董 潔 冀嬌嬌 王加利 袁 將 王貝貝 趙 爽 鄭尊善 劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102)

維吾爾族藥阿納其根中綠原酸的含量測(cè)定

董 潔 冀嬌嬌 王加利 袁 將 王貝貝 趙 爽 鄭尊善 劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102)

目的：建立測(cè)定維吾爾族藥阿納其根中綠原酸含量的高效液相色譜法(HPLC)。方法：色譜柱為Agilent 5 TC-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，以乙腈-0.4%磷酸水(13∶87，V/V)為流動(dòng)相，流速為0.8 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm。結(jié)果：綠原酸在質(zhì)量為0.0484 mg～0.968 mg范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程：Y=2296316.8X-1369.4(r=0.9999)，平均回收率為100.20%，RSD=2.75%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、靈敏、重現(xiàn)性好，可用于阿納其根中綠原酸的含量測(cè)定。

維藥；阿納其根；HPLC；綠原酸；含量測(cè)定

維吾爾族藥(簡(jiǎn)稱(chēng)維藥)作為民族藥之一，是中醫(yī)學(xué)寶庫(kù)的重要組成部分。維藥擁有數(shù)千年的用藥歷史，是維吾爾族人民在防病治病的過(guò)程中，積累了豐富的應(yīng)用植物、動(dòng)物、礦物防病與治病的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和生產(chǎn)技術(shù)，并逐漸形成了獨(dú)具維吾爾族文化特色的藥物學(xué)，具有博大精深的醫(yī)學(xué)理論體系。它和中醫(yī)、藏醫(yī)等民族醫(yī)藥學(xué)相比，有著其獨(dú)特的治病理念。近些年，因其獨(dú)特的療效和深厚的文化底蘊(yùn)引起越來(lái)越多的關(guān)注。但是，目前對(duì)于維藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究甚少，并且缺少明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這些都限制著維藥的進(jìn)一步發(fā)展。因此，建立科學(xué)合理的維藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)維藥現(xiàn)代化發(fā)展具有重要的意義。

阿納其根，據(jù)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊(cè)》[1]和《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]等記載，其系菊科Compositae植物羅馬除蟲(chóng)菊Anayccluspyerhturm.DC.干燥的根，維藥名：阿克爾開(kāi)爾哈，別名為阿吉而哈而哈、歐都里開(kāi)日合、比合臺(tái)爾混庫(kù)依。主要分布于北非或南部歐洲，我國(guó)新疆亦有分布。原植物羅馬除蟲(chóng)菊為多年生草本，高15～45 cm，多具長(zhǎng)柔毛，在春秋季采挖，洗凈，切斷，曬干[3]。其性味為三級(jí)末四級(jí)首干熱[3-4]，具有生干生熱，祛寒強(qiáng)筋，開(kāi)通阻滯，祛風(fēng)止痛，燥濕化痰，滋補(bǔ)神經(jīng)等功效；在維吾爾醫(yī)中，主要用于白癜風(fēng)、腫瘤、膝骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[4-7]，尤其是在治療白癜風(fēng)方面具有顯著的療效[8-9]。目前，對(duì)于阿納其根的化學(xué)成分研究甚少，并且含量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)阿納其根進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)分析的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)阿納其根甲醇提取物中含有綠原酸類(lèi)成分，而綠原酸又具有諸多生物活性，如抗氧化作用、抗癌作用、抗菌作用、抗病毒、保肝利膽、活血降壓等[10-16]，是目前天然產(chǎn)物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[10-13]，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)綠原酸的活性研究已深入到食品、醫(yī)藥、化妝品領(lǐng)域。且作為許多天然產(chǎn)物的活性成份，綠原酸在胃、小腸、大腸均有吸收且代謝廣泛[17-18]。故我們?cè)诖宋氖状翁岢隽艘跃G原酸作為質(zhì)量控制指標(biāo)，建立阿納其根的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀，包含PDA型紫外—可見(jiàn)檢測(cè)器，四元梯度泵(日本島津)。超聲波清洗器(型號(hào)：KH-250，昆山禾創(chuàng)超生儀器有限公司)。

1.1.2 試藥 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供高效液相法含量測(cè)定用，純度98%，批號(hào)：110753-201314)；乙腈(色譜純，sigma公司)；甲醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；阿納其根購(gòu)自亳州市中正中藥材飲片有限公司，批號(hào)為130704。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院譚鵬副教授鑒別為菊科植物羅馬除蟲(chóng)菊(Anayccluspyerhturm.DC.)的根。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5 TC-18柱(5 μm；4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸水(13∶87，V/V);檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；流速:0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含48.4 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。所得HPLC圖譜。見(jiàn)圖1。

圖1 A：綠原酸的HPLC圖 B：200～400 nm范圍內(nèi)的光譜

1.2.3 供試品溶液的制備 取阿納其根粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，稱(chēng)定重量，超聲提取1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，得供試品溶液。所得HPLC圖譜。見(jiàn)圖2。

