付曉森，劉鳳軍，張玉玲，董文亞，李毅恒，劉向陽

(河南科技大學，河南洛陽 471003)

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誘導多能干細胞治療動物骨骼病的研究進展

付曉森，劉鳳軍*，張玉玲，董文亞，李毅恒，劉向陽

(河南科技大學，河南洛陽 471003)

摘要:由于骨骼疾病恢復所需時間較長、動物不配合治療等原因，給動物骨骼疾病治療帶來了較大困難，縮短治療周期將會大大提高動物骨骼疾病治療的成功率，而傳統(tǒng)方法已無法再超越目前的治療周期。誘導多能干細胞(IPS)具有強大的增殖和分化能力，可分化為修復骨骼病所需的多種細胞以及細胞因子等，這為加速動物骨骼疾病痊愈帶來了新的希望。論文對IPS的研發(fā)歷程及優(yōu)勢，IPS向骨細胞分化，IPS在治療骨骼病中的應用等方面進行了綜述，并對其治療動物骨折的前景進行了展望。

關鍵詞:多能干細胞；誘導分化；動物骨骼疾病；骨細胞；治療

以動物骨折為代表的動物骨骼病在畜牧生產和獸醫(yī)臨床上非常常見，對于一般性生產動物可以選擇直接淘汰，但對于具有較高價值的珍稀野生動物、種畜、特種經濟動物、寵物等要進行積極治療。骨折是指骨結構的連續(xù)性完全或部分斷裂。骨折會給患者帶來極大疼痛，并影響其正常生活，嚴重者會造成殘疾(如體態(tài)畸形、肢體殘缺等)[1]，甚至危及生命。骨折若經及時恰當處理，多數(shù)病例能恢復原來的功能，少數(shù)病例可能遺留不同程度的后遺癥(如關節(jié)僵硬或強直等)。

動物不愿配合治療及骨折愈合所需時間較長都嚴重影響動物骨折的治療效果。隨著人類醫(yī)學的發(fā)展，許多治療骨折的理論、方法、技術已廣泛應用到動物骨折治療中，如外固定技術和內固定技術。外固定具有固定可靠、骨折愈合快、功能恢復好、治療費用低、并發(fā)癥少等優(yōu)點，但固定太松或固定墊使用不當易出現(xiàn)骨折再移位，固定太緊可導致壓迫性潰瘍、缺血性肌痙攣，甚至肢體壞疽；內固定主要用于切開復位后，采用金屬內固定物，將骨折斷端復位后予以固定，優(yōu)點是可以較好地保持骨折的解剖復位，缺點是固定物屬機體異物，在其下面及周圍易發(fā)生骨質疏松或者松動，且一旦感染，將會嚴重地阻礙傷口和骨折愈合。同時，安置內固定物時，需廣泛剝離軟組織和骨膜，影響血液運輸，延遲骨折愈合。此外，在骨折治療過程中，動物常掙扎反抗，不配合治療，這使得獸醫(yī)不得不把骨折部位固定相對牢固，這可造成骨折延遲愈合或不愈合及恢復期內因缺乏活動導致的肌肉萎縮。即使把骨折處固定好后，動物也會隨著機體恢復而抓、啃、蹭骨折固定部位，影響骨折愈合效果。因此，如何加速動物骨折愈合對獸醫(yī)來說也是一個難題。

干細胞研究為加速骨折愈合帶來了新希望。干細胞具有強大的再生、分化能力，可以分化成多種類型的細胞及組織器官，其中包括骨細胞及軟骨組織。干細胞之所以能加速骨折愈合，是因為它可以加速修復損傷的骨組織或分化成骨組織，然后通過移植替代相應的受損骨組織，進而使機體恢復到受傷前的狀態(tài)[2-5]。目前已知胚胎干細胞(embryonic stem cells,ES)、間充質干細胞等干細胞可以修復骨骼，而最近興起的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，IPS)除了可以分化出多種類型細胞和一些組織外也具有同樣的修復能力。論文就近年來國內外在IPS向骨細胞分化及其在骨骼病的研究應用進行了綜述和展望。

