韓　嵐，季兆潔，陳衛(wèi)東，許　釩，彭代銀

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院　安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥　230012)

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桃紅四物湯含藥血清對缺糖缺氧損傷PC12細胞的保護作用

韓嵐，季兆潔，陳衛(wèi)東，許釩，彭代銀

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的探討桃紅四物湯含藥血清對缺糖缺氧(oxygen glucose deprivation，OGD)損傷的PC12細胞的保護作用及其機制。方法采用連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)聯(lián)合低糖培養(yǎng)基建立體外OGD致PC12細胞損傷模型；分別給予不同濃度的桃紅四物湯含藥血清，以MTT法檢測細胞存活率，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；觀察Hoechst33258染色后的細胞形態(tài)學變化；Western blot法檢測給藥后細胞Caspase-3蛋白的表達。結(jié)果與空白血清對照組相比，經(jīng)OGD損傷后，細胞活力顯著降低，桃紅四物湯含藥血清可減輕PC12細胞形態(tài)損傷，顯著提高SOD活力，降低MDA和LDH含量，降低Caspase-3蛋白表達；Hoechst 33258染色結(jié)果表明桃紅四物湯含藥血清能降低OGD誘導的細胞凋亡。結(jié)論桃紅四物湯含藥血清對OGD誘導的PC12細胞損傷具有保護作用，其機制與提高SOD活力和降低MDA含量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]桃紅四物湯；含藥血清；缺糖缺氧；PC12細胞

缺血性腦損傷是目前嚴重威脅人類健康的常見病，隨著中國人口老齡化的增長，缺血性腦損傷的發(fā)病率逐年增高，受到全社會的廣泛關(guān)注。桃紅四物湯出自于清代吳謙所著的《醫(yī)宗金鑒》，由四物湯加桃仁、紅花加減而成，具有養(yǎng)血活血、去瘀生新之功效[1-3]?，F(xiàn)代研究證實，桃紅四物湯對腦缺血動物模型具有較好的保護作用[4-6]。本實驗通過建立缺糖缺氧損傷的PC12細胞模型來模擬腦缺血損傷狀態(tài)下的神經(jīng)細胞，觀察桃紅四物湯含藥血清作用于細胞模型后對細胞活力及細胞形態(tài)的影響，探討其對損傷的神經(jīng)細胞的保護作用及其機制。

1材料

1.1動物及細胞株大鼠腎上腺嗜鉻瘤PC12細胞株：購自中國科學院上海細胞所；SD大鼠：雄性，體質(zhì)量為230～270 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2011-0003。各組動物實驗前均在實驗室正常飼養(yǎng)1周。

1.2藥材桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當歸、川芎購自北京同仁堂藥業(yè)有限公司，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學中藥與資源教研室鑒定。桃紅四物湯醇提物的制備方法[7]：各藥材按復方配伍比例，加入10倍量75%的乙醇，回流提取2 h后，濃縮配制成生藥含量為1.8 g/mL的提取液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3藥品與試劑連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)：國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。高糖和低糖達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)：Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)：美國Hyclone公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)：美國Amersco公司進口，武漢生命技術(shù)有限公司分裝；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒：上海源葉科技有限公司；Hoechst 33258染色液：碧云天生物技術(shù)公司；Caspase-3抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4儀器設(shè)備潔凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；電子精密天平：上海精密科學儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司；滅菌鍋：日本Tomy KOQYO公司；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽、電泳儀：瑞典Amersham Biosciences公司。

