楊鵬飛　解景東　楊寶山

?

·綜述·

基因治療急性肝衰竭研究進(jìn)展

楊鵬飛解景東楊寶山

急性肝衰竭(acute hepatic failure/ acute liver failure，AHF/ALF)是各種原因引起肝細(xì)胞壞死或大部分功能失常而導(dǎo)致肝功能衰竭的一種危重肝病的表現(xiàn)。臨床上主要為急性起病，2周內(nèi)出現(xiàn)Ⅱ度及以上肝性腦病(按Ⅳ度分類(lèi)法劃分)，并伴有以下表現(xiàn)[1]：①極度乏力，有明顯厭食、腹脹、惡心、嘔吐等嚴(yán)重消化道癥狀；② 短期內(nèi)黃疸進(jìn)行性加深；③出血傾向明顯，血漿凝血酶原活動(dòng)度(PTA)44%(或INR≥1．5)，且排除其他原因；④肝臟進(jìn)行性縮小。作為一項(xiàng)全球性疾病，其病因包括病毒性肝炎、藥物毒素中毒，遺傳代謝障礙、自身免疫異常及隱源性等等。我國(guó)作為病毒性肝炎發(fā)生大國(guó)，肝炎及藥物(含中草藥)是導(dǎo)致急性肝衰竭的主要病因[2]。在歐美國(guó)家，對(duì)乙酰氨基酚和苯丙香豆素等化學(xué)合成類(lèi)藥物是引起急性、亞急性肝衰竭的主要病因。數(shù)據(jù)顯示，在美國(guó)約50%的急性肝衰竭是由藥物所引起[3,4]。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，美國(guó)每10萬(wàn)人/年就有20例新發(fā)的因藥物所致的肝衰竭[5]。急性肝衰竭一旦發(fā)生，其病情進(jìn)展快，死亡率高，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。因此，如何對(duì)急性肝衰竭進(jìn)行干預(yù)治療，減少肝損害，提高生存率，改善預(yù)后，對(duì)提高公眾健康具有重大的科學(xué)意義和社會(huì)實(shí)用價(jià)值。

一、急性肝衰竭的現(xiàn)有治療方法

目前，對(duì)于急性肝衰竭的治療主要集中在以下幾個(gè)方面：藥物綜合治療、細(xì)胞因子治療(表皮生長(zhǎng)因子EGF、血小板生長(zhǎng)因子PLGF、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF、前列腺素E1、腫瘤壞死因子TNF等)、人工肝治療及肝移植等?，F(xiàn)階段，藥物綜合治療和人工肝治療仍然作為國(guó)內(nèi)治療的主要手段。國(guó)外則多以肝移植來(lái)治療本病，其近期療效明確而肯定，但遠(yuǎn)期療效因受免疫排斥反應(yīng)的制約而不容樂(lè)觀。肝臟移植盡管可以有效改善患者的肝臟功能，但因受手術(shù)復(fù)雜性、器官來(lái)源以及受供者長(zhǎng)期服用高額免疫抑制劑來(lái)避免排斥反應(yīng)發(fā)生所造成的高昂藥費(fèi)和長(zhǎng)期使用免疫抑制劑可能造成腎損害等因素的制約，限制了此療法的開(kāi)展。因此，尋找新方法提高肝細(xì)胞再生率、改善急性肝衰竭患者的預(yù)后，迫在眉睫。

