劉善淘,　朱錦燦,　陳小宇,　劉革修

(暨南大學(xué)血液病研究所，廣東 廣州 510632)

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紅景天苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的輻射防護(hù)作用*

劉善淘,朱錦燦,陳小宇,劉革修△

(暨南大學(xué)血液病研究所，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 探討紅景天苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的輻射防護(hù)作用，并分析其機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)正常人外周血EPCs，觀察紅景天苷對(duì)輻射后EPCs活性、黏附、遷移及凋亡的影響。應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率, Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路中Akt蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 4 Gy [60Co]γ射線輻射可導(dǎo)致EPCs損傷，不僅細(xì)胞活性、黏附和遷移能力下降，而且細(xì)胞凋亡增加；與輻射對(duì)照組比較, 紅景天苷則能部分逆轉(zhuǎn)輻射對(duì)EPCs的損傷，提高EPCs的活性、黏附和遷移能力，減少輻射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt蛋白的水平。但這些作用可被PI3K特異性抑制劑LY294002削弱。結(jié)論: 紅景天苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞輻射損傷具有一定的防護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)PI3K/Akt通路的作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]紅景天苷； 輻射； 內(nèi)皮祖細(xì)胞

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，是血管內(nèi)皮更新與修復(fù)以及損傷組織新生血管形成的重要細(xì)胞。研究顯示，EPCs在心血管疾病、腦缺血損傷、肺損傷以及造血干細(xì)胞移植等治療中具有重要作用[1-7]。然而，影像檢查及治療、腫瘤放射治療等不可避免損傷正常的EPCs，從而產(chǎn)生一定的副作用并最終影響患者身體健康狀態(tài)。探索高效低毒或無毒的輻射防護(hù)劑，使其既不影響輻射對(duì)臨床的運(yùn)用作用，同時(shí)又能降低輻射對(duì)人體正常組織的放射損傷，一直是國(guó)內(nèi)外抗輻射藥物研究經(jīng)久不衰的熱點(diǎn)。最近，研究顯示，藏藥紅景天在心腦血管疾病治療方面顯示顯著效果[8-9]，其重要提取物紅景天苷(salidroside，Sal)具有擴(kuò)張阻力血管和容量血管、降低周圍阻力，使動(dòng)脈血壓和左室舒張末壓下降。說明其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞具有重要作用。本文通過研究紅景天苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的輻射防護(hù)作用并初步了解其信號(hào)途徑機(jī)制，為紅景天的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1材料

內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基2(endothelial basal me-dium-2，EBM-2)和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基2(endothelial growth medium-2，EGM-2)購(gòu)自Clonetics；人纖維連接蛋白(human fibronectin, HFN)購(gòu)自Chemicon；FITC-UEA-I 為Sigma 產(chǎn)品; DiI-acLDL購(gòu)自Molecular Probe; 小鼠抗人絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase, Akt)單克隆抗體和小鼠抗人磷酸化Akt單克隆抗體(Millipore);小鼠抗人GAPDH 為Chemicon International產(chǎn)品；Transwell小室購(gòu)自Corning；紅景天苷購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定所，用培養(yǎng)基配制成40 mmol/L的儲(chǔ)存液；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3K)抑制劑LY294002 (Sigma)用DMSO配制成1 mmol/L的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存。

2方法

2.1EPCs培養(yǎng)與鑒定培養(yǎng)、鑒定方法參見文獻(xiàn)進(jìn)行[10]。3名在校健康志愿男生，年齡22～24歲，肘靜脈取血，肝素抗凝，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌2次后接種于含20%胎牛血清的EBM-2和EGM-2混合培養(yǎng)基、HFN(5 μg/cm2)包被的培養(yǎng)瓶，5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)。4 d后用PBS 洗去非貼壁細(xì)胞, 換培養(yǎng)液，6 d后再用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞, 貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。待鑒定的細(xì)胞去培養(yǎng)基，PBS洗2遍、加稀釋的DiI-acLDL(用培養(yǎng)基按1∶100稀釋)、37 ℃下孵育2 h、PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定10 min、PBS洗2遍后，1%曲拉通孵育20 min、PBS洗2遍，加1∶100稀釋的lectin孵育1 h、PBS洗2遍、DAPI染色、熒光顯微鏡下鑒定UEA-I和acLDL 雙染色陽性的EPCs，隨機(jī)選擇10個(gè)視野(×200)計(jì)數(shù)EPCs。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(normal control, NC)、照射組(irradiation control, IC)、Sal實(shí)驗(yàn)組(照射前1 h 加入Sal)以及LY294002組(Sal+LY294002)。IC組、Sal實(shí)驗(yàn)組和LY294002組均接受γ射線照射，劑量為 4.0 Gy，劑量率為0.35 Gy/min，在暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院輻照中心進(jìn)行。Sal濃度(80.0 μmol/L)和LY294002濃度(20 μmol/L)均依據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)選定。每份血液來源的EPCs完成1次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2.2CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性將EPCs細(xì)胞處理為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為6×107/L，每孔 100 μL 細(xì)胞懸液接種于 96 孔板。一塊板接種對(duì)照組細(xì)胞，另一塊板接種照射組、Sal實(shí)驗(yàn)組和LY294002組細(xì)胞。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，實(shí)驗(yàn)組換成含Sal的培養(yǎng)基，LY294002組換成含Sal和LY294002的培養(yǎng)基，對(duì)照組及空白組換成新的普通培養(yǎng)基。1 h后輻射組、實(shí)驗(yàn)組和LY294002組經(jīng)[60Co]γ射線照射，總劑量4.0 Gy。37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48及72 h后，棄上清液后向每孔加入 10μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2 h，當(dāng)顏色開始變深時(shí)用酶標(biāo)儀測(cè)定 450 nm(參比波長(zhǎng)為630 nm)處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。

