豬乙型腦炎痘苗和檢測技術(shù)研究進(jìn)展

王家濤　崔克

摘要：豬乙型腦炎是一種人獸共患的病毒性傳染病，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。文章對豬乙型腦炎疫苗和檢測技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為預(yù)防和檢測該病提供參考。

關(guān)鍵詞：豬乙型腦炎；疫苗；檢測技術(shù)

豬乙型腦炎又稱日本乙型腦炎，由黃病毒科黃病毒屬乙型腦炎病毒引起，是一種急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)人獸共患傳染病，國際獸醫(yī)局將該病列為B類傳染病。該病不僅危害集約化養(yǎng)豬業(yè)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也影響人類健康，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全。目前尚無有效的治療方法，強(qiáng)化檢測技術(shù)和疫苗質(zhì)量的提高是控制該病的有效手段，現(xiàn)將豬乙型腦炎疫苗和檢測技術(shù)的研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述。

1 疫苗研究進(jìn)展

1.1 常規(guī)疫苗

目前，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中用于預(yù)防豬乙型腦炎的常規(guī)疫苗有滅活苗和減毒活疫苗，其中滅活苗由北農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所采用豬乙型腦炎強(qiáng)毒株WH-1株研制成功，并于1996年獲準(zhǔn)投入市場，該疫苗接種各類豬群后無應(yīng)激反應(yīng)、胎內(nèi)感染及病毒血癥，安全性好，保護(hù)率高，但是存在免疫保護(hù)期短、免疫劑量大等不足之處。減毒活疫苗也由湖北農(nóng)業(yè)院畜牧獸醫(yī)研究所研發(fā)，其使用SA14-14-2毒株，經(jīng)接種地鼠腎原代細(xì)胞增殖，將病毒液凍干制成。研究表明，病毒活疫苗安全性高、免疫原性好，特別是對后備母豬及初產(chǎn)母豬可產(chǎn)生高效的細(xì)胞免疫和體液免疫。缺點(diǎn)在于可能出現(xiàn)毒力返強(qiáng)，存在潛在的致病危險(xiǎn)，同時(shí)地鼠腎原代細(xì)胞未通過WHO認(rèn)證，這嚴(yán)重影響了疫苗的應(yīng)用范圍。

1.2 基因工程疫苗

隨著分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)、基因工程學(xué)等生物技術(shù)的發(fā)展，科研人員對豬乙型腦炎基因工程疫苗進(jìn)行了大量的研究，取得一系列成果。

近年來，科研人員采用反向遺傳學(xué)基因工程技術(shù)構(gòu)建嵌合病毒作為防治豬乙型腦炎的新型疫苗，即：重組嵌合病毒疫苗。如將豬乙型腦炎病毒的E基因替換豬瘟病毒的E基因，構(gòu)建豬乙型腦炎-豬瘟嵌合病毒，免疫小鼠及豬后，均產(chǎn)生了乙型腦炎病毒特異性抗體。將豬乙型腦炎病毒的prM和E基因代替黃熱病毒的同種基因，構(gòu)建乙型腦炎-黃熱嵌合病毒，實(shí)驗(yàn)證明，具有較高的安全性和特異性抗體水平，免疫抗體轉(zhuǎn)陽率達(dá)99.1%，并且已在澳大利亞注冊成功。同時(shí)，構(gòu)建成功的含有豬乙型腦炎病毒prM或E基因的重組痘苗病毒，免疫小鼠和豬后也可防護(hù)豬乙型病毒的攻擊。

核酸疫苗作為另一類基因工程疫苗也取得了大量的研究成果。目前的研究主要集中在豬乙型腦炎病毒的prM、E和NS1基因上，Ashok NS等證實(shí)了含有E基因的核酸疫苗保護(hù)作用有限，僅刺激抗體產(chǎn)生低水平的細(xì)胞免疫，而含部分E基因的核酸疫苗則在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較高的中和抗體水平和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對其保護(hù)率可達(dá)71%。Konishi等證實(shí)采用含有豬乙型腦炎前膜信號(hào)肽（s）prM、E基因的核酸疫苗免疫小鼠后，保護(hù)率可達(dá)100%，免疫持續(xù)期為6個(gè)月。隨后其又證實(shí)了含有prM和E基因的核酸疫苗免疫動(dòng)物后，不僅刺激抗體產(chǎn)生特異性CTL細(xì)胞參與細(xì)胞免疫，還產(chǎn)生B細(xì)胞參與體液免疫。對于含有NS1基因的核酸疫苗，Lin等證明了雖在小鼠體內(nèi)未檢測到中和抗體，但存在很強(qiáng)的補(bǔ)體反應(yīng)，可促小鼠獲得90%的保護(hù)，但是含NS1基因的核酸疫苗的免疫效果與采用的表達(dá)系統(tǒng)和其序列有關(guān)。雖然豬乙型腦炎病毒核酸疫苗的研究取得了顯著的成果，但是其安全性、免疫途徑等因素仍需進(jìn)一步論證，現(xiàn)仍處在實(shí)驗(yàn)室研究階段。

