彭英云， 張 濤， 江 波*， 沐萬(wàn)孟， 繆 銘

（1.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224003；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫214122）

Bacillus methylotrophicus γ-聚谷氨酸合成酶基因的克隆表達(dá)

彭英云1，2， 張 濤2， 江 波*2， 沐萬(wàn)孟2， 繆 銘2

（1.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224003；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫214122）

研究了一株非谷氨酸依賴型γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）產(chǎn)生菌Bacillus methylotrophicus SK19.001合成酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)。以pET-28a（+）載體構(gòu)建含有pgsBCA合成酶基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichia coli BL21構(gòu)建重組菌。結(jié)果表明，在分別以葡萄糖和谷氨酸為底物的培養(yǎng)基中，重組工程菌都具有合成γ-PGA的能力，說明pgsBCA合成酶基因?qū)τ贐.methylotrophicus SK19.001產(chǎn)γ-PGA是必需的。pgsBCA合成酶基因序列比對(duì)的結(jié)果的表明，pgsB和pgsC基因編碼的氨基酸序列相對(duì)保守。

Bacillus methylotrophicus；非谷氨酸依賴型；γ-聚谷氨酸合成酶；克隆表達(dá)

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-Glutamate，γ-PGA）是一種多功能生物可降解高分子材料，相對(duì)分子質(zhì)量一般在10 000~1 000 000左右[1]，通常由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過酰胺鍵聚合而成。γ-PGA由于能被徹底生物降解，對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害，又具有如良好的水溶性，超強(qiáng)的吸附性，可食用等獨(dú)特性質(zhì)，其在環(huán)保、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，如作為土壤保水劑、食品增稠劑、污水絮凝劑、重金屬吸附劑、藥物或肥料緩釋劑及藥物載體等。γ-PGA目前多由微生物合成，根據(jù)培養(yǎng)基中是否需要谷氨酸，可以把γ-PGA產(chǎn)生菌分為谷氨酸依賴型菌株和非谷氨酸依賴型菌株，前者主要通過外源谷氨酸合成γ-PGA，后者則通過胞內(nèi)合成途徑將非谷氨酸底物如檸檬酸、葡萄糖等轉(zhuǎn)化合成γ-PGA[2]。

目前，研究者已經(jīng)從自然界篩選了許多株γ-PGA產(chǎn)生菌，其中大多為谷氨酸依賴型菌株如B.subtilis IFO3335[3]，B.licheniformis ATCC9945[4]，B.subtilis F-2-01[5]等。對(duì)這些菌株的研究包括發(fā)酵過程的優(yōu)化設(shè)計(jì)和分子生物學(xué)的研究包括對(duì)產(chǎn)酶基因的克隆和表達(dá)、合成酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)組學(xué)分析等，其中對(duì)pgsBCA合成酶基因的研究多為谷氨酸依賴型菌株的相關(guān)基因，而非谷氨酸依賴型的菌株的合成酶基因信息較為鮮見。

Bacillus methylotrophicus SK19.001是一株自然篩選得到的非谷氨酸依賴型γ-PGA產(chǎn)生菌，其特點(diǎn)是產(chǎn)量高，產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量大，可通過多種非谷氨酸碳源如甘油、葡萄糖、可溶性淀粉等發(fā)酵得到 γ-PGA[6]。 作者主要對(duì) B.methylotrophicus SK19.001產(chǎn)γ-PGA的合成酶基因進(jìn)行研究?？寺K19.001的產(chǎn)酶基因pgsBCA基因，對(duì)基因核苷酸序列和氨基酸進(jìn)行比對(duì)和分析；以pET-28a（+）為載體構(gòu)建含有pgsBCA合成酶基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E．coli構(gòu)建重組菌，并測(cè)定工程菌合成γ-PGA的能力，這將為進(jìn)一步研究微生物細(xì)胞合成生物大分子的機(jī)制提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株：B.methylotrophicus SK19.001，前期研究篩選得到[6]；克隆宿主pET-28a（+）質(zhì)粒：購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；表達(dá)載體E.coli BL21：購(gòu)自Novagen公司。

