王海敏，　湯旭磊，　王朝旭

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

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葉酸對去卵巢大鼠抗氧化酶、一氧化氮合酶和一氧化氮的影響

王海敏#，湯旭磊△，王朝旭

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000)

[摘要]目的： 觀察葉酸對去卵巢大鼠抗氧化酶、一氧化氮合酶和一氧化氮的影響。方法: 40只3月齡健康雌性SD大鼠，隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組、去卵巢組、二乙基己烯雌酚(0.03 mg·kg-1·d-1)組、低劑量(5 mg·kg-1·d-1)葉酸組和高劑量(20 mg·kg-1·d-1)葉酸組。各組大鼠于術(shù)后1周開始灌胃給藥，假手術(shù)組和去卵巢組給予蒸餾水，10周后，取L5椎體和右股骨行骨密度(BMD)檢測；測定血漿和骨勻漿總抗氧化能力(TAC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)和一氧化氮(NO)水平。結(jié)果: 與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠L5椎體和股骨BMD顯著降低(P<0.01)，血漿GSH-Px、NO和骨勻漿TAC、GSH-Px、NOS及NO水平明顯降低(P<0.01)，MDA濃度升高顯著(P<0.01)；與去卵巢組大鼠比較，高劑量葉酸組大鼠L5椎體和股骨BMD增加(P<0.01)，骨勻漿TAC、GSH-Px、NOS和NO水平升高(P<0.01)，MDA濃度降低(P<0.01)，血漿GSH-Px和NO水平升高。結(jié)論: 去卵巢大鼠體內(nèi)抗氧化酶、NOS和NO水平降低，氧化應(yīng)激參與了去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生；高劑量葉酸能提升去卵巢大鼠腰椎和股骨BMD，提高其體內(nèi)抗氧化酶、NOS和NO水平，改善氧化應(yīng)激，這可能是高劑量葉酸防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]葉酸； 骨密度； 谷胱甘肽過氧化物酶； 一氧化氮合酶； 一氧化氮

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)多發(fā)于中老年女性，以雌激素缺乏為主要原因，伴發(fā)體內(nèi)抗氧化酶系、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)及一氧化氮(nitric oxide，NO)異常[1]。近年來，葉酸(folic acid，F(xiàn)A)與骨質(zhì)疏松或骨密度(bone mineral density，BMD)的相關(guān)性引起了人們的高度關(guān)注，但研究結(jié)果仍存在爭議[2-3]。本研究利用去卵巢(ovariectomy,OVX)大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察葉酸對去卵巢大鼠抗氧化酶、NOS、NO 及腰椎和股骨BMD的影響，以探討葉酸對骨質(zhì)疏松癥可能的作用及機(jī)制，為臨床骨質(zhì)疏松的防治提供新思路。

材料和方法

1材料

1.1動(dòng)物3月齡健康SPF級雌性SD大鼠40只，體重(200±20)g，購于甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(甘)2004-0006。

1.2藥物與試劑葉酸片劑購自天津飛鷹制藥有限公司；二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)片劑由合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)；總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、NOS和NO試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備LUNAR公司雙能X線骨密度儀；四川分析儀器廠721型分光光度計(jì)；Heraeus型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)的萬分之一電子天平。

2方法

2.1分組及建立動(dòng)物模型3月齡SPF組雌性SD大鼠40只，隨機(jī)分成假手術(shù)(sham)組、OVX組、DES組、低劑量葉酸(low-dose FA)組和高劑量葉酸(high-dose FA)組，每組8只。各組大鼠在SPF環(huán)境條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取下腹部正中切口，切開皮膚、肌肉，進(jìn)入腹腔，完整摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組只切除卵巢周圍與其大小相似的一小脂肪團(tuán)，保留雙側(cè)卵巢[4]。

2.2藥物干預(yù)所有大鼠在SPF級環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后1周開始灌胃給藥，葉酸和DES片劑研磨成細(xì)粉末由蒸餾水配成相應(yīng)濃度的混懸液用于灌胃，假手術(shù)組和去卵巢組灌服蒸餾水，DES組給予0.03 mg·kg-1·d-1；低劑量葉酸組給予葉酸5 mg·kg-1·d-1，高劑量葉酸組給予葉酸20 mg·kg-1·d-1。每周稱體重1次調(diào)整給藥劑量，共給藥10周[5]。術(shù)后第3周高劑量葉酸組死亡1只，術(shù)后第4周葉酸低劑量組死亡1只，術(shù)后第6周DES組死亡1只，以上3組均在次日喂藥時(shí)發(fā)現(xiàn)，死因不詳。

2.3測定骨密度藥物干預(yù)10周末，剖取L5椎體和右股骨，剔除周圍附著的肌肉及結(jié)締組織，使用LUNAR雙能X線骨密度儀測定離體的股骨和腰椎BMD(g/cm2)。

