硫化氫通過抑制自噬減輕心臟停搏后腦損傷*

魏紅艷，　李恒杰，　李　芳，　胡春林，　李　欣，　李　慧，　趙子然，　張　杰，　廖曉星

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510080)

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硫化氫通過抑制自噬減輕心臟停搏后腦損傷*

魏紅艷，李恒杰，李芳，胡春林，李欣，李慧，趙子然，張杰，廖曉星△

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，廣東 廣州 510080)

[摘要]目的： 觀察硫化氫在心肺復(fù)蘇后腦保護(hù)中的作用，并探討其對神經(jīng)元細(xì)胞自噬的影響。方法: 窒息法建立大鼠心臟停搏模型。72只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、模型(model)組和硫氫化鈉(NaHS)組。自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后2 h、4 h、12 h和24 h用Western blot方法檢測神經(jīng)元自噬標(biāo)志物beclin-1的表達(dá)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)的轉(zhuǎn)換；ROSC后12 h，用免疫組化方法觀察LC3顆粒的表達(dá)；透射電鏡觀察神經(jīng)元自噬現(xiàn)象；ROSC后72 h，TUNEL染色計數(shù)頂葉皮層凋亡神經(jīng)元。ROSC后24 h、48 h和72 h行神經(jīng)功能缺損評分(NDS)評價神經(jīng)功能。結(jié)果: ROSC后2 h、4 h、12 h和24 h，model組自噬標(biāo)志物beclin- 1的表達(dá)持續(xù)增加，而NaHS組beclin-1的表達(dá)先增加，然后逐漸降低(P<0.05)。自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 II/I的表達(dá)也是同樣趨勢。免疫組化顯示，ROSC后12 h，model組神經(jīng)元胞漿和胞核LC3顆粒的比例較NaHS組明顯增多(P<0.05)。電鏡顯示，model組自噬泡明顯多于NaHS組及sham組(P<0.05)。TUNEL染色顯示，ROSC后72 h凋亡神經(jīng)元數(shù)量model組明顯多于NaHS組及sham組(P<0.05)。NDS評分顯示，NaHS組在各時點神經(jīng)功能優(yōu)于model組(P<0.05)。結(jié)論: 硫化氫可以抑制心臟停搏模型大鼠ROSC后神經(jīng)元自噬，減少神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能。

[關(guān)鍵詞]硫化氫； 心臟停搏； 心肺復(fù)蘇； 自噬； 神經(jīng)元

盡管心臟停搏(cardiac arrest, CA)患者的自主循環(huán)恢復(fù)(restoration of spontaneous circulation, ROSC)率可高達(dá)40%～60%，但其最終出院存活率不足10%[1]，心臟停搏所導(dǎo)致的最嚴(yán)重后果是腦細(xì)胞的死亡。以往認(rèn)為壞死和凋亡是細(xì)胞死亡的主要方式。近年來，一種新的程序性細(xì)胞死亡方式——自噬(autophagy)，即II型程序性細(xì)胞死亡，越來越受到重視。它不同于壞死與凋亡，適度的自噬是細(xì)胞完成自身代謝和細(xì)胞器更新的重要方式，對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)控細(xì)胞損傷和老化具有重要意義；而非生理性的、過度的自噬則會導(dǎo)致細(xì)胞過多死亡，從而引起組織器官產(chǎn)生病理性變化[2]。有關(guān)自噬現(xiàn)象在心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation, CPR)后腦損傷中的作用報道較少，有研究表明硫化氫(hydrogen sulfide， H2S)可以通過抑制自噬減輕心肌缺血再灌注損傷，本研究欲通過建立Wistar大鼠窒息模型，觀察硫化氫在心肺復(fù)蘇后腦保護(hù)中的作用，并探討其對神經(jīng)元自噬的影響。