1.2 工具酶和相對(duì)分子質(zhì)量Marker

Pfu DNA聚合酶，NcoI、XhoI限制性內(nèi)切酶，EZ-10離心柱式基因組DNA抽提試劑盒，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒：購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。T4 DNA連接酶、DNA Maker：購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖20，酵母膏粉25，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41；pH 7.0~7.2，37℃，200 r/min離心12 h。

1.3.2 LB培養(yǎng)基（g/L） 胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；pH 7.0~7.5，固體加瓊脂粉20、0.1 MPa、121℃滅菌20 min。

1.3.3 E.coli BL21谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L） 添加L-谷氨酸20、MgCl2·6H2O 5（MnSO4·H2O 0.5）的LB培養(yǎng)基，pH 7.5、0.1 MPa、121℃滅菌20 min，使用前加入0.1%卡那霉素。

1.3.4 E.coli BL21葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L） 添加葡萄糖20、MgCl2·6H2O 5（MnSO4·H2O 0.5）的LB培養(yǎng)基，pH 7.5、0.1 MPa、115℃滅菌30 min，使用前加入0.1%卡那霉素。

1.4 儀器和設(shè)備

PCR儀：美國(guó)Thermo公司；核酸蛋白電泳電源系統(tǒng)、垂直板蛋白電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、核酸電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司。

1.5 引物設(shè)計(jì)

參考B.amyloliquefaciens LL3 γ-PGA合成酶基 因 序 列 pgsBCA （GenBank accession No. HM034756.1，HM034757.1，HM034759.1）[7]，設(shè)計(jì)B.methylotrophicus SK19.001合成酶基因pgsBCA PCR擴(kuò)增引物。上游引物P1：ATGTGGTTACTCATTAT AGCCT，下游引物P2：TACACCAATGAGTAATATCG GA，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測(cè)序；根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì) pET-28a-pgs載 體 構(gòu) 建 上 游 引 物 P3：CATGCCATGGGAATGTGGTTA CTCATTATAG（含NcoI酶切位點(diǎn)），下游引物P4：CCGCTCGAGTCAC TCCGCT TTCTTT（含XhoI酶切位點(diǎn)），由上海生物工程公司合成。

1.6 B.methylotrophicus SK19.001 pgsBCA基因的克隆

1.6.1 基因組DNA的提取 按照 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行 B.methylotrophicus SK19.001基因組DNA的提取[8]，保存于-20℃。

1.6.2 pgsBCA 基 因 的 PCR 擴(kuò) 增 以 B. methylotrophicus SK19.001基因組DNA為模板，用引物P1、P2擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，引物P1和P2各4 μL，10×Buffer 10 μL，dNTP 8 μL，Pfu 2 μL，ddH2O 71 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3.5 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.6.3 PCR產(chǎn)物純化回收 PCR產(chǎn)物純化回收按照SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收方法進(jìn)行回收，并送至商業(yè)公司測(cè)序。

1.7 pET-28a-pgs重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用E.coli-BL21載體pET-28a（+）與γ-PGA合成酶基因pgsBCA雙酶切后相連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-pgs，采用引物為P3/P4，上下游引物的酶切位點(diǎn)為NcoI和XhoI。PCR回收產(chǎn)物雙酶切體系：NcoI 1 μL，XhoI 1 μL，Buf Tango 5 μL，PCR產(chǎn)物 30 μL，ddH2O 13 μL；載體雙酶切體系：NcoI 1 μL，XhoI 1 μL，Buf Tango 5 μL，pET-28a（+）37 μL，ddH2O 6 μL。將酶切回收后的目的基因片段與質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-pgs[9]。連接反應(yīng)體系：T4連接酶1 μL，10×Buffer 2 μL，目的基因片段10 μL，pET-28a（+）1 μL，ddH2O 6 μL，連接反應(yīng)于16℃反應(yīng)12 h。

1.8 pET-28a-pgs重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證

采用CaCl2法轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，采用菌落PCR和酶切進(jìn)行陽(yáng)性克隆的鑒定。將PCR驗(yàn)證和酶譜鑒定正確的工程菌株用DNA抽提試劑盒提取質(zhì)粒后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.9 工程菌株發(fā)酵和產(chǎn)物鑒定