2.4檢測血漿指標(biāo)心臟采血，置于肝素抗凝管內(nèi)，于30 min內(nèi)3 000 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃保存。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血漿TAC、GSH-Px、MDA、NOS和NO的濃度。

2.5檢測骨勻漿指標(biāo)剖取L3和L4椎體，剔除周圍附著的軟組織，將腰椎體研磨成糊狀，加入冷生理鹽水，4 ℃ 2 000 r/min，離心10 min，收集上清液，置于Eppendorf管內(nèi)，-20 ℃保存，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測TAC、GSH-Px、MDA、NOS和NO的濃度。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用Bonferroni法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1腰椎和股骨BMD的檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠腰椎和股骨BMD均顯著降低(P<0.01)；DES可顯著提高去卵巢大鼠腰椎和股骨的BMD(P<0.01)，其中股骨的BMD接近假手術(shù)組，腰椎的BMD低于假手術(shù)組(P<0.05)；高劑量葉酸組大鼠腰椎和股骨的BMD較去卵巢組顯著升高(P<0.01)，但仍低于DES組和假手術(shù)組(P<0.01)；低劑量葉酸組腰椎和股骨的BMD與去卵巢組水平相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2血漿TAC、GSH-Px和MDA的檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠血漿的GSH-Px水平明顯降低(P<0.01)，MDA的濃度顯著增高(P<0.01)，TAC的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；DES可顯著提高去卵巢大鼠血漿GSH-Px的水平(P<0.01)，降低MDA的濃度(P<0.01)；與去卵巢組比較，低劑量葉酸組大鼠血漿的MDA濃度降低(P<0.01)，TAC和GSH-Px差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高劑量葉酸組大鼠血漿的GSH-Px水平明顯升高(P<0.01)，接近假手術(shù)組水平，MDA的濃度降低(P<0.01)，高于假手術(shù)組(P<0.01)，見表2。

表1各組大鼠腰椎和股骨BMD的比較

Table 1.The BMD of lumbar vertebra and femur in various groups (g/cm2. Mean±SD)

GroupnLumbarvertebraFemurSham80.087±0.0050.151±0.005OVX80.064±0.005△△0.126±0.005△△Diethylstilbestrol70.081±0.004△**0.147±0.004**Low-doseFA70.064±0.007△△##0.131±0.007△△##High-doseFA70.073±0.003△△**##0.137±0.003△△**##

△P<0.05,△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsOVX group;##P<0.01vsdiethylstilbestrol group.

表2各組大鼠血漿TAC、GSH-Px和MDA的比較

Table 2.Comparison of plasma TAC, GSH-Px and MDA in various groups (Mean±SD)

GroupnTAC(U/mL)GSH-Px(U/mL)MDA(μmol/L)Sham811.02±5.61243.26±43.268.42±1.05OVX88.08±1.53141.47±41.47△△19.48±1.30△△Diethylstilbestrol79.07±1.10253.19±53.19**10.86±1.21△△**Low-doseFA77.92±1.77164.54±64.54△△##16.47±0.91△△**##High-doseFA79.71±3.13241.58±41.58**11.86±1.03△△**

△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsOVX group;##P<0.01vsdiethylstilbestrol group.

3血漿NOS和NO的檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠血漿NO濃度降低顯著(P<0.01)，NOS濃度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；DES可顯著提高去卵巢大鼠血漿NO 的水平(P<0.01)，高劑量葉酸可升高去卵巢大鼠血漿NO的水平(P<0.05)；低劑量葉酸組NO的水平與去卵巢組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見表3。

表3各組大鼠血漿NOS和NO的比較

Table 3.Comparison of plasma NOS and NO in various groups (Mean±SD)

GroupnNOS(U/mL)NO(μmol/L)Sham822.67±4.3846.63±8.43OVX816.70±3.7323.25±4.89△△Diethylstilbestrol723.07±6.0046.57±11.93**Low-doseFA718.15±4.5030.14±9.67△△##High-doseFA719.40±4.2337.14±5.40*

△△P<0.01vssham group;*P<0.05，**P<0.01vsOVX group;##P<0.01vsdiethylstilbestrol group.