2方法

2.1桃紅四物湯含藥血清的制備根據(jù)臨床用量，按“等效劑量的直接換算法”計算出大鼠的桃紅四物湯用藥量。取28只雄性健康大鼠，隨機分為兩組，每組14只。給藥組給予桃紅四物湯濃縮液(1.8 g/mL)10 mL/kg。空白組給予等量生理鹽水。灌胃給藥，每日早晚各1次，連續(xù)3 d。末次給藥1 h后，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，37 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，分離血清，放入離心管中，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2PC12細胞培養(yǎng)及分組給藥PC12細胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS、青霉素100 kU/L和鏈霉素100 kU/L)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，相對飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細胞呈單純貼壁生長，隔日換液，待細胞長至80%～90%的密度，用胰酶/乙二胺四乙酸鈉消化傳代，每2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)消化、離心、完全培養(yǎng)基重懸后，接種于96孔培養(yǎng)板，細胞密度為1×105/mL，按每孔100 μL接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，按以下分組進行實驗。空白血清對照組：高糖DMEM+空白大鼠血清(濃度分別為5%、10%、15%)；缺糖缺氧(oxygen glucose deprivation，OGD)損傷組：低糖DMEM+Na2S2O4(終濃度20 mmol/L)+空白大鼠血清(濃度分別為5%、10%、15%)；桃紅四物湯含藥血清組：低糖DMEM+Na2S2O4(終濃度20 mmol/L)+桃紅四物湯含藥血清(濃度分別為5%、10%、15%)。培養(yǎng)24 h后進行各項指標檢測。

2.3MTT法測定細胞活力取對數(shù)生長期的PC12細胞按4×104/mL密度，接種至96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，分組進行處理，每組設(shè)6個復孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL反應4 h后，吸去上清液，以150 μL二甲基亞砜溶解藍紫色顆粒，于10 min內(nèi)在全自動酶標儀上室溫避光振蕩混勻并于490 nn波長測定各孔的吸光度值。

2.4LDH釋放、MDA含量及SOD活性的測定PC12細胞接種于培養(yǎng)瓶，按實驗分組給藥后，取細胞培養(yǎng)上清液進行LDH檢測。胰酶消化收集細胞，超聲打碎后根據(jù)SOD、MDA試劑盒說明書操作，在450 nm波長下用多功能酶標儀檢測每孔光密度(optical density，OD)值。分別計算各組LDH、SOD活性和MDA含量。

2.5細胞形態(tài)學觀察及Hoechst 33258染色將PC12細胞胰酶消化，重懸后接種于6孔板，給藥后培養(yǎng)24 h，藥物作用結(jié)束后置于倒置顯微鏡下觀察、拍照。按文獻[8]的方法，分別將各組細胞吸除原有培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2遍，加入250 μL預冷的4%多聚甲醛，室溫固定細胞20 min后，去除固定液，再用PBS洗滌3次，吸去液體；每孔加入終濃度為2 μg/mL的Hochest 33258染色液(PBS稀釋)，置于搖床室溫下避光染色5 min；去除染色液，再置于搖床上用PBS洗2次，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6Western blot檢測細胞Caspase-3蛋白的表達模型復制及藥物處理后，收集細胞，加入150 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。樣品與1/4倍量5×SDS上樣緩沖液混合均勻，煮沸使其變性，經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，200 mA恒流2 h轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉3 h后，加入Caspase-3抗體(1∶1 000)封閉過夜。第2天PBST洗滌3次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h。PBST洗膜3次，與化學發(fā)光試劑盒ECL反應，X線膠片曝光顯影。

3結(jié)果

3.1桃紅四物湯含藥血清對OGD誘導PC12損傷后細胞活力的影響兩因素析因設(shè)計的方差分析表明，分組因素和濃度因素對PC12細胞存活率的主效應及其交互作用均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在相同血清濃度下，OGD損傷組PC12細胞存活率均顯著低于空白血清對照組(P<0.05)，桃紅四物湯含藥血清組PC12細胞存活率均顯著高于OGD損傷組(P<0.05)。在分組相同時，PC12細胞存活率隨血清濃度升高而升高，其中15%血清組均顯著高于10%血清組(P<0.05)。見圖1。

注：與5%空白血清組比較，aP<0.05；與10%空白血清對照組比較，bP<0.05；與同濃度空白血清對照組比較，*P<0.05；與同濃度OGD損傷組比較，#P<0.05。

圖1不同濃度桃紅四物湯含藥血清對OGD損傷的

與相同血清濃度的OGD損傷組相比，桃紅四物湯5%、10%含藥血清組能顯著降低LDH活性(P<0.05)，10%、15%含藥血清組能顯著降低MDA含量(P<0.05)，10%、15%含藥血清組能顯著提高SOD活性(P<0.05)。見表1。