1IPS研究概況

IPS是通過采用導入外源基因的方法使體細胞去分化為多能干細胞，具有與ES相似的細胞全能性，在一定條件下，可分化為多種功能細胞或組織器官。最早由日本的兩位科學家Yamanaka K和Takahashi S于2006年報道的[6]，他們把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4這4種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)可誘導其發(fā)生轉化，產生的IPS細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與ES相似。與ES相比，IPS不會面臨長期困擾ES研究與應用在法律、倫理道德等方面的問題，由于是使用同一機體的細胞進行誘導分化移植因而基本不會產生免疫排斥反應；與成體干細胞相比，IPS來源廣泛、取材方便，并且可以向更多細胞類型、更廣方向分化。可見，IPS可謂是集ES與成體干細胞的優(yōu)點于一體。

IPS給再生醫(yī)學和臨床治療疾病帶來了新希望。Karumbayaram S等用IPS首次分化出人運動神經細胞。之后，科學家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)IPS還可分化為血小板、抗癌細胞、胰腺、色素細胞、軟骨組織、牙齒等[7-8]。最令人驚喜的是IPS的四倍體補償試驗和利用IPS克隆出活體試驗小鼠，這證明IPS與ES一樣具有全能性，同時也為IPS臨床應用的研究注入了新的活力[9]。這些研究表明，IPS有修復動物骨折的潛能。

2IPS向骨細胞分化

IPS通過誘導分化出與骨發(fā)育密切相關的因子或細胞，在骨折修復中起促進作用。骨組織中的成骨蛋白、骨鈣蛋白、骨粘連蛋白與骨發(fā)育、骨修復密切相關；同時，骨細胞中的成骨細胞和破骨細胞是參與骨形成(即骨化)的主要細胞。調控成骨細胞發(fā)育的轉錄因子主要有Sox9、Runx2、Dlx5、Twist1等，調控破骨細胞發(fā)育的轉錄因子主要有RANKL、M-CSF、PU.1、MITF、c-FOS等，這些轉錄因子調控成骨細胞和破骨細胞偶聯(lián)，在骨發(fā)育、骨重塑、骨修復的全過程中都是非常重要的[10]。

學者們在這方面進行了嘗試，并取得了一定成果。2011年，Bilousova G等利用IPS技術成功地分化出小鼠軟骨細胞。2012年，Hayashi T等發(fā)現(xiàn)IPS向骨分化過程的第3周骨鈣蛋白表達最高。2014年，Phillips M D等[11]讓IPS分別在體內和體外向骨細胞分化，結果顯示都可以向骨細胞分化。

TheinHan W等先將IPS分化為間充質干細胞，然后使用分化劑誘導其向骨分化，結果發(fā)現(xiàn)有肌動蛋白纖維表達、成骨細胞存在并有礦化基質形成。任秋穎等[12]在小鼠IPS骨向分化過程中添加成骨蛋白7(BMP7)，結果發(fā)現(xiàn)試驗組的礦化結節(jié)率明顯增高。 Kato H[13]的課題組把1,25-二羥基維生素D3加到IPS向骨細胞分化培養(yǎng)液中，6 d后觀察有成骨細胞出現(xiàn)。伊朗醫(yī)學家Ardeshirylajimi A和Soleimani M[14]把將要向骨細胞分化的IPS放到極低頻電磁場(50 Hz)下進行培養(yǎng)，一段時間后用MTT法測定發(fā)現(xiàn)，被標記的堿性磷酸酶(ALP)活性增強、鈣物質沉積增多，同時發(fā)現(xiàn)在一定范圍內適當增加極低頻電磁場強度，以上指標會有所提高。這些研究為IPS向骨細胞分化提供了新方法、新思路，為后續(xù)相關研究奠定了基礎。

3干細胞治療骨骼病

干細胞治療是把健康的干細胞移植到病人或自己體內，以達到修復病變組織器官或重建功能正常的組織器官的目的。干細胞療法就像給機體注入新的活力，是從根本上治療許多疾病的有效方法。干細胞治療最早始于1956年，美國醫(yī)生Thomas E D應用雙胞胎間的骨髓移植成功地治療了白血病，開啟了干細胞治療疾病的新時代。到目前為止，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)干細胞可以改善心臟功能、治療Ⅰ型糖尿病[15]、緩解帕金森癥狀、修復視網膜[16]等。這些臨床試驗為干細胞應用于臨床打下了基礎。