1.9.1 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 從工程菌LB固體平板上挑取一單菌落，接種于含5 μL抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床培養(yǎng)12 h；取4 mL菌液接種到含100 μL抗生素的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)；當(dāng)OD600nm達(dá)到

1.5 ~1.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)pgsBCA基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。

1.9.2 γ-PGA產(chǎn)物的提純和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

按照PENG Y等人的方法進(jìn)行[6]。

1.9.3 γ-PGA產(chǎn)物中L-/D-谷氨酸比例測(cè)定 按照PENG Yingyun等人的方法進(jìn)行測(cè)定[10]。

1.9.4 γ-PGA產(chǎn)物的鑒定 通過核磁共振H譜和C譜分析鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 B.methylotrophicus SK19.001 pgsBCA基因的克隆

以提取的B.methylotrophicus SK19.001基因組DNA為模板，采用引物 P1/P2，PCR擴(kuò)增出的pgsBCA片段大小約為2.8 kb，見圖1，與預(yù)期基本一致。純化回收后的PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，pgsBCA基因片段大小共為2 812 bp，在GenBank上通過比對(duì)確定包含3個(gè)開放閱讀框，分別為：pgsB（1 182 bp）、pgsC（450 bp）和pgsA（1 149 bp），分別編碼393個(gè)、149個(gè)、382個(gè)氨基酸。在GenBank上提交獲得序列號(hào)分別為：pgsB：KP698949；pgsC：KP698950；pgsA：KP698951。

圖1 pgsBCA基因PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplification of pgsBCA

2.2 pET-28a-pgs載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

采用pET-28a（+）為構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體，pET-28a（+）的基因片段大小約為5 369 bp，將目的基因用帶有酶切位點(diǎn)的引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pET-28a（+）分別用NcoI和XhoI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后連接，得到重組表達(dá)載體pET-28a-pgs，見圖2。將構(gòu)建的pET-28a-pgs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化工程菌質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證并測(cè)序。圖3（a）為采用引物P3和P4，PCR擴(kuò)增出的pgsBCA片段大小約為2.8 kb，與預(yù)期基本一致。分別用NcoI、XhoI對(duì)從工程菌中提取的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，瓊脂糖電泳只出現(xiàn)大約8.0 kb的一條帶，見圖3（b）；用NcoI和XhoI對(duì)工程菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖電泳出現(xiàn)約2.8 kb和5.2 kb兩條帶，見圖3（c）。將工程菌提取質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與前面所測(cè)序列一致，說明pET-28a-pgs重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pET-28a-pgs載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pET-28a-pgs

2.3 含pgsBCA基因的E.coli重組菌的發(fā)酵

在成功構(gòu)建含γ-PGA合成酶基因的pET-28apgs重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，對(duì)E.coli BL21基因工程菌進(jìn)行了發(fā)酵研究，證明大腸桿菌工程菌確實(shí)具有γ-PGA的合成能力，并嘗試分析不同培養(yǎng)基（分別含谷氨酸和葡萄糖）對(duì)谷氨酸非依賴型來源的pgsBCA基因的表達(dá)，即催化合成γ-PGA產(chǎn)量及相對(duì)分子質(zhì)量大小等的影響。