材料和方法

1動物模型及實驗分組

1.1動物模型本實驗在中山大學(xué)衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點實驗室進(jìn)行。72只健康成年雄性Wistar大鼠，15～16月齡，體質(zhì)量280～360 g，由中山大學(xué)實驗動物中心提供。動物購進(jìn)后在SPF級動物房飼養(yǎng) 1 周，實驗前晚禁食不禁水。動物用戊巴比妥鈉(Sigma)30 mg/kg腹腔注射麻醉：酌情給予1/4的首劑量維持。麻醉成功后，固定于操作臺上。胸、背部皮膚備皮。用16 G鞘管經(jīng)口氣管插管，常規(guī)II導(dǎo)聯(lián)心電監(jiān)護(hù)，留置針(Becton Dickinson)穿刺右股動靜脈，動脈管接高敏感換能器監(jiān)測動脈血壓。4通道生理信號采集分析系統(tǒng)(BIOPAC Systems)連續(xù)記錄心率、血壓信息。手術(shù)中用電熱毯保持動物體溫(35.0±0.5) ℃，持續(xù)監(jiān)測肛溫。手術(shù)完成后，待大鼠生理參數(shù)穩(wěn)定開始誘導(dǎo)窒息，經(jīng)股靜脈推注維庫溴銨2 mg/kg，觀察大鼠呼吸、心跳停止時間，心跳停止以動脈收縮壓<20 mmHg作為標(biāo)準(zhǔn)。持續(xù)心臟驟停5 min后開始CPR。先給予2 min的心前區(qū)胸外按壓，按壓頻率200 min-1，按壓深度為前后胸徑的1/3，同時給予腎上腺素20 μg·kg-1·min-1，所有的胸外按壓均由同一實驗人員實施，接小動物呼吸機(jī)，通氣頻率75 min-1，潮氣量15 mL/kg。反復(fù)進(jìn)行上述CPR周期，如15 min未出現(xiàn)ROSC，宣布復(fù)蘇失敗。 ROSC的標(biāo)準(zhǔn)為恢復(fù)室上性心率，平均動脈壓>60 mmHg持續(xù)10 min以上。

1.2實驗分組實驗動物隨機(jī)分為假手術(shù)(sham) 組、模型(model)組和硫氫化鈉(NaHs)組，各24只大鼠。假手術(shù)組僅行手術(shù)操作，不進(jìn)行窒息和心肺復(fù)蘇；模型組窒息后常規(guī)進(jìn)行心肺復(fù)蘇；NaHS組窒息后進(jìn)行心肺復(fù)蘇時立即給予硫氫化鈉(10 mmol/kg)靜脈注射。

2實驗方法

2.1Western blot方法檢測自噬標(biāo)志物beclin-1和LC3的表達(dá)ROSC后分別于2 h、4 h、12 h和24 h隨機(jī)處死3只大鼠，迅速取大腦皮層液氮冷卻后儲存于-80 ℃冰箱。處理腦組織凍存標(biāo)本，按照全蛋白提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)說明，提取全蛋白，BCA法蛋白定量(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。取50 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，滴加 I 抗(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜，10 min，共3次，滴加HRP標(biāo)記的 II 抗(1∶10 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜，10 min，共3次，Millipore發(fā)光液浸泡1 min，Koda膠片曝光，顯影、定影，計算蛋白灰度。 Beclin-1抗體購自CST； LC3抗體購自 Abgent；β-actin抗體購自Santa Cruz。

2.2免疫組化檢測LC3顆粒ROSC后12 h每組隨機(jī)處死3只動物取大腦皮層，制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組化觀察LC3顆粒，具體步驟如下：常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，高溫檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，LC3抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，反復(fù)PBS清洗，加入標(biāo)志 II 抗IgG(1∶300)，濕孵1 h。PBS沖洗，10 min，共3次。顯色劑顯色10 min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡檢。

2.3TUNEL檢測神經(jīng)元凋亡TUNEL凋亡試劑盒購自Roche。具體步驟如下：(1) 取ROSC后72 h海馬組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟、梯度乙醇水化，PBS洗3 次；(2) 用抗原修復(fù)液行抗原修復(fù)；(3) 拭干切片周圍水份，用Proteinase K 工作液(20 mg/L)孵育37 ℃ 30 min，PBS洗3 次；(4) 拭干切片周圍水份，滴加免疫染色封閉液室溫封閉60 min，PBS洗3 次；(5) 拭干切片周圍水份，滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液于樣本區(qū)域，于37 ℃、濕盒中避光反應(yīng)60 min； PBS 漂洗3 次；(6) DAPI染核3 min，免疫熒光封片劑封片；(7) 在IX71型倒置熒光顯微鏡(Olympus)下觀察，計數(shù)凋亡細(xì)胞，計算凋亡率。