干細胞治療骨骼疾病的探索始于20世紀末，并取得了初步的成果。1991年Connolly J F利用自體骨髓血移植成功治療了脛骨骨折遷延不愈； 1999年Horwitz E M等通過自體骨髓間充質細胞移植治療兒童成骨不全癥，取得了不錯的效果。2003年Tsuchida H等[2]從大鼠體內提取間充質干細胞并對其成骨蛋白2基因進行了修飾，然后將其應用于有股骨節(jié)段性缺陷的大鼠，結果顯示大鼠的股骨得到了修復。這為同種異體動物間進行干細胞治療骨折提供了科學依據，開辟了干細胞治療骨骼疾病的新紀元。

2011年Xue G等將培養(yǎng)純化好的臍帶間充質干細胞，通過靜脈注射的方式輸入有骨折不愈合和神經受損的患者體內，治療2個月后患者骨折處有愈合并對外界反應變得靈敏，1年后對患者進行隨訪觀察，基本沒有副作用。2012年Obermeyer T S等探討了濫用酒精和靜脈注射間充質干細胞對小鼠脛骨骨折模型骨折愈合的影響，結果發(fā)現(xiàn)，濫用酒精會明顯降低骨折的修復速度，但應用間充質干細胞治療可以提高其修復速度。2015年Wang P等[17]對IPS、骨髓間充質干細胞和臍帶干細胞向骨分化能力的比較，將上述3種干細胞分別移植到顱骨缺損的不同大鼠身上，12周后對長出的骨面積分析比較，結果顯示差異不顯著，說明這3種干細胞向骨分化的能力相當。

近年來，新型材料與干細胞結合應用到骨折治療研究上。Kingham E[18]研究團隊在塑性材料表面上培養(yǎng)人ES并評估其向骨細胞分化的能力，以期將來把塑性材料和培養(yǎng)好的細胞直接作用到骨折處修復損傷。Bradley F等[19]發(fā)明了一種剛硬輕型塑料，其可被患者自己的干細胞植入附著，并生長出新的骨細胞，這種塑料會隨著新的骨組織生長逐漸地發(fā)生降解而被替換，這種方法將來很可能用來治療粉碎性骨折。

4IPS治療骨骼病

IPS誘導分化為間充質干細胞后，能夠間接用于骨組織的再生與修復。骨是由胚胎時期的間充質細胞分化發(fā)育來的，很多試驗已經證明，間充質干細胞可以分化為骨系細胞并形成軟骨和骨[20]，有些試驗成果已經應用于臨床治療。

目前，獸醫(yī)臨床上用于治療骨骼疾病的干細胞主要是間充質干細胞，而且取得了不錯的成績[21]。由于間充質干細胞來源有限、傳代后分化能力減弱，推廣應用受到限制。而IPS分化為間充質干細胞，為其間接向骨系細胞分化注入了活力，有試驗證明源于IPS的間充質干細胞比直接從骨髓獲取的間充質干細胞更有活力，并且一樣可以分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。另有試驗報道[22]， IPS分化成間充質干細胞后，將其移植到有牙周缺陷的小鼠體內，隨后發(fā)現(xiàn)移植部位有礦化組織形成，這為IPS分化為間充質干細胞后治療骨折開辟了新思路。

對于該領域的研究，值得一提的是2012年美國科學家Diekman B O等[5]利用IPS技術在體外培養(yǎng)下分化出軟骨組織。他們先建立了體外軟骨缺損模型，然后把導入有綠色熒光蛋白(GFP)基因的IPS進行骨化培養(yǎng)，隨后將培養(yǎng)的細胞移植到軟骨缺損模型上。21 d后，通過觀察綠色熒光蛋白確定有軟骨基質生成與集合，軟骨缺損部位周圍出現(xiàn)軟骨組織。這是科學家首次利用IPS技術獲得的成型骨結構。

IPS分化為成型再生器官——牙齒。2013年中國科學家成功利用人尿液IPS獲得了再生牙齒[23]。他們首先把ifhU-iPSCs(人的IPS)分化上皮細胞,并與牙齒缺失老鼠的牙間質結合。3周后有30%的老鼠牙間質出現(xiàn)牙齒結構，進一步研究發(fā)現(xiàn)分化出的牙齒擁有與人類牙齒相似的結構和硬度。這是科學家首次利用人IPS獲得成型的再生器官，為將來IPS技術應用于器官再生奠定了基礎。