2.3.1 含pgsBCA基因的工程菌發(fā)酵 分別采用添加L-谷氨酸或葡萄糖底物的LB培養(yǎng)基對(duì)E.coli工程菌進(jìn)行發(fā)酵。誘導(dǎo)表達(dá)36 h后停止發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理，無(wú)水乙醇沉淀后透析脫鹽，冷凍干燥獲得γ-PGA。構(gòu)建的E.coli基因工程菌在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵合成γ-PGA的情況見表1。結(jié)果顯示：葡萄糖和L-谷氨酸都能作為底物 （或碳源）合成γ-PGA，但產(chǎn)量遠(yuǎn)低于野生菌（33.84 g/L）[6]，但與報(bào)道的E.coli基因工程菌合成γ-PGA的產(chǎn)量相近。曹名鋒等[11]用B.amyloliquefaciens LL3中的pgsBCA酶基因構(gòu)建的E.coli工程菌，以谷氨酸為碳源的γ-PGA的產(chǎn)量為0.558 g/L，以葡萄糖為碳源的γ-PGA的產(chǎn)量為0.376 g/L；江昊[12]以B.subtilis strain（chungkookjang）的pgsBCA酶基因構(gòu)建的E.coli工程菌，以谷氨酸為碳源的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為0.051 g/L。葡萄糖作為底物工程菌發(fā)酵γ-PGA的產(chǎn)量明顯少于L-谷氨酸作為底物時(shí)γ-PGA的產(chǎn)量；發(fā)酵36 h后，兩種培養(yǎng)基的發(fā)酵液pH有明顯差異，這可能跟E.coli對(duì)碳源的利用有關(guān)。D-谷氨酸含量與野生菌（65%~70%）相比低了很多[10]，可能因?yàn)镋.coli工程菌中缺乏GLR消旋酶活性。本課題組前期的研究結(jié)果推測(cè)，pgsBCA合成酶基因可能對(duì)底物具有立體選擇性[10]，這可能也導(dǎo)致了E.coli工程菌中γ-PGA產(chǎn)量較低，在將來的研究中可考慮將谷氨酸消旋酶基因glr與pgsBCA合成酶基因一起導(dǎo)入工程菌，研究對(duì)γ-PGA產(chǎn)生的影響。相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果表明，E.coli工程菌所產(chǎn)γ-PGA的相對(duì)分子質(zhì)量大約在160 000~185 000，同樣遠(yuǎn)低于野生菌所產(chǎn)γ-PGA相對(duì)分子質(zhì)量（＞107）[6]，這可能是因?yàn)橐吧蠵gsBCA復(fù)合酶系主要定位于細(xì)胞膜[1]，而導(dǎo)入E.coli工程菌的酶組分可能位于膜內(nèi)，對(duì)產(chǎn)物的跨膜運(yùn)輸效果可能不及野生菌。曹名鋒等[11]研究的B.amyloliquefaciens LL3 pgsBCA基因在大腸桿菌中表達(dá)，合成的γ-PGA相對(duì)分子質(zhì)量大約為40 000。

圖3 PCR和酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.3 Electrophoresis analysis of PCR of recombinant plasmid pET-28a-pgs

表1 E.coli工程菌不同培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGATable 1 γ-PGA product by E.coli BL21/pET-28a-pgs in different media

2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定 對(duì)E.coli工程菌產(chǎn)物純化后進(jìn)行1H-NMR和13C-NMR檢測(cè)。圖4（a）為純化產(chǎn)物的1H-NMR譜圖，圖4（b）為純化產(chǎn)物的13CNMR譜圖。出峰時(shí)間和數(shù)量可以表明純化產(chǎn)物為γ-PGA，說明重組質(zhì)粒pET-28a-pgs在E.coli中表達(dá)成功。

圖4 E.coli工程菌發(fā)酵產(chǎn)物NMR圖譜Fig.4 NMR spectra of the product by E.coli in D2O

2.4 B.methylotrophicus SK19.001 pgsBCA合成酶基因和編碼蛋白質(zhì)序列分析

將SK19.001 pgsBCA酶基因和編碼蛋白質(zhì)序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已測(cè)定的 γ-PGA產(chǎn)生菌的pgsBCA合成酶基因進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表2。從表2可以看出，谷氨酸依賴型菌株和谷氨酸非依賴型菌株各自的pgsBCA合成酶基因序列一致性非常高，但依賴型和非依賴型菌株之間的pgsBCA合成酶基因序列一致性卻較低，這說明產(chǎn)聚谷氨酸菌株的谷氨酸依賴性可能和pgsBCA合成酶基因有很大的關(guān)系。從表2還可以看出，pgsB和pgsC在不同菌株中具有更高的相似度，而pgsA相似度較低。

