張登梅　年四季　葉迎春　楊　燕　于　紅　袁　青

(四川醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,瀘州646000)

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抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選、可溶性表達(dá)及鑒定①

張登梅年四季葉迎春楊燕于紅袁青

(四川醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,瀘州646000)

[摘要]目的：篩選特異性好、有體外中和特性的抗IL-13單鏈抗體，并進(jìn)行可溶性表達(dá)和鑒定。方法：前期課題組構(gòu)建了大庫(kù)容量天然單鏈抗體文庫(kù)，本研究采用噬菌體展示技術(shù)對(duì)天然抗體文庫(kù)進(jìn)行3輪富集，然后從3輪富集后的文庫(kù)中采用ELISA進(jìn)行篩選抗IL-13 陽(yáng)性單鏈抗體；將特異性好、親和力相對(duì)較高的陽(yáng)性單鏈抗體轉(zhuǎn)入表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)并鑒定。結(jié)果：經(jīng)3輪噬菌體展示富集，有30%左右的克隆子為陽(yáng)性；經(jīng)過(guò)約500株克隆子篩選，篩選到2株特異性和親和力相對(duì)較高，有體外中和特性的單鏈抗體；將篩選的單鏈抗體基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體LZ16 中進(jìn)行了表達(dá)，并采用生物大分子相互作用技術(shù)、Western blot等進(jìn)行了鑒定。結(jié)論：成功篩選到特異性好、親和力相對(duì)較高并具有體外中和活性的抗IL-13單鏈抗體。

白細(xì)胞介素在嗜酸性和非嗜酸性哮喘中扮演著重要的角色，其中白細(xì)胞介素-13(IL-13)是一個(gè)密切相關(guān)的細(xì)胞因子，它是由肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌，最重要的是Th2細(xì)胞分泌。IL-13是參與Th2細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥中一個(gè)關(guān)鍵性的細(xì)胞因子[1]，其誘導(dǎo) B 細(xì)胞增殖和分化、促進(jìn) IgE 合成、活化嗜酸性粒細(xì)胞、延長(zhǎng)嗜酸性粒細(xì)胞的存活、增加黏液分泌、引起氣道高反應(yīng)(Airway hyperresponsiveness,AHR)和上皮細(xì)胞纖維化等，在哮喘的發(fā)生中起重要的作用[2，3]。IL-4/IL-13通過(guò)激活I(lǐng)L-4Rα，IL-13Rα1組成的異二聚體受體復(fù)合物，分享共同的受體機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)揮不同的生物學(xué)作用[4]，尤其在Th2細(xì)胞介導(dǎo)的相關(guān)過(guò)敏性疾病如支氣管哮喘中發(fā)揮重要的作用。本研究欲從前期構(gòu)建的天然全人源抗體文庫(kù)中篩選特異性好的抗IL-13單鏈抗體，為后期構(gòu)建抗IL-4、IL-13雙特異性抗體奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為研制治療過(guò)敏性哮喘的抗體藥物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料pET101、Ni-NTA 親和層析純化系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen 公司；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量為T(mén)aKaRa 公司的1 000 bp； 蛋 白 Marker 為T(mén)aKaRa 公司的低分子量蛋白 Marker。pCANTAB-5E、大腸桿菌 TG1、輔助噬菌體 M13K07均購(gòu)自 Gene 公司；抗 M13 HRP標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)自 Amersham Biosciences公司；Anti-FLAG HRP 標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)自sigma公司；IL-13Rα1購(gòu)自sino biological公司。

1.2方法

1.2.1抗 IL-13全人源單鏈抗體的篩選 本研究前期構(gòu)建了天然全人源scFv文庫(kù)，文庫(kù)容量達(dá)到了1.2×108，多樣性良好。以生物素化的人IL-13蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術(shù)對(duì)全人源scFv文庫(kù)進(jìn)行了3輪富集，隨機(jī)挑取3輪富集后的文庫(kù)克隆子進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，具體方法參見(jiàn)[5]，擴(kuò)增后的噬菌體抗體用于ELISA 檢測(cè)。即包被液(50 mmol/L NaHCO3/Na2CO3，pH9.6) 稀釋人IL-13 蛋白至30 μg/ml，包被稀釋的抗原于酶標(biāo)板內(nèi)4℃過(guò)夜，次日洗滌酶標(biāo)板后，用封閉液37℃封閉1 h，加入擴(kuò)增后的噬菌體抗體孵育，用二抗anti-M13-HRP標(biāo)記單克隆抗體和底物TMB進(jìn)行顯色(15~30 min)，在OD450讀數(shù)。