血清濃度/%組別nLDH/(U/L)MDA/(μmol/L)SOD/(U/mL)5空白血清對照6975.82±92.789.52±0.2716.55±0.77OGD損傷61333.47±179.56*16.00±0.65*11.89±1.27*桃紅四物湯含藥血清61097.93±118.67#14.96±1.1012.72±0.9810空白血清對照6914.28±52.868.55±0.7818.71±0.96OGD損傷61259.16±147.21*15.46±1.32*13.43±0.81*桃紅四物湯含藥血清61042.95±128.35#12.81±1.64#16.42±0.50#15空白血清對照6668.72±45.476.46±0.7519.78±1.35OGD損傷6901.49±44.88*12.05±1.61*16.23±0.93*桃紅四物湯含藥血清6815.11±86.269.49±1.26#18.65±0.82#

注：與同濃度空白血清對照組比較，*P<0.05；與同濃度OGD損傷組比較，#P<0.05。

3.2桃紅四物湯含藥血清對OGD損傷的PC12細胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察，空白血清對照組細胞形態(tài)正常，呈梭形或多角形，折光性好，數(shù)量多，突起較長。OGD損傷組細胞回縮變圓，折光性下降，突起變短。而10%桃紅四物湯含藥血清組細胞損傷明顯減輕，細胞結(jié)構(gòu)基本完整。見圖2。

注:A.10%空白血清對照組;B.10%空白血清+OGD損傷組;C.10%桃紅四物湯含藥血清+OGD損傷組。

圖2桃紅四物湯含藥血清對OGD損傷的

PC12細胞形態(tài)的影響(10×10倍)

3.3桃紅四物湯含藥血清抑制OGD損傷PC12細胞凋亡的作用空白血清對照組PC12細胞核在Hoechst 22358染色下呈均一黯淡的藍色熒光，細胞核較規(guī)則，OGD損傷處理后多數(shù)細胞核呈較強藍白色的熒光，而桃紅四物湯含藥血清處理后，核固縮情況緩解，熒光形態(tài)基本恢復正常，細胞核較少出現(xiàn)藍白色熒光。見圖3。

3.4桃紅四物湯含藥血清對OGD損傷的PC12細胞中Caspase-3蛋白表達的影響與空白血清對照組相比，OGD損傷組Caspase-3蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與OGD損傷組相比，10%桃紅四物湯含藥血清能夠明顯降低Caspase-3的蛋白表達(P<0.05)。見圖4。

注:A.10%空白血清對照組;B.10%空白血清+OGD損傷組;C.10%桃紅四物湯含藥血清+OGD損傷組。

圖3桃紅四物湯含藥血清對OGD損傷PC12細胞

凋亡的作用(Hoechst 33258染色法，10×40倍)

注：1. 10%空白血清對照組；2. 10%空白血清+OGD損傷組；3. 10%桃紅四物湯含藥血清+OGD損傷組；與10%空白血清對照組比較*P<0.05；與10%空白血清+OGD損傷組比較，#P<0.05。

圖4桃紅四物湯含藥血清對OGD損傷的PC12細胞中

Caspase-3表達的影響(n=3)

4討論

本實驗采用PC12細胞作為體外研究對象。PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞，廣泛用于神經(jīng)藥理學研究。Na2S2O4是一種氧清除劑，能夠迅速清除培養(yǎng)基中的氧，而不損傷細胞膜。本研究采用Na2S2O4聯(lián)合低糖培養(yǎng)基復制的OGD損傷模型，較好地模擬了在體缺糖缺氧對神經(jīng)細胞造成的損傷，并用桃紅四物湯含藥血清干預此細胞，研究其保護作用及作用機制。桃紅四物湯為去瘀生新、活血養(yǎng)血的經(jīng)典方?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化[9]、防治缺血性卒中[10]等作用。桃紅四物湯中含有多種活性成分，如阿魏酸[11]、川芎嗪[12]、藁本內(nèi)酯[13]、羥基紅花黃色素A[14]等，均在神經(jīng)保護方面具有顯著優(yōu)勢。

本實驗通過前期MTT法篩選，采用20 mmol/L的Na2S2O4聯(lián)合低糖培養(yǎng)基作用細胞24 h后，細胞活力顯著降低；而桃紅四物湯含藥血清預處理后細胞活力顯著上升。LDH是反映細胞膜完整性和細胞損傷程度的一種簡便且靈敏的指標。腦組織在缺血缺氧狀態(tài)下，受損細胞會釋放出LDH，并經(jīng)受損的血腦屏障進入血液循環(huán)[15]。實驗結(jié)果表明，5%、10%的桃紅四物湯含藥血清能明顯減少LDH的釋放，減少細胞的死亡率。