4骨勻漿TAC、GSH-Px和MDA的檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠骨勻漿TAC和GSH-Px的水平明顯降低(P<0.01)，MDA的濃度顯著增高(P<0.01)；DES和高劑量葉酸可明顯提升去卵巢大鼠骨勻漿TAC和GSH-Px的水平(P<0.01)，降低MDA濃度(P<0.01)，并接近假手術(shù)組水平；與去卵巢組比較，低劑量葉酸組骨勻漿GSH-Px的水平增高(P<0.05)，但仍低于DES組和假手術(shù)組(P<0.05)，MDA的濃度降低(P<0.05)，TAC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4各組大鼠骨勻漿TAC、GSH-Px和MDA的比較

Table 4.Comparison of bone homogenate TAC, GSH-Px and MDA in various groups (Mean±SD)

GroupnTAC(U/mg)GSH-Px(U/mg)MDA(μmol/g)Sham817.91±5.56132.83±26.7113.31±26.70OVX89.76±2.41△△52.76±16.46△△24.71±6.18△△Diethylstilbestrol716.01±3.60**141.89±34.70**14.91±2.70**Low-doseFA711.24±3.88△△#91.22±34.10△*#20.51±3.39△△#High-doseFA715.39±3.20**115.97±40.82**15.33±2.85**

△P<0.05,△△P<0.01vssham group;*P<0.05，**P<0.01vsOVX group;#P<0.05vsdiethylstilbestrol group.

5骨勻漿NOS和NO的檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠骨勻漿NOS和NO濃度均顯著降低(P<0.01)；DES和高劑量葉酸可明顯提高去卵巢大鼠骨勻漿NOS和NO的濃度(P<0.01)，并使兩者接近假手術(shù)組；低劑量葉酸組骨勻漿NOS和NO的濃度均與去卵巢組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表5。

表5各組大鼠骨勻漿NOS和NO的比較

Table 5.Comparison of bone homogenate NOS and NO in various groups (Mean±SD)

GroupnNOS(U/mg)NO(μmol/g)Sham87.34±2.508.55±2.24OVX83.96±1.82△△4.32±1.58△△Diethylstilbestrol77.37±1.60**8.92±2.36**Low-doseFA75.15±1.49△#6.21±1.19#High-doseFA77.11±1.53**8.12±1.77**

△P<0.05,△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsOVX group;#P<0.05vsdiethylstilbestrol group.

討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是中老年婦女的多發(fā)病，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素缺乏伴隨的抗氧化酶活性降低，氧化與抗氧化失衡，引發(fā)的氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松病理過程中具有重要的作用[6]。

Muthusami等[7]利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠股骨骨組織勻漿中抗氧化酶系如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase SOD)、GSH-Px 及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)水平降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和H2O2水平升高，提示去勢誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。Maggio等[8]分別對75名老年骨質(zhì)疏松女性和健康女性進(jìn)行的一項(xiàng)橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，老年骨質(zhì)疏松女性組血抗氧化物如維生素C、E、A和抗氧化酶系如SOD和GSH-Px 活性較之健康女性對照組降低，且這些抗氧化物和抗氧化酶與股骨頸骨密度具有明顯的相關(guān)性。上述研究從不同角度表明,絕經(jīng)雌激素缺乏所致的抗氧化酶系活性降低，氧化應(yīng)激，與骨質(zhì)疏松具有密切的聯(lián)系。

機(jī)體中存在多種抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的各種活性氧，以阻止活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，一個(gè)體系內(nèi)的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總體水平，體現(xiàn)了該體系內(nèi)的總抗氧化能力。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠比較，去卵巢組大鼠血漿的GSH-Px水平明顯降低，MDA的濃度顯著增高，TAC的濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腰椎骨勻漿TAC和GSH-Px的活性明顯降低，MDA生成增加，腰椎和股骨的BMD均顯著降低，提示去卵巢大鼠體內(nèi)抗氧化酶活性及總的抗氧化能力降低，存在氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激可能參與了骨質(zhì)疏松的發(fā)生，與前人研究結(jié)果相近[7-8]。給予不同劑量葉酸干預(yù)治療10周，低、高劑量葉酸(5 mg·kg-1·d-1)均可增強(qiáng)去卵巢大鼠血漿和腰椎骨勻漿GSH-Px的活性，同時(shí)降低去卵巢大鼠體內(nèi)MDA濃度，僅高劑量葉酸可提升去卵巢大鼠骨勻漿TAC水平，并升高去卵巢大鼠腰椎和股骨的BMD。由此推測去卵巢大鼠骨組織局部可能存在多種抗氧化酶和抗氧化分子的活性改變，總的抗氧化能力降低，誘發(fā)氧化應(yīng)激；本研究結(jié)果提示，高劑量葉酸可能通過增強(qiáng)去卵巢大鼠體內(nèi)抗氧化酶活性和總的抗氧化能力，改善機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而提升去卵巢大鼠的骨密度。