2.4電鏡觀察自噬泡的形成ROSC后12 h處死動物，迅速取腦，用眼科剪取頂葉皮層區(qū)2.0 mm× 0.5 mm×0.5 mm小塊組織，1%鋨酸4 ℃冰箱中固定1 h～2 h。將標(biāo)本進(jìn)行漂洗、固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色后于電鏡下觀察并拍片，每張切片不同部位各選取10個神經(jīng)元，每個神經(jīng)元隨機(jī)選取3個視野，在高倍鏡視野下觀察并計數(shù)每個神經(jīng)元胞漿內(nèi)自噬泡數(shù)量。

2.5神經(jīng)功能缺損評分(neurologic deficit score, NDS)分別于ROSC后24 h、48 h和72 h進(jìn)行NDS評分。NDS評分內(nèi)容包括意識狀態(tài)、呼吸、顱神經(jīng)功能、運(yùn)動感覺功能和行為5個部分，范圍為0～500，其中0～100為正常、500為死亡。ROSC后24 h、48 h和72 h分別由3個不同的醫(yī)生進(jìn)行評分，3人的平均分為最終評分。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，依據(jù)正態(tài)檢驗結(jié)果分別用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或四分位數(shù)法表示，依據(jù)正態(tài)檢驗結(jié)果用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間差異的兩兩比較用SNK法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1基本參數(shù)

48只大鼠均成功誘發(fā)窒息致心臟停搏， 窒息前各組動物的基本生理學(xué)參數(shù)——體重(body weight, BW)、心率(heart rate, HR)、呼吸頻率(respiratory rate, RR)、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)和平均動脈壓(mean arterial pressure MBP)，以及復(fù)蘇相關(guān)參數(shù)——基礎(chǔ)生命支持時間(basic life support, BLS)和腎上腺素(epinephrine)用量見表1。Model組20只ROSC成功，NaHS組22只ROSC成功，ROSC率兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，但72 h存活率比較，Model組與NaHS組分別為6/12和9/12(P<0.05)。

表1各組動物的基本生理學(xué)參數(shù)和復(fù)蘇相關(guān)指標(biāo)

Table 1.The physiologic and CPR parameters in three groups(Mean±SD.n=24)

ParameterShamModelNaHSROSC__20/2422/2472hsurvivalrate__6/129/12*BW(g)319±14323±16317±12HR(bpm)402±21405±24398±29RR(bpm)85±483±387±4SBP(mmHg)103±12108±10110±16DBP(mmHg)75±1080±1178±12MAP(mmHg)88±1287±1090±12BLS(min)1.0±1.21.0±1.61.0±1.4Epinephrine(μg)12±511±610±5

*P<0.05vsmodel.

2自噬標(biāo)志物beclin-1和LC3蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果表明，ROSC后，model組自噬標(biāo)志物beclin-1的表達(dá)逐漸上升，而NaHS組先逐漸上升，然后逐漸恢復(fù)。其中，model組ROSC后2 h、4 h、12 h和24 h beclin-1的表達(dá)均明顯高于sham組(P<0.05)。而NaHS組在ROSC后2 h、4 h、12 h和24 h beclin-l的表達(dá)明顯下降，與model組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 II/I的表達(dá)也是同樣趨勢，見圖1。

Figure 1.The expression of beclin-1 and LC3 II/I. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vssham.

圖1ROSC各組自噬標(biāo)志物beclin-1及LC3 II/I的表達(dá)

3LC3顆粒的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，ROSC后12 h，sham 組、model組與NaHS組神經(jīng)元胞漿LC3顆粒和細(xì)胞核的比例分別為0.12±0.02、0.36±0.05、0.25±0.03，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

Figure 2.The formation of LC3 dots at 12 h after ROSC. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05vssham.