圖2 A：阿納其根甲醇提取物的HPLC圖

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 精密吸取綠原酸對(duì)照品2.5 mL(質(zhì)量濃度為1.963 mg·mL-1)置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻。逐級(jí)稀釋?zhuān)觅|(zhì)量濃度分別為0.968 mg·mL-1、0.3872 mg·mL-1、0.1936 mg·mL-1、0.0968 mg·mL-1、0.0484 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，精密吸取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄其峰面積。以質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=2296316.8X-1369.4(r=0.9999)。結(jié)果表明綠原酸在0.0484～0.968 mg按照實(shí)際的折算范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，每次吸取10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=0.85%，結(jié)果表明，精密度良好。

1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一阿納其根樣品粉末0.5 g，按照“2.3”項(xiàng)下制備供試液，每次精密吸取10 μL，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，結(jié)果RSD%=1.11%，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一阿納其根樣品粉末6份，每份0.5 g，按供試品項(xiàng)下制備供試液，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果RSD=1.23%，阿納其根中綠原酸平均含量為0.11%，表明重復(fù)性良好。

1.2.4.5 回收率試驗(yàn) 分別稱(chēng)取已知含量(1.10 mg·g-1)的阿納其根樣品粉末6份，每份0.25 g，精密加入綠原酸對(duì)照品(0.3441 mg·mL-1)溶液0.5 mL，供試品項(xiàng)下制備，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件，記錄峰面積，計(jì)算得回收率如表1。

表1 阿納其根中綠原酸的加樣回收率(n=6)

表2 不同批次阿納其根藥材綠原酸含量測(cè)定

1.2.4.6 含量測(cè)定 精密吸取不同批次阿納其根藥材的供試液10 μL分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2得出，不同批次阿納其根藥材綠原酸含量在0.095%～0.120%之間。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 選取200～400 nm的波長(zhǎng)范圍，對(duì)濃度為48.4 μg/mL的綠原酸進(jìn)行掃描，其最大吸收波長(zhǎng)為324，考慮到檢測(cè)靈敏度等問(wèn)題，固選取327 nm為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇 采用了多種色譜流動(dòng)相：1)甲醇-0.4%的磷酸水(10∶90)；2)甲醇-0.1%的甲酸水(10∶90)；3)乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)；經(jīng)比較得出，采用乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)為流動(dòng)相，得出的阿納其根中綠原酸的峰型及分離度等都較其他方法優(yōu)，出峰時(shí)間亦較理想，所以采用乙腈-0.4%磷酸水(13∶87)為色譜流動(dòng)相。

2.3 綠原酸定量的方法 目前對(duì)于綠原酸含量測(cè)定的方法主要有：HPLC法[19-20,25]、薄層掃描法[21]、毛細(xì)管電泳法[22-25]等，而中藥具有多成分的特點(diǎn)，固選用HPLC法進(jìn)行定量。經(jīng)方法學(xué)考察表明，本實(shí)驗(yàn)建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可重復(fù)性好，可作為阿納其根中綠原酸含量測(cè)定的方法。

3 討論

本課題在物質(zhì)基礎(chǔ)研究過(guò)程中，首次發(fā)現(xiàn)阿納其根甲醇提物中含有綠原酸類(lèi)化合物，并建立了其含量測(cè)定的方法。實(shí)驗(yàn)考慮了波長(zhǎng)，流動(dòng)相等的選擇，發(fā)現(xiàn)在以乙腈-0.4%磷酸水(13∶87，V/V)為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm時(shí)，綠原酸在質(zhì)量為0.0484～0.968 mg范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，本法可以為維藥阿納其根的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有效的方法和依據(jù)。

綠原酸類(lèi)物質(zhì)是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，分布在多種植物中，它是植物體內(nèi)有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類(lèi)產(chǎn)物，是多種植物的生物活性物質(zhì)。在測(cè)定不同批次阿納其根含量的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同批次阿納其根中綠原酸含量有明顯差異，因此在以后的研究中，需結(jié)合藥效進(jìn)行進(jìn)一步研究，制定阿納其根真?zhèn)魏蛢?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步保證臨床用藥的安全有效。

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(2015-09-20收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Method Study for Determination of Chlorogenic Acid in Anacyclus pyrethrum DC.of Uygur Medicine by RP-HPLC

Dong Jie，Ji Jiaojiao，Wang Jiali，Yuan Jiang，Wang Beibei,Zhao Shuang,Zheng Zunshan，Liu Yonggang

(SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China)

Objective:A high performance liquid chromatography method(HPLC)was established to determine chlorogenic acid in the root of Anaycclus pyerhturm.DC.Methods:HPLC ana1ysis was actualized on an Agilent 5 TC-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)column with mobile phase of acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution(13∶87，V/V)，flow rate was 0.8 mL·min-1，detection wavelength was 327 nm.Results:The calibration curve was a good linear with a range of 0.0484～0.968 mg·for chlorogenic acid(Y=2296316.8X-1369.4，r=0.9999).The average recovery rate for chlorogenic acid was 100.20%，RSD=2.75%.Conclusion:This method is simple，sensitive，reproducible，which is suitable for the quality control of the root of Anaycclus pyerhturm.DC.

Uygur Medicine; Anaycclus pyerhturm.DC.; HPLC; Chlorogenic acid; Content determination

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：201318101-5)

劉永剛(1981.02—)，男，博士，副研究員，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：liuyg0228@163.com

R29；R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.067