟的內(nèi)皮細胞[19]。EPCs或CEPs分化為內(nèi)皮細胞是血管新生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究報道，Notch信號通路的活化參與了EPCs的分化，而欖香烯對Notch信號通路具有明顯的抑制作用，進而推測，欖香烯可能會通過抑制EPCs分化為內(nèi)皮細胞進而抑制腫瘤血管生成[20]。欖香烯亦可直接抑制血管內(nèi)皮細胞，進而抑制血管生成[21-22]。Jiang等[23]研究欖香烯和恩度聯(lián)合對H22惡性腹水模型小鼠的抗血管生成作用，發(fā)現(xiàn)欖香烯單藥即可減少腹水生成量，抑制腫瘤細胞生長，降低腹膜微血管通透性，下調(diào)VEGF的表達，聯(lián)合恩度后產(chǎn)生協(xié)同增效的作用。陳翼等[24]通過比較經(jīng)皮瘤內(nèi)注射無水乙醇及聯(lián)合欖香烯靜脈給藥治療兔移植性VX2肝腫瘤的療效，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組可以明顯促進腫瘤細胞凋亡，下調(diào)VEGF的表達，抑制肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。由此可見，欖香烯單藥具有抗腫瘤血管生成的作用，與抗血管生成藥物聯(lián)合則可增強療效。

5　調(diào)節(jié)免疫功能

機體的免疫狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，免疫防御功能減退和免疫監(jiān)視功能低下、發(fā)生免疫逃逸等均是腫瘤發(fā)生的相關(guān)因素。免疫治療是腫瘤綜合治療的重要組成部分，腫瘤免疫治療一方面可以激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，主動清除腫瘤細胞，一方面能增強腫瘤細胞免疫原性，利于被機體識別。目前已有較多研究報道欖香烯的抗腫瘤免疫功能。

欖香烯可以增強小鼠巨噬細胞和樹突狀細胞表面MHC分子和免疫共刺激因子表達，利于發(fā)揮巨噬細胞和樹突狀細胞抗原提呈和激活T細胞的能力，同時還能促進巨噬細胞的吞噬能力[25-26]。欖香烯可以提高H22肝癌移植瘤小鼠的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，促進T淋巴細胞的生成，能提高小鼠IL-2的活性，促進機體的抗腫瘤細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而提高了機體的免疫能力[10]。欖香烯可明顯恢復H22荷瘤小鼠因化療所引起的免疫抑制，聯(lián)合化療能協(xié)同增效減毒[27]。欖香烯還可以改變肝癌細胞的基因表達譜，增強腫瘤細胞的免疫原性，以利于腫瘤細胞被機體識別[28]。此外，欖香烯可以聯(lián)合疫苗或處理制備復合疫苗，激發(fā)機體免疫應(yīng)答?；跇渫粻罴毎?DC)的腫瘤疫苗是研究熱點之一，原因在于DC是體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞，與腫瘤免疫逃逸(即腫瘤細胞不能被機體有效識別而逃脫宿主免疫應(yīng)答的現(xiàn)象)關(guān)系密切。研究顯示肝癌患者DC數(shù)量減少、功能缺陷，肝癌細胞能抑制DC的遷移能力和內(nèi)吞能力[29-30]。倪菲菲等[31]發(fā)現(xiàn)欖香烯可刺激小鼠脾細胞分泌IFN-γ，欖香烯聯(lián)合DC/DRibble疫苗(小鼠脾臟來源DC和肝癌細胞BNL來源自噬小體制備而成)后IFN-γ分泌量明顯高于欖香烯及疫苗組，并且聯(lián)合組可明顯延緩小鼠肝癌移植瘤的生長速度、延長小鼠生存期，分析考慮可能與欖香烯刺激機體分泌細胞因子、增強樹突狀細胞抗原提呈功能等有關(guān)。高天慧等[32]制備欖香烯修飾抗原脂質(zhì)體疫苗，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體共包裹欖香烯與H22抗原的制劑與不含欖香烯的制劑相比，可延長荷瘤小鼠的生存期，增強小鼠淋巴細胞對H22肝癌細胞的殺傷作用，提高脂質(zhì)體瘤苗的抗肝癌免疫效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，通過欖香烯和新城疫病毒對H22肝癌細胞可溶性抗原( NDV-H22抗原)脂質(zhì)體瘤苗的進一步修飾，將脂質(zhì)體包裹后產(chǎn)生的抗原提呈作用、NDV的抗原異源化作用以及欖香烯的免疫增強作用三者有效結(jié)合，與單純欖香烯包裹或單純NDV-H22抗原包裹的脂質(zhì)體瘤苗相比，進一步增強腫瘤抗原的免疫原性，產(chǎn)生協(xié)同增效作用[33]。此外，還有研究顯示欖香烯復合瘤苗腹腔免疫后可激活腹腔巨噬細胞對肝癌HCa-F細胞的細胞毒活性，有效發(fā)揮免疫功能[34]。由此可見，欖香烯可通過多種途徑調(diào)節(jié)機體的免疫功能，對免疫系統(tǒng)起到保護和促進的作用。

6　結(jié)　　語

欖香烯作為成功上市的國家二類非細胞毒性抗腫瘤藥物，近二十多年來已有大量研究結(jié)果報道，能多途徑、多靶點對多種腫瘤細胞產(chǎn)生顯著的抑制作用并誘導凋亡，阻斷細胞周期，降低腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，抑制腫瘤血管生成，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥，調(diào)節(jié)機體免疫功能等，輔助放化療時能增效減毒，療效得到臨床肯定。2011年《原發(fā)性肝癌的診療規(guī)范》中明確提出欖香烯可以用于治療肝癌。然而，目前有關(guān)欖香烯治療肝癌的機制仍不十分清楚，目前所能獲得的研究成果還很淺顯，相信未來隨著科技水平的發(fā)展和欖香烯在臨床的應(yīng)用推廣，其抗腫瘤作用的研究將會不斷深入，而機制將會更加清晰。

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2016-02-22