NO是重要的信使物質(zhì)和效應(yīng)分子，由NOS催化，以L-精氨酸和分子氧為底物，經(jīng)過電子氧化反應(yīng)生成。近年來發(fā)現(xiàn)，NOS和 NO在骨質(zhì)疏松的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。NOS是生成內(nèi)源性NO的主要限速物質(zhì)，破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞前體、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞均能表達(dá)NOS，現(xiàn)已證實(shí)骨組織中NOS存在神經(jīng)元型、誘導(dǎo)型和內(nèi)皮細(xì)胞型3種亞型。Guo 等[9]報(bào)道去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血漿NO水平降低，股骨eNOS mRNA表達(dá)下降，氫水干預(yù)治療，可以防止去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松，原因之一可能與氫水消除雌激素缺乏誘發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān)。El-Swefy等[10]在研究高同型半胱氨酸血癥與心血管風(fēng)險(xiǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠血漿的NO濃度降低，予葉酸干預(yù)治療可增高去卵巢大鼠血漿NO的濃度，并對激素缺乏所致的相關(guān)癥狀發(fā)揮有益的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去卵巢組大鼠腰椎骨勻漿的NOS、NO和血漿的NO較之假手術(shù)組明顯降低，而高劑量葉酸治療可以提高去卵巢大鼠腰椎和股骨BMD，并提高去卵巢大鼠骨勻漿NOS、 NO和血漿NO水平。由此提示，高劑量葉酸可提高去卵巢大鼠腰椎和股骨BMD，機(jī)制之一可能與調(diào)節(jié)去卵巢大鼠骨組織局部NOS和 NO的代謝有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究的不足之處在于沒有對NOS進(jìn)行分型檢測，在今后的實(shí)驗(yàn)研究中將從分子水平進(jìn)一步探究葉酸對NOS亞型的影響，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

綜上所述，去卵巢大鼠體內(nèi)抗氧化酶、NOS和NO的水平降低，氧化應(yīng)激參與了去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的發(fā)生；高劑量葉酸能提升去卵巢大鼠腰椎和股骨BMD，提高其體內(nèi)抗氧化酶、NOS和NO的水平，改善氧化應(yīng)激，這可能是高劑量葉酸防治去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的機(jī)制之一。本研究利用去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型，首次從總體及骨組織局部，探討不同劑量葉酸干預(yù)治療抗骨質(zhì)疏松的作用及機(jī)制，為臨床骨質(zhì)疏松的防治提供新思路。但是，本研究檢測方法局限在生化水平，應(yīng)進(jìn)一步在分子水平上深入探討葉酸抗骨質(zhì)疏松的作用及機(jī)制，提供更精準(zhǔn)的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Effects of folic acid on antioxidant enzyme, nitric oxide synthase and nitric oxide in ovariectomized ratsWANG Hai-min, TANG Xu-lei, WANG Zhao-xu

(DepartmentofEndocrinology,TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China.E-mail:xulei_tang@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of folic acid (FA) on antioxidant enzyme, nitric oxide synthase (NOS) and nitric oxide (NO) in ovariectomized (OVX) rats.METHODS: Forty three-month-old female SD rats were randomly divided into 5 groups: sham group, OVX group, diethylstilbestrol group (0.03 mg·kg-1·d-1), low-dose FA group (5 mg·kg-1·d-1) and high-dose FA group (20 mg·kg-1·d-1). Gastric gavage started 1 week after operation and lasted for 10 weeks. The rats in sham group and OVX group were given distilled water instead of FA as controls. At the end of the 10th week, the L5vertebra and right femur were removed for determination of bone mineral density (BMD). The bone homogenates were made using the L3and L4vertebrae. The levels of the total antioxidant capacity (TAC), glutathione peroxidase (GSH-Px), malondialdehyde (MDA), NOS and NO were detected in plasma and bone homogenates.RESULTS: Compared with sham group, the BMD levels in L5vertebra and right femur and the levels of GSH-Px and NO in the plasma were all decreased. The levels of TAC, GSH-Px, NOS and NO in the bone homogenates were also decreased, while the MDA concentration was increased in OVX group (allP<0.01). Compared with OVX group, the levels of TAC, GSH-Px, NOS, NO and BMD of the L5vertebra and right femur were all increased, while the MDA concentration was decreased in high-dose FA group (allP<0.01). CONCLUSION: In female SD rats, ovariectomy leads to a significant reduction of antioxidant enzyme, NOS and NO levels. Oxidative stress is possibly involved in the development of osteoporosis. Protection against osteoporosis by high-dose FA may be linked to improvement of antioxidant enzyme activity, the levels of NOS and NO as well as a reduction of oxidative stress in ovariectomized rats.

[KEY WORDS]Folic acid; Bone mineral density; Glutathione peroxidase; Nitric oxide synthase; Nitric oxide

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.028

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel： 0931-8356481； E-mail： xulei_tang@126.com

[收稿日期]2015- 05- 21[修回日期] 2015- 12- 07

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0359- 05

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