2.3EPCs黏附能力檢測(cè)輻射后的EPCs經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、收集、懸浮在500 μL培養(yǎng)液中并計(jì)數(shù)。將輻射處理的EPCs接種在HFN包被的96孔培養(yǎng)板，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，在37 ℃下培養(yǎng)30 min，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。

2.4EPCs遷移能力檢測(cè)用0.25%胰酶消化EPCs, 收集并計(jì)數(shù)。將含Sal的500 μL培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室, 輻射處理含2×103EPCs 100 μL注入上室,培養(yǎng)24 h, 刮去濾膜上未遷移細(xì)胞,甲醇固定、Giemsa染色, 隨機(jī)選擇3個(gè)顯微鏡視野(×400), 計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPCs凋亡率取EPCs單細(xì)胞懸液，以 1×108/L的細(xì)胞密度分別接種于 6 孔板中，照射組、Sal實(shí)驗(yàn)組和LY294002組照射后24 h 和 48 h 收集細(xì)胞，1 000 r/min離心 5 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，再次1 000 r/min離心 5 min，收集細(xì)胞，經(jīng)Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.6Westertn blotting檢測(cè)細(xì)胞Akt蛋白的表達(dá)處理24 h后收集細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白上樣，進(jìn)行8%～12%的SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜，然后用含5%脫脂奶粉的TBST對(duì)膜封閉30 min，加入稀釋的Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗IgG(1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次?；瘜W(xué)熒光法檢測(cè)，采集圖像，采用Gelpro 4.0軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參照。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1Sal對(duì)輻射EPCs細(xì)胞活性的影響

輻射組EPCs活性較對(duì)照組低，Sal組EPCs活性較輻射組增加，在24 h時(shí)即有明顯差異， 72 h時(shí)較對(duì)照組增加了1.83倍(P<0.05)。且Sal組EPCs活性較對(duì)照組有相對(duì)增加的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而LY294002組EPCs活性較Sal組降低。這說明輻射顯著抑制EPCs活性，Sal(80 μmol/L)則能保護(hù)輻射對(duì)EPCs活性減弱的作用，LY294002(20 μmol/L)則能抑制紅景天苷對(duì)輻射后EPCs活性增加的作用,見表1。

表1紅景天苷對(duì)輻射后內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響

Table 1.The effects of salidroside (Sal) on the viability of irradiated EPCs (A450.Mean±SD.n=3)

Group24h18h72hNC0.127±0.0260.181±0.0290.353±0.029IC0.115±0.0260.124±0.026*0.164±0.028*Sal0.125±0.026△0.228±0.029△0.366±0.029△LY294002+Sal0.108±0.026#0.107±0.026#0.106±0.026#

*P<0.05vsNC;△P<0.05vsIC;#P<0.05vsSal.

2Sal對(duì)輻射EPCs遷移的影響

Transwell小室培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞遷移，在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，輻射顯著抑制EPCs遷移，輻射組遷移的細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的31%；Sal明顯改善輻射處理的EPCs 的遷移能力，Sal組遷移的細(xì)胞數(shù)是輻射組的1.8倍；LY294002則能抑制Sal的作用，見圖1。

Figure 1.Effects of salidroside (Sal) on migration of irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC;△△P<0.01vsIC;##P<0.01vsSal.

圖1紅景天苷對(duì)輻射后EPCs遷移能力的影響

3Sal對(duì)輻射EPCs黏附能力的影響

輻射顯著抑制EPCs黏附能力，輻射組貼壁細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的30%；Sal明顯改善輻射處理的EPCs 黏附能力，Sal組貼壁細(xì)胞數(shù)是輻射組2.1倍；LY294002則能抑制Sal的作用，見圖2。

Figure 2.Effects of salidroside (Sal) on adhesion of irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC;△△P<0.01vsIC;##P<0.01vsSal.