根據(jù)Ashiuchi等人[13-14]的分析，PgsB被認(rèn)為是最主要的催化組分，是合成酶催化作用的能量ATP提供中心，它具有酰胺連接酶結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)酰胺鍵的鏈接；PgsC可能是酶的一個(gè)膜嵌入組分，也是最具疏水性的蛋白質(zhì)，它含有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，與N-乙酰谷氨酸合成酶中N-乙酰轉(zhuǎn)移酶相似。PgsC與PgsB一起構(gòu)成酶復(fù)合體的催化部位，通過兩者的聯(lián)合作用對(duì)底物谷氨酸進(jìn)行聚合。PgsA具有膜錨定區(qū)并位于細(xì)胞表面。PgsA可能負(fù)責(zé)PGA的轉(zhuǎn)運(yùn)，從表2的數(shù)據(jù)分析，在依賴型和非依賴型菌株之間的pgsBCA合成酶基因和蛋白質(zhì)序列有較大的差異，其中PgsB、C的酶蛋白序列差異達(dá)到6%~12%，這些氨基酸序列的差異可能存在于酶的結(jié)合和催化部位，從而造成酶對(duì)底物的結(jié)合和催化能力的差異；PgsA的差異更加顯著，達(dá)到22%~35%，可能影響了γ-PGA的相對(duì)分子質(zhì)量大小和產(chǎn)量。但詳細(xì)的合成機(jī)制需要更多的研究來驗(yàn)證，如結(jié)合部位和催化部位如何起作用，關(guān)鍵的氨基酸有哪些，如何完成產(chǎn)物大分子的鏈接以及跨膜運(yùn)輸?shù)取?/p>

微生物合成產(chǎn)生γ-PGA是一個(gè)復(fù)雜的過程，在整個(gè)合成過程中，需要各種酶的參與，PgsBCA合成酶是其中最重要的酶，但影響菌株是否具有谷氨酸依賴性的酶不僅僅取決于PgsBCA合成酶，而與TCA循環(huán)中的酶、谷氨酸合成途徑相關(guān)的酶有關(guān)，要明確地了解菌株對(duì)谷氨酸底物的依賴性需要更多關(guān)于整個(gè)合成途徑生物學(xué)信息的了解和分析，如對(duì)TCA循環(huán)α-KG支路相關(guān)的酶以及谷氨酸合酶、氨基轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺酶等的研究，同時(shí)也需要更多的其它產(chǎn)γ-PGA菌株的基因信息進(jìn)行比對(duì)研究，從而全面的了解γ-PGA在各菌株中的合成機(jī)制。

表2 產(chǎn)γ-PGA菌株的pgsBCA基因和相應(yīng)的合成酶序列的比較Table 2 Comparison of the pgsBCA genes and PgsBCA synthetase complex of SK19.001 with those of other γ-PGA producing strains

3 結(jié)語(yǔ)

通過基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增得到非谷氨酸依賴型 γ-PGA產(chǎn)生菌株 B.methylotrophicus SK19.001 pgsBCA合成酶基因序列。利用該合成酶基因構(gòu)建了表達(dá)載體pET-28a-pgs并成功導(dǎo)入宿主E.coli BL21，分別使用L-谷氨酸和葡萄糖作為碳源培養(yǎng)36 h，分別得到0.65 g/L和0.45 g/L的γ-PGA。說明pgsBCA合成酶基因?qū)τ贐.methylotrophicus SK19.001產(chǎn)γ-PGA是必需的。

將pgsBCA合成酶基因和相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì)與GenBank中已獲得的其它γ-PGA產(chǎn)生菌的酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)谷氨酸依賴型菌株之間pgsBCA合成酶基因相似性非常高，同樣非谷氨酸依賴型菌株之間pgsBCA合成酶基因相似性也非常高，但依賴型和非依賴型菌株之間的pgsBCA合成酶基因相似性卻較低，說明pgsBCA合成酶基因與菌株的谷氨酸依賴性有一定的關(guān)系；pgsB和pgsC在不同菌株中具有更高的一致性，而pgsA序列一致性較低，這可能導(dǎo)致了不同菌株相對(duì)分子質(zhì)量和產(chǎn)量的不同。

[1]ASHIUCHI M.Occurrence and biosynthetic mechanism of poly-gamma-glutamic acid[M].Berlin Heidelberg：Springer，2010：77-93.

[2]SHIH I L，Van Y T.The production of poly-（γ-glutamic acid）from microorganisms and its various applications[J].Bioresource Technology，2001，79（3）：207-225.