1.2.2篩選的單鏈抗體特性分析指紋圖譜分析：將ELISA陽(yáng)性的單鏈抗體克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用BstN I酶切檢測(cè)篩選的陽(yáng)性單鏈抗體序列的多樣性。

特異性：將篩選的OD450相對(duì)較高的單鏈抗體采用ELISA進(jìn)行特異性分析。分別包被30 μg/ml人IL-13、人IL-4、人TSLP于酶標(biāo)板上，封閉后加入噬菌體抗體孵育后，加入二抗anti-M13-HRP標(biāo)記單克隆抗體和底物TMB進(jìn)行顯色(15~30 min)，在OD450讀數(shù)。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA：篩選特異性較好的單鏈抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)人IL-13受體(IL-13Rα1)和人IL-13、抗IL-13 scFvs和人IL-13結(jié)合是否為同一抗原表位，從而判斷抗IL-13 scFvs是否能封阻IL-13 與IL-13Rα1的結(jié)合。包被30 μg/ml IL-13 純化蛋白于酶標(biāo)板內(nèi)4℃過(guò)夜，封閉液封閉酶標(biāo)孔后，加入1∶1比例的噬菌體抗體和IL-13Rα1(分別用1、2 μg/ml)，用1∶1比例噬菌體抗體和PBS混合物作為對(duì)照，37℃濕溫孵育1 h后，洗滌后加入 HRP 標(biāo)記抗 M13 單克隆抗體，37℃濕溫孵育 1 h，用TMB 顯色液顯色(15~30 min)，在OD450讀數(shù)。

1.2.3單鏈抗體基因中琥珀終止密碼子的校對(duì)對(duì)篩選的2個(gè)特異性和體外中和效果較好的陽(yáng)性單鏈抗體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示在單鏈抗體第32位氨基酸處出現(xiàn)了琥珀終止密碼子。由于在E.coli TG1中，琥珀終止密碼子可以部分被抑制，所以在pCANTAB 5E載體體系中篩選的帶有琥珀終止密碼子的單鏈抗體會(huì)被通讀而表達(dá)，從而ELISA結(jié)果為陽(yáng)性結(jié)果。將琥珀終止密碼子進(jìn)行單點(diǎn)突變，終止密碼子突變?yōu)榘被酺rp (W)。

1.2.4單鏈抗體基因的可溶性表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室將PUC質(zhì)粒進(jìn)行改進(jìn)用于單鏈抗體表達(dá)，載體(LZ16)中引入了FLAG和His-tag標(biāo)簽，表達(dá)于單鏈抗體的C端，便于單鏈抗體的純化和檢測(cè)。將琥珀終止密碼子校對(duì)后的單鏈抗體基因進(jìn)行酶切后與LZ16連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5αF′中。測(cè)序驗(yàn)證插入基因正確后，于LBAG (LB培養(yǎng)基含100 μg/ml 氨芐青霉素和2%葡萄糖)37℃培養(yǎng)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌于OD600為0.6，離心后用LBA(LB培養(yǎng)基含100 μg/ml 氨芐青霉素)重懸沉淀，加入終濃度 1 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h，收集沉淀，超聲破碎細(xì)菌后，離心收集上清液用于單鏈抗體的純化和鑒定。

1.2.5單鏈抗體的鑒定Western blot:SDS-PAGE 電泳表達(dá)的單鏈抗體蛋白，電轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉液封閉后，加入HRP標(biāo)記抗FLAG抗體(1∶5 000稀釋)，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)表達(dá)的單鏈抗體蛋白。大分子相互作用技術(shù)：將人IL-13蛋白生物素化后固定于SA sensor上，加入純化的不同濃度的抗IL-13單鏈抗體，BLITZ儀器檢測(cè)抗原抗體的相互作用，計(jì)算抗IL-13單鏈抗體的親和力。

2結(jié)果

2.1抗 IL-13全人源單鏈抗體的篩選 以人IL-13蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術(shù)將天然抗體文庫(kù)進(jìn)行了3輪富集，隨機(jī)挑取經(jīng)3輪富集展示的單克隆子進(jìn)行小量表達(dá)后，ELISA鑒定表達(dá)的單鏈抗體與人IL-13是否結(jié)合。結(jié)果顯示：30%左右的克隆子ELISA結(jié)果為陽(yáng)性，可與人IL-13有良好的結(jié)合作用(圖1)。