5展望

雖然IPS技術在向骨細胞分化方面取得了一定的成果[24]，尤其是在軟骨受損和骨關節(jié)炎研究方面。但是還存在一些問題，如IPS面臨沒有統(tǒng)一規(guī)范的誘導步驟、誘導率低、可能形成腫瘤、帶有表觀遺傳記憶、基因組不穩(wěn)定等[25]，但其在治療動物疾病的應用上前景廣闊。

首先，可操作性較強。目前干細胞治療在醫(yī)學上取得了一定的成果，但由于缺乏統(tǒng)一治療標準和存在產生腫瘤的風險以及法律方面的限制，其在醫(yī)學上的應用和推廣受到限制。而動物方面面臨的問題相比要少得多：一方面，在進行動物治療前可以先用其他動物進行治療試驗，然后評價治療的效果和存在的風險，最后決定是否進行治療及如何進行治療；另一方面，動物治療涉及的法律問題較少、監(jiān)管相對寬松，方便進行試驗和治療。

其次，經濟效益前景廣闊。具有治療價值的動物除了野生動物和種畜外，另一個不容忽視的大群體就是寵物。隨著寵物飼養(yǎng)量的日益增多，車禍、打斗、高處墜落等原因造成的寵物骨折數(shù)量也在上升，開篇提到的動物骨折延遲愈合或不愈合問題在寵物上凸顯出來。在發(fā)達國家，有些動物醫(yī)院已經開始使用干細胞治療寵物骨骼疾病，且寵物恢復良好。據悉，一例寵物干細胞治療的費用大約在2 000元。截止2013年，中國寵物的數(shù)量大約有1.2億只，而且數(shù)量還在持續(xù)快速增長。而用傳統(tǒng)手術方法治療一例骨折的費用從1 500元到上萬元不等，因而干細胞治療的費用并不算高，而且與手術治療相比干細胞治療風險要小的多。大體估算目前我國寵物發(fā)生骨折的概率是千分之一，而采用干細胞治療骨折的概率是十分之一，那么每年至少可產生2 400萬元的經濟效益。隨著干細胞治療技術逐漸成熟，進行干細胞治療的動物會越來越多，而產生的經濟效益則會快速增長。

綜上所述，盡管目前IPS治療骨折的技術尚不成熟，存在著一些不足，但相信隨著ISP技術的發(fā)展，安全、高效的IPS技術治療動物骨折終將取得突破并實現(xiàn)臨床應用，同時也將產生巨大的經濟和社會價值。

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Progress on Treatment of Animal Orthopedic Diseases with Induced Pluripotent Stem Cells

FU Xiao-sen，LIU Feng-jun，ZHANG Yu-ling，DONG Wen-ya，LI Yi-heng，LIU Xiang-yang

(HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan,471003，China)

Abstract:Greater difficulties to treat animal orthopedic diseases were the longer recovery duration and uncooperative animals during treatment.Thus,shortening the treatment period may greatly improve the success rate of treatment of animal bone diseases,but traditional methods cannot exceed the current treatment cycle.Induced pluripotent stem cells (IPS) with a strong proliferation and differentiation can differentiate into a variety of cells and factors needed to repair bone disease,which bring new hope to accelerate healing of animal orthopedic diseases.This paper reviewed the research and development process of IPS,its advantages,differentiation into bone cells,and application to treat orthopedic diseases.Meanwhile,the paper also fores the prospects of IPS treatment for animal bone fracture.

Key words:pluripotent stem cell；induced differentiate；animal orthopedic disease；bone cell；treatment

文章編號:1007-5038(2016)03-0099-04

中圖分類號:S857.161

文獻標識碼:A

作者簡介：付曉森(1989-)，男，河南安陽人，碩士研究生，主要從事小動物疾病防治研究。*通訊作者

基金項目：國家自然科學基金項目(30901026);河南省高等學校青年骨干教師資助計劃項目(2010GGJS-071)

收稿日期：2015-07-20