[3]KUNIOKA M.Biosynthesis of poly（gamma-glutamic acid）from L-glutamine，citric acid and ammonium sulfate in Bacillus subtilis IF03335[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1995，44（3-4）：501-506.

[4]TROY F A.Chemistry and biosynthesis of the poly （γ-d-glutamyl）capsule in Bacillus licheniformis properties of the membrane-mediated biosynthetic reaction[J].Journal of Biological Chemistry，1973，248（1）：305-315.

[5]KUNIOKA M，GOTO A.Biosynthesis of poly（gamma-glutamic acid）from L-glutamic acid，citric-acid，and ammonium-sulfate in Bacillus-Subtilis IFO3335[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1994，40（6）：867-872.

[6]PENG Y，JIANG B，ZHANG T，et al.High-level production of poly（γ-glutamic acid）by a newly isolated glutamate-independent strain，Bacillus methylotrophicus[J].Process Biochemistry，2015（3）：329-335.

[7]CAO M，GENG W，LIU L，et al.Glutamic acid independent production of poly-γ-glutamic acid by Bacillus amyloliquefaciens LL3 and cloning of pgsBCA genes[J].Bioresource Technology，2011，102（5）：4251-4257.

[8]SAMBROOK J，RUSSEN D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）[M].黃培堂，等譯.北京：科學(xué)出版社，2002（9）：95-99.

[9]曹慧萍，鄭璞，唐云平，等.谷氨酸棒桿菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表達(dá)及固定化 [J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2016（8）：883-889. CAO Huiping，ZHENG Pu，TANG Yunping，et al.Cloning，expression and immobilization of glutamine synthetase from Corynebacterium glutamicum[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2016（8）：883-889.（in Chinese）

[10]PENG Yingyun，ZHANG Tao，MU Wanmeng，et al.Intracellular synthesis of glutamic acid in Bacillus methylotrophicus SK19. 001，a glutamate-independent poly（γ-glutamic acid）-producing strain[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2016（1），66-72.

[11]曹名鋒.微生物合成γ-聚谷氨酸及其分子生物學(xué)研究[D].天津：南開大學(xué)，2011.

[12]江昊.聚-γ-谷氨酸在枯草芽胞桿菌和大腸桿菌中的生物合成[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[13]ASHIUCHI M，NAWA C，KAMEI T，et al.Physiological and biochemical characteristics of poly gamma-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis[J].European Journal of Biochemistry，2001，268（20）：5321-5328.

[14]ASHIUCHI M，NAKAMURA H，YAMAMOTO T，et al.Poly-γ-glutamate depolymerase of Bacillus subtilis：production，simple purification and substrate selectivity[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，23（2）：249-255.

Cloning and Expression of Poly-γ-Glutamic Acid Synthase Gene of Bacillus methylotrophicus

PENG Yingyun1，2， ZHANG Tao2， JIANG Bo*2， MU Wanmeng2， MIAO Ming2
（1.School of Marine and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224003，China；
2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The poly-γ-glutamic acid （γ-PGA） synthase gene pgsBCA ofa glutamic acid-independent γ-PGA producing strain Bacillus methylotrophicus SK19.001 was cloned and expressed in the Escherichia coli.The pET-28a-pgs vector harboring pgsBCA genes were constructed and transformed into E.coli BL21.E.coli BL21 could synthesize γ-PGA when cultivated in the flask culture of LB plus glucose and L-glutamate，respectively.The pgsBCA genes were proved be essential for the synthesis of γ-PGA in B.methylotrophicus SK19.001.The blast result of deduced amino acid sequence from the pgsBCA genes in SK19.001 comparing other reported strains showed that the pgsB and pgsC gene were relatively conservative gene for pgsBCA.

Bacillus methylotrophicus，glutamic acid-independent，poly-γ-glutamic acid synthase gene，cloning and expression

Q 812

A

1673—1689（2016）12—1253—07

2015-01-22

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102102）。

彭英云（1976—），女，江蘇無(wú)錫人，工學(xué)博士，講師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。E-mail：xying8@126.com

*通信作者：江 波（1962—），男，江蘇無(wú)錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶學(xué)方面的研究。E-mail：bjiang@jiangnan.edu.cn