另一類豬乙型腦炎病毒新型疫苗為亞單位疫苗，XuXG等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的豬乙型腦炎E蛋白，免疫小鼠和豬，在動(dòng)物體內(nèi)檢測到特異性中和抗體。我國的曹瑞兵等構(gòu)建了表達(dá)豬乙型腦炎病毒多表位抗原的病毒樣顆粒疫苗，證實(shí)疫苗在小鼠身上與豬乙型腦炎弱毒疫苗的免疫效果相近。但是目前為止，亞單位疫苗也是仍處于實(shí)驗(yàn)階段。

2 檢測技術(shù)研究進(jìn)展

隨著對豬乙型腦炎研究的深入，其檢測技術(shù)有了很大的進(jìn)展。

2.1 血清學(xué)檢測技術(shù)

目前常用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)。其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)作為一種敏感、特異、穩(wěn)定的檢測技術(shù)在豬乙型腦炎的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。沈婷等建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，用于檢測豬乙型腦炎病毒抗體，與同類方法比較，吻合率達(dá)95.6%，且具有較高的敏感性與特異性，并對江蘇等4省開展了1089份樣的血清流行病毒調(diào)查，獲得了較好的效果。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對診斷豬乙型腦炎有較高的特異性，但因補(bǔ)體結(jié)合抗體在動(dòng)物發(fā)病后兩周才出現(xiàn)，故該法也只能作為回顧診斷用。血凝抑制試驗(yàn)可以檢測豬乙型腦炎病毒IgM和IgG抗體，敏感性強(qiáng)，操作簡單，是常用的豬乙型腦炎流行病學(xué)和臨床診斷方法。而賈杏林等建立的豬乙型腦炎乳膠凝集試驗(yàn)，與血凝抑制試驗(yàn)相比，對同一組樣品的檢測結(jié)果差異不顯著（P>0.05），且具有快速、易于判斷、不需特殊儀器的優(yōu)點(diǎn)，適合基層單位推廣使用。宋大偉等建立的豬乙型腦炎協(xié)同凝集試驗(yàn)，產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象肉眼可以判斷，與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比，簡單、快捷、敏感性高、特異性強(qiáng)，也適合基層單位推廣使用。王吉等建立的免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果表明，靈敏度是乳膠凝集試驗(yàn)的8倍，可用于豬乙型腦炎的確診，但是由于其操作繁瑣，血清中的非特異性吸附等因素，限制了診斷方法的應(yīng)用。

2.2 病原學(xué)檢測技術(shù)

最常用的豬乙型腦炎病原學(xué)檢測技術(shù)有病毒分離鑒定和分子生物學(xué)檢測技術(shù)，病毒分離鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，可以獲得病毒株，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合豬乙型腦炎的快速檢測。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，豬乙型腦炎病毒分子生物學(xué)檢測技術(shù)取得了很多研究成果，高正琴根據(jù)豬乙型腦炎病毒C基因序列，建立了反轉(zhuǎn)錄——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法，崔奕杰等根據(jù)豬乙型腦炎病毒E基因序列也建立了RT-PCR方法，結(jié)果表明，敏感性高、特異性強(qiáng)，均得到很好的檢測效果。蔡緒禹等根據(jù)Gen-Bank公布的豬乙型腦炎病毒等5種人獸共患腦炎病毒的基因序列，建立了可同時(shí)檢測5種病毒的多重RT-PCR方法，而何玢等建立了與豬乙型腦炎病毒相關(guān)的8種蟲媒病毒的多重RT-PCR方法，結(jié)果表明，這些方法具高通量、簡便、快速、靈敏、特異，對豬乙型腦炎等病毒性腦炎的分子診斷有重要意義。近年來出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法是對PCR方法的發(fā)展與延伸，比PCR方法更加敏感、特異，同時(shí)可定量檢測，該方法又可分為TaqMan熒光探針法和SYBR熒光染料法。黃福新等根據(jù)豬乙型腦炎病毒NS3基因序列，建立了TaqMan熒光探針法RT-PCR，研究表明，可檢測100μg/μL的病毒，且時(shí)間僅需3h，可用于豬乙型腦炎的實(shí)驗(yàn)室快速檢測。同時(shí)，陳志永等建立了SYBR熒光染料法RT-PCR，結(jié)果表明，是一種敏感、特異、快速的豬乙型腦炎檢測方法。

3 結(jié)語與展望

豬乙型腦炎作為重要的人獸共患病，對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全有巨大的威脅。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對豬乙型腦炎疫苗生產(chǎn)工藝、純化工藝不斷完善，積極開發(fā)基因工程新型疫苗，同時(shí)對各種檢測方法不斷優(yōu)化，相信一定會(huì)出現(xiàn)安全、有效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的疫苗和快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的檢測技術(shù)，建立完善豬乙型腦炎的預(yù)防和檢測體系及策略，為該病的防治提供科學(xué)支持，確保畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生的安全。

（編輯：趙曉松）