圖2紅景天苷對(duì)輻射后EPCs黏附能力的影響

4Sal對(duì)輻射EPCs凋亡的影響

結(jié)果顯示，輻射誘導(dǎo)EPCs凋亡，輻射組EPCs 凋亡率是對(duì)照組的5.2倍；Sal明顯抑制輻射誘導(dǎo)的EPCs 凋亡，LY294002則能抑制Sal的作用，見圖3。

5Sal對(duì)輻射EPCs內(nèi)p-Akt蛋白水平的影響

結(jié)果顯示，紅景天苷顯著增加p-Akt蛋白水平；LY294002則能抑制紅景天苷的作用，使p-Akt蛋白水平降低，見圖4。

討論

當(dāng)今世界人類生活和工作中常常需要使用各種輻射，尤其在醫(yī)學(xué)診斷與治療中輻射已經(jīng)成為重要工具。如臨床上很多疾病在診斷或治療上常常需要運(yùn)用到輻射技術(shù)，如心血管疾病行冠脈造影術(shù)明確冠心病的診斷及在Χ線照射下行支架置入術(shù)及腫瘤行放射治療等。同樣，在腦缺血損傷、肺損傷以及造血干細(xì)胞移植等在醫(yī)學(xué)診治過程中應(yīng)用輻射技術(shù)也很常見。但是輻射也對(duì)人身體造成嚴(yán)重?fù)p傷，影響組織細(xì)胞功能。輻射防護(hù)在生活與醫(yī)學(xué)中仍然具有重要意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮更新與修復(fù)以及損傷組織新生血管形成的重要細(xì)胞，主要來源于骨髓。輻射技術(shù)是診治疾病的重要手段，也是引起正常組織放射損傷的主要原因。所以，預(yù)防輻射損傷EPCs則可能對(duì)這些疾病預(yù)后具有重要影響。

Figure 3.Effects of salidroside (Sal) on apoptosis of irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC;△△P<0.01vs IC;##P<0.01vsSal.

圖3紅景天苷對(duì)輻射后EPCs凋亡作用的影響

Figure 4.Effects of salidroside (Sal) on the expression of p-Akt protein in irradiated EPCs. Mean±SD.n=3.△P<0.05vsIC;#P<0.05vsSal.

圖4紅景天苷對(duì)輻射后EPCs細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)的影響

Sal來源于紅景天屬植物的塊根，是藏藥紅景天的主要成分，不僅具有抗疲勞、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)等功能[1-3,11-12]，而且在輻射預(yù)防方面也有相關(guān)研究報(bào)道。1997年鄧偉國(guó)等[13]研究顯示紅景天苷有防護(hù)X線對(duì)脂質(zhì)和細(xì)胞膜損傷的作用。朱錦燦等[14]研究顯示紅景天苷能促進(jìn)輻射損傷的小鼠造血恢復(fù)。最近，Tang等[15]研究顯示，紅景天苷具有促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化形成血管作用和對(duì)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果顯示，紅景天苷能部分逆轉(zhuǎn)輻射對(duì)EPCs的損傷，提高輻射損傷EPCs的活性、黏附和遷移能力，減少輻射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，且其輻射防護(hù)作用與增強(qiáng)EPCs的PI3K/Akt通路作用有關(guān)。紅景天苷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的輻射防護(hù)作用是本研究新發(fā)現(xiàn)，其增強(qiáng)EPCs的PI3K/Akt通路作用機(jī)制與已有的紅景天苷作用機(jī)制有一定相關(guān)性[10,15]。這提示紅景天苷在醫(yī)學(xué)診斷與治療中的輻射防護(hù)作用，為其輻射防護(hù)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Protective effects of salidroside on endothelial progenitor cells damaged by radiationLIU Shan-tao, ZHU Jin-can, CHEN Xiao-yu, LIU Ge-xiu

(InstituteofHematology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To explore the protective effects of salidroside on endothelial progenitor cells (EPCs) damaged by radiation and its mechanisms.METHODS: EPCs from normal peripheral blood were cultured in fibronectin-coated flasks with endothelial progenitor medium. The effects of salidroside on the viability, migration, adhesion and apoptosis of radiation-damaged EPCs were detected. The viability, apoptosis and migration of the cells were assayed by CCK-8 assay, flow cytometry and Transwell chamber experiment, respectively. The cell adhesion assay was performed by re-plating the cells on fibronectin-coated dishes, and then the adherent cells were counted. The expression of Akt protein in the cells was assessed by Western blotting. RESULTS: Salidroside improved the viability, and migratory and adhesive capacities of the EPCs, and decreased the apoptosis after radiation. Salidroside also increased the protein level of phosphorylated Akt. However, the effects of salidroside on radiation-damaged EPCs were inhibited by phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002. CONCLUSION: Salidroside protects EPCs from radiation damages and its mechanism is associated with enhancing phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway.

[KEY WORDS]Salidroside; Radiation; Endothelial progenitor cells

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.008

[中圖分類號(hào)]R979.6; R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-85220262； E-mail: tliugx@jnu.edu.cn

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270568)

[收稿日期]2015- 07- 24[修回日期] 2015- 10- 12

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)02- 0240- 05