2.2篩選的單鏈抗體特性分析將篩選的陽(yáng)性單鏈抗體進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，BstN I 酶切后顯示挑取的16個(gè)單克隆子中大部分單鏈抗體序列是不相同的，具有一定的多樣性(圖2)。將序列不相同的單鏈抗體進(jìn)行小量表達(dá)后進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA，結(jié)果顯示有2株單鏈抗體可與IL13Rα1競(jìng)爭(zhēng)性地與IL-13結(jié)合，說(shuō)明單鏈抗體和IL-13、IL13Rα1和IL-13結(jié)合的抗原表位是相同的，表明篩選的2株單鏈抗體具有體外中和特性(圖3)。分析具有體外中和特性的2株單鏈抗體的特異性，結(jié)果這2株單鏈抗體顯示了良好的特異性(圖4)。

圖1　ELISA 檢測(cè) 經(jīng)三輪富集后文庫(kù)單鏈抗體與人IL-13的結(jié)合作用Fig.1　Test binding of IL-13 and scFvs from antibody library enriched for three rounds by ELISA

圖2　指紋圖譜分析篩選的陽(yáng)性單鏈抗體序列的多樣性Fig.2　Analysis the diversity of sequence of positive scFvs by fingerprint

圖3　競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)抗IL-13 scFv、 IL-13 Rα1競(jìng)爭(zhēng)性地與人IL-13的結(jié)合Fig.3　Detection of IL-13 scFv and IL-13 Rα1 competitive binding to human IL-13 by competitive ELISA

圖4　ELISA檢測(cè)抗IL-13單鏈抗體的特異性Fig.4　Detection of the specificity of scFvs against IL-13 by ELISANote：The proteins of human IL-13，IL4，TSLP were coated on the wells of ELISA plates and the scFv1，scFv2 against IL-13 were added.

2.3單鏈抗體基因的可溶性表達(dá)對(duì)特異性好，并

圖5　SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)純化的scFv1和scFv2Fig.5　Detection of purified scFv1 and scFv2 by SDS-PAGE and Westrn blotNote: M.BenchMarkTMpre-stained protein ladder(Invitrogen);A.SDS-PAGE detection of purified scFv1 and scFv2;B.Westem blot detection of the expressed scFv1 and scFv2.

圖6　生物大分子相互作用技術(shù)(BLITZ)檢測(cè)scFv1 和scFv2的親和力Fig.6　Biomolecular interaction analysis (BLITZ) detection of the affinity of scFv1 and scFv2Note: A.scFv1; B. scFv2.

具有體外中和特性的2株單鏈抗體進(jìn)行了序列測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第32位氨基酸處出現(xiàn)了琥珀終止密碼子，分析2株單鏈抗體序列，只有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)不相同。在噬菌體展示技術(shù)對(duì)抗體文庫(kù)篩選的過(guò)程中，可能由于表達(dá)的外源基因?qū)λ拗鞯亩拘宰饔?，?dǎo)致部分篩選的單鏈抗體發(fā)生突變而帶有琥珀終止密碼子，而在E.coli TG1中，琥珀終止密碼子可以部分被抑制，所以在pCANTAB 5E載體篩選體系中帶有琥珀終止密碼子的單鏈抗體會(huì)被通讀而表達(dá)，從而ELISA結(jié)果為陽(yáng)性。

采用單點(diǎn)突變的方法將琥珀終止密碼子進(jìn)行校正，校正后的氨基酸為W。將校正后單鏈抗體轉(zhuǎn)入表達(dá)載體LZ16中進(jìn)行可溶性表達(dá)并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，結(jié)果顯示，在26 kD處出現(xiàn)了目的條帶(圖5A)。由于是將表達(dá)的細(xì)菌進(jìn)行全菌超聲破碎，然后離心收集上清采用Ni-NTA親和樹(shù)脂進(jìn)行純化，Ni-NTA 對(duì)細(xì)菌的一些蛋白可能會(huì)有非特異性結(jié)合，所以導(dǎo)致純化出現(xiàn)了非特異性的條帶。為了驗(yàn)證在26 kD出現(xiàn)的條帶即為抗IL-13單鏈抗體條帶，采用Western blot 對(duì)表達(dá)的單鏈抗體進(jìn)行了鑒定，由于表達(dá)載體上設(shè)計(jì)有His-tag和FLAG標(biāo)簽，進(jìn)行Western blot 時(shí)用的是anti-FLAG HRP標(biāo)記的抗體，結(jié)果顯示，在26 kD處有單一條帶產(chǎn)生，說(shuō)明表達(dá)純化的單鏈抗體正確(圖5B)。