圖2ROSC后12 h LC3顆粒的表達(dá)

4神經(jīng)元自噬泡的形成

透射電鏡顯示，ROSC后12 h, model組自噬小體數(shù)量明顯多于NaHS組及sham組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The numbers of autophagic vacuole in the 3 groups at 12 h after ROSC (×16 500). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05vssham.

圖3ROSC后12 h每組自噬小體的形成情況

5神經(jīng)元凋亡情況

TUNEL染色顯示，ROSC后72 h，sham 組、model組和NaHS組凋亡神經(jīng)元比例分別為3%、25%和15%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。

6NDS神經(jīng)功能評分

NDS評分顯示，model組在ROSC 24 h、48 h和72 h NDS評分的中位數(shù)分別為300、265和250，NaHS組在ROSC 24 h、48 h和72 h NDS評分的中位數(shù)分別為175、110和84，NaHS組神經(jīng)功能優(yōu)于model組(P<0.05)，見表2。

討論

盡管亞低溫、增強(qiáng)型體外反搏、烏司他丁等各種方法在心臟停搏后腦保護(hù)作用被指南推薦[3-6]，但在臨床上應(yīng)用效果仍不理想。近年來 H2S被認(rèn)為是繼一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后發(fā)現(xiàn)的第3種具有生物活性的內(nèi)源性氣體信號分子。H2S可以通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡而起到腦保護(hù)作用，在缺血再灌注損傷中的作用受到關(guān)注[7-10]，但具體機(jī)制不詳，H2S是否可通過減少神經(jīng)元自噬進(jìn)而減少凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用呢？

自噬是營養(yǎng)底物缺乏時細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)，自噬在機(jī)體的免疫、感染、炎癥、腫瘤、心血管病、神經(jīng)退行性病、缺血再灌注損傷的發(fā)病中具有十分重要的作用。在缺血/再灌注等各種因素刺激下，細(xì)胞啟動自噬來提高細(xì)胞對缺血缺氧的耐受力，對細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。研究表明自噬在缺血缺氧性腦損傷模型中被激活，對細(xì)胞的命運(yùn)具有雙向作用。由輕度或中度腦缺血或缺氧引起的生理水平的自噬具有保護(hù)作用(通過分解代謝產(chǎn)生能量阻止細(xì)胞壞死，通過清除受損的線粒體抑制細(xì)胞凋亡)；由嚴(yán)重腦缺血或缺氧引起的高水平的自噬可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。種種跡象表明，再灌注后腦組織神經(jīng)細(xì)胞自噬異常增多可能是導(dǎo)致腦損傷的重要啟動因素之一[11]，如果能夠早期、有效抑制自噬的發(fā)生，有望減輕腦損傷。

本研究中，兩組之間ROSC成功率的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，但是72 h存活率有明顯差異，molde組50%，NaHS組75%，NaHS組存活率明顯升高，這與文獻(xiàn)[12]報道的存活率基本一致，因本研究中采用窒息引起的心臟停搏，時間為5 min，但加上心臟停搏前窒息的時間，總?cè)毖鯐r間為8 min，因此大鼠的總體死亡率較高。 Minamishima 等[12]報道經(jīng)歷8 min 心臟停搏并在CPR前1 min 時給予H2S供體硫氫化鈉治療的小鼠24 h 生存率明顯提高，硫氫化鈉能阻止CA/CPR所致的氧化應(yīng)激和神經(jīng)功能障礙惡化，而CPR后10 min延遲給予硫氫化鈉治療組預(yù)后較差，因此本研究采用開始心肺復(fù)蘇即刻給予硫氫化鈉，能夠明顯改善預(yù)后。