氧化應激損傷是造成腦缺血損傷的主要因素之一，主要表現(xiàn)為血中抗氧化物的含量迅速減少[16]。SOD是體內(nèi)天然存在的自由基清除酶，能清除超氧陰離子，對抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[17]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其產(chǎn)生量與氧自由基量呈正相關(guān)，可反映氧自由基水平，間接反映出細胞損傷程度[18]。本研究結(jié)果表明，OGD損傷可導致PC12細胞SOD活性降低，MDA含量增加；而10%、15%的桃紅四物湯含藥血清能顯著降低MDA含量，提高SOD活性。

細胞凋亡與腦缺血損傷關(guān)系密切，且在缺血的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，早期進行抗凋亡治療對抗腦缺血損傷具有重要的意義[19]。Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵性執(zhí)行分子，降低Caspase-3的活性能夠有效抑制凋亡的發(fā)生發(fā)展。已有文獻報道OGD損傷能夠激活Caspase-3蛋白的表達[20]，本實驗證實10%的含藥血清對損傷的PC12細胞保護作用最為明顯，倒置顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)接近正常；Hoechst染色結(jié)果表明細胞凋亡數(shù)減少；Western blot結(jié)果顯示，10%含藥血清能夠抑制OGD誘導的促凋亡蛋白Caspase-3表達的上調(diào)。這些結(jié)果表明，桃紅四物湯能夠?qū)鼓X缺血引起的神經(jīng)細胞凋亡，具有神經(jīng)保護作用。

本實驗從細胞水平驗證了桃紅四物湯含藥血清對OGD處理的PC12細胞具有顯著的保護作用，其機制可能與抗氧化應激反應，下調(diào)Caspase-3蛋白抗凋亡相關(guān)。然而腦缺血損傷機制較為復雜，桃紅四物湯能否作為一種腦保護藥物仍需進一步通過相關(guān)實驗進行探討。

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Protective Effect of Serum Containing Taohong Siwu Decoction on PC12 Cells against Oxygen-Glucose Deprivation

HANLan,JIZhao-jie,CHENWei-dong,XUFan,PENGDai-yin

(AnhuiKeyLaboratoryforModernChineseMateriaMedica,SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect of serum containing Taohong Siwu Decoction (S-TSD) on PC12 cells against oxygen-glucose deprivation (OGD) and the related mechanism. MethodsSodium dithionite (Na2S2O4)+DMEM (low glucose) was applied to establish the model ofinvitroOGD injury in PC12 cells, and the cells were treated with different concentrations of S-TSD. MTT assay was applied to measure the cell viability, and inverted microscopy was applied to observe the changes in cell morphology; the activities of lactate dehydrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD) were measured, and the content of malondialdehyde (MDA) was determined. The changes in cell morphology after Hoechst 33258 staining were observed; Western blot was used to measure the protein expression of Caspase-3 after administration. ResultsCompared with the blank control group, the cell viability decreased significantly after OGD injury, while S-TSD reduced the morphological injury of PC12 cells, significantly increased the activity of SOD, reduced the content of MDA and LDH, and reduced the protein expression of Caspase-3. The results of Hoechst 33258 staining showed that S-TSD reduced cell apoptosis induced by OGD.ConclusionS-TSD can protect PC12 cells against the injury induced by OGD, and its mechanism is related to the increase in the activity of SOD and the reduction in the content of MDA.

[Key words]Serum containing Taohong Siwu Decoction; Oxygen-glucose deprivation; PC12 cell

收稿日期：(2015-01-08；編輯：曹健)

通信作者：彭代銀，pengdy@ahtcm.edu.cn

作者簡介：韓嵐(1982-)，女，博士研究生

基金項目：國家自然科學基金項目(81473387)；安徽省自然科學基金項目(1408085QH163)；安徽省高等學校自然科學優(yōu)秀青年基金課題(81073091)

[中圖分類號]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.01.020