2.4抗IL-13單鏈抗體親和力采用生物大分子相互作用技術(shù)(BLITZ)對(duì)表達(dá)純化的scFv1 和 scFv2進(jìn)行了系列稀釋?zhuān)c固定在SA sensor上的人IL-13蛋白相互作用，圖6顯示純化的單鏈抗體與人IL-13可良好的結(jié)合，由于這兩株單鏈抗體氨基酸序列只有3個(gè)不相同，計(jì)算其親和力，其親和力相差不大，scFv1 為6.073×10-7，scFv2 為2.267×10-7(圖6)。

3討論

IL-13是一種多效的Th2型細(xì)胞因子，通過(guò)刺激杯狀細(xì)胞分化、上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏液，激活成纖維細(xì)胞，引起氣道高反應(yīng)[6,7]。在哮喘的小鼠模型中，已經(jīng)證明 IL-13基因的過(guò)度表達(dá)會(huì)引起氣道炎癥、增加黏液分泌、上皮細(xì)胞纖維化、產(chǎn)生趨化因子[1]?？笽L-13單克隆抗體藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但也只針對(duì)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥或血液嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘有效[4,8-10]。有研究顯示：在局部過(guò)敏原刺激的鼻腔中，阻斷性抗IL-13單克隆抗體能夠抑制IL-13分泌，但沒(méi)有顯著減少嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)或減輕鼻部癥狀[11]。通過(guò)深入研究IL-13在哮喘等過(guò)敏性炎癥疾病中的信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)IL-13主要通過(guò)結(jié)合IL-13Rα1/IL-4Rα異二聚體發(fā)揮作用，IL-13Rα1/IL-4Rα能夠同時(shí)結(jié)合IL-13、IL-4進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)[12]。因此，能夠同時(shí)封阻IL-4與IL-13的信號(hào)通路，制備雙特異性全人源抗體為過(guò)敏性炎癥提供更好的療效。

從天然全人源抗體文庫(kù)中篩選出的單鏈抗體一般親和力比較低，通過(guò)本研究從前期構(gòu)建的天然全人源抗體文庫(kù)中篩選出了2株特異性較好并具有體外中和特性的抗IL-13單鏈抗體，其親和力為10~7左右。后期將對(duì)其親和力進(jìn)行進(jìn)一步進(jìn)化，為構(gòu)建全人源抗IL-4、IL-13雙特異性抗體奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-17]

(編輯許四平)

[關(guān)鍵詞]IL-13；全人源單鏈抗體；噬菌體展示

Selection,soluble expression and identification of full human scFvs against IL-13

ZHANGDeng-Mei,NIANSi-Ji,YEYing-Chun,YANGYan,YUHong,YUANQing.TheSchoolofBasicMedicalSciences,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000，China

[Abstract]Objective:To select specific and neutralizing scFv against IL-13 and soluble expression and identification them.Methods: In our previous study the scFv library were constructed,and here the scFv library was enriched and the positive scFv were screened from the enriched scFv library for three round.The specific positive scFvs with better affinity were ligated with expression vector for expression and identification.Results: After three rounds of enrichment,30% of clones were positive.The two specific scFvs with better affinity and neutralization were selected from almost 500 clones and then ligated with expression vector LZ16 for soluble expression.The expressed scFvs were identified by western blot and biomolecular interaction analysis.Conclusion: The specific scFvs against IL-13 with better affinity and neutralization had been selected successfully.

[Key words]IL-13;Human scFv;Phage display

通訊作者及指導(dǎo)教師：袁青(1978年-)，女，教授，主要從事重組抗體研究，E-mail:yuanqing_ok@hotmail.com。

作者簡(jiǎn)介：張登梅(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事分子免疫學(xué)研究。

中圖分類(lèi)號(hào)R392.11
①本文為四川省科技廳項(xiàng)目(2015JY0218,013SZZ005)和四川省教育廳項(xiàng)目(13ZB0262)。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)01-0065-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.014