心臟停搏全腦缺血缺氧后，細(xì)胞內(nèi)ATP水平迅速降低，導(dǎo)致腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)活性增加，進(jìn)而激活自噬。本研究中探討了H2S對神經(jīng)元自噬的影響，model組自噬蛋白beclin- 1的表達(dá)逐漸上升，而NaHS組先逐漸上升，然后逐漸恢復(fù)；與model組相比較，NaHS組在ROSC后4 h、12 h和24 h beclin-1 的表達(dá)明顯下降。LC3是一種自噬標(biāo)志物，自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-II)，LC3 II/I比值的大小可估計自噬水平的高低，本研究中，NaHS組LC3II/I比值明顯低于model組，且NaHS組神經(jīng)元凋亡亦明顯減少，說明H2S可以抑制ROSC后神經(jīng)元過度自噬，減少凋亡，起到腦保護(hù)作用。與Wang等[11]研究結(jié)果一致，在嚴(yán)重腦缺血后自噬過度、持續(xù)激活，抑制過度的自噬水平可以減少海馬CAl區(qū)神經(jīng)元壞死。我們既往研究表明，H2S在體內(nèi)6 h 左右達(dá)到高峰[13-14]，本研究也顯示4 h后發(fā)揮了抑制自噬作用。既往報道H2S可以減輕缺血再灌注心肌損傷[15]、肝臟損傷[16]等，但較少有對全腦缺血缺氧的研究，本研究為心臟驟停后綜合征的治療提供新的思路及理論根據(jù)。

Figure 4.The neuron apoptosis in each group at 72 h after ROSC. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel;#P<0.05vssham.

圖4ROSC后72 h 神經(jīng)元凋亡的情況

表2ROSC后各組動物的NDS評分

Table 2.NDS after ROSC in the 2 groups [Median(Q1,Q3).n=24]

Group24h18h72hModel300(265,391)265(180,350)250(170,350)NaHS175(123,294)*110(75,238)*84(55,181)*

*P<0.05vsmodel.

綜上所述，硫化氫可以抑制心臟停搏模型大鼠ROSC后神經(jīng)元自噬，減少神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能。但H2S抑制神經(jīng)元自噬的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Neuroprotective effect of H2S by inhibiting autophagy after restoration of spontaneous circulation in rats with cardiac arrestWEI Hong-yan, LI Heng-jie, LI Fang, HU Chun-lin, LI Xin, LI Hui, ZHAO Zi-ran, ZHANG Jie, LIAO Xiao-xing

(DepartmentofEmergencyMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaowens@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the neuroprotective effect of hydrogen sulfide (H2S) after cardiopulmonary resuscitation in rats with cardiac arrest (CA), and to explore the effects of H2S on neuron autophagy. METHODS: The CA model was established through asphyxia. Male Wistar rats were randomly divided into sham group, model group and NaHS group. The levels of beclin-1 and LC3 II/I were measured by Western blot at 2 h, 4 h, 12 h and 24 h after the restoration of spontaneous circulation (ROSC). At 12 h after ROSC, the formation of autophagic vacuole with LC3 dots was determined by immunohistochemical (IHC) method. The phenomenon of neuron autophagy was observed under transmission electron microscope. The numbers of apoptotic neurons were counted by TUNEL staining at 72 h after ROSC. The neurolo-gic deficit score (NDS) was used to evaluate the neurologic function after ROSC. RESULTS: The level of beclin-1 was gradually increased in model group, but it was increased and then gradually recovered in NaHS group (P<0.05). The conversion of LC3 II in the cerebral cortex was the same as beclin-1. The results of IHC showed that LC3-positive nuclei in model group were more than those in NaHS group (P<0.05). The number of autophagic vacuole in model group was more than that in NaHS group (P<0.05). The number of the TUNEL-positive cells in model group was more than that in NaHS group (P<0.05). The NDS of the animals in NaHS group after ROSC was lower than that in model group(P<0.05). CONCLUSION: H2S inhibits neuronal autophagy, decreases apoptosis and improves neurologic function in CA rats after ROSC.

[KEY WORDS]Hydrogen sulfide; Cardiac arrest; Cardiopulmonary resuscitation; Autophagy; Neurons

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.016

[中圖分類號]R541.7； R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-87755766； E-mail: liaowens@163.com

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81372023 )；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)基金資助項目(No.B2012085)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 12- 03

[文章編號]1000- 4718(2016)02- 0284- 06