二、基因治療在急性肝衰竭治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀

基因治療(gene therapy)的概念是由Szybalski等人在1962年通過(guò)發(fā)現(xiàn)Ca2+有刺激DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的作用而開(kāi)啟，由Nirenberg在1967年通過(guò)遺傳工程作為治療人類(lèi)疾病的手段而引出，指的是將人的正常基因或有治療作用的基因通過(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)。與常規(guī)治療方法不同，基因治療可針對(duì)疾病的根源——異常的基因本身進(jìn)行治療，因此在遺傳病(如血友病、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血癥等)、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、類(lèi)風(fēng)濕等)等各類(lèi)疾病的研究領(lǐng)域中，基因治療均發(fā)揮了巨大的潛能和科研前景。在應(yīng)用基因治療進(jìn)行肝衰竭的各項(xiàng)基礎(chǔ)研究中，具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)逐漸進(jìn)入研究者的視野。早在1968年，F(xiàn)riendenstein等[6]首先發(fā)現(xiàn)在塑料培養(yǎng)皿中的貼壁非造血骨髓單核細(xì)胞具有多分化潛能。1984年Owen[7]首先將來(lái)源于骨髓，能自我復(fù)制并分化為數(shù)種間充質(zhì)組織的細(xì)胞命名為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員之一，屬于中胚層的一類(lèi)多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。正是由于其具有多向分化潛能，擴(kuò)增迅速，低免疫原性，取材方便，遺傳背景穩(wěn)定，并易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)等特點(diǎn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞日益受到人們的關(guān)注，并逐漸在基因治療、組織修復(fù)等方面發(fā)揮了其廣泛的應(yīng)用前景[8,9]?，F(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡[10]。目前，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕蛐揎棧怪弑磉_(dá)靶基因，是基因治療的一種策略。眾所周知，肝臟是機(jī)體具有強(qiáng)大再生能力的臟器。因而，在急性肝衰竭治療中，如果能利用MSCs的特點(diǎn)和特異性的肝再生調(diào)控因子聯(lián)合作用，在基因水平上調(diào)控和促進(jìn)肝細(xì)胞分裂、修復(fù)，將有望最大程度的改善急性肝衰竭患者的預(yù)后。

(一)肝再生增強(qiáng)因子

肝再生增強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration，ALR)是1994年Hagiya從乳鼠肝臟中分離出一種能促進(jìn)肝臟再生的物質(zhì)，并成功克隆了它的cDNA[11]。不同種屬的ALR均由125個(gè)氨基酸殘基所組成，其開(kāi)放讀碼框(ORF)由375個(gè)核苷酸組成。哺乳動(dòng)物ALR與釀酒酵母菌(S.cerevisiae)表達(dá)的蛋白有約40%的同源性[12]，因而也被稱(chēng)為S.cerevisiae的生長(zhǎng)因子(essential for respiration and viability， ERV1)同源物。ALR又被稱(chēng)為肝細(xì)胞刺激物(HSS)或者肝細(xì)胞生成素(HPO)，是一種特殊的促肝細(xì)胞分裂原。與一些同樣具有肝再生相關(guān)因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor, HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(Transforming growth factor, TGF-α)、表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor, EGF)不完全相同[13]，它調(diào)節(jié)線粒體的生成、細(xì)胞分裂周期，并與肝臟、睪丸等重要臟器發(fā)育有關(guān)，最主要的是能特異的刺激肝源細(xì)胞的增殖，在肝損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在某種病理?xiàng)l件下，血清ALR水平的改變甚至可以作為肝損傷/疾病的診斷標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)證明，在CCl4誘導(dǎo)的ACLF大鼠中，ALR血清水平明顯升高，ACLF初期高水平ALR與較好的預(yù)后有關(guān)[14]。許多研究認(rèn)為，ALR以自分泌或旁分泌方式通過(guò)刺激EGF及ERK1/2和 Akt/PKB受體酪氨酸磷酸化，繼而活化分裂原活化激酶而激活人肝細(xì)胞增殖[15]。ALR也可能通過(guò)影響NF-κB、細(xì)胞色素P-450、c-Myc 和多胺等合成而影響肝細(xì)胞增殖[16]。因此，基于其特殊的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和多種生物學(xué)活性，使得該因子倍受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者的親睞。ALR完全有可能成為治療急性肝衰竭的重要手段之一。新近的研究也證實(shí)，ALR可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和免疫排斥而發(fā)揮與自體細(xì)胞肝移植的協(xié)同作用，提高急性肝衰竭小鼠的生存率[17]。

(二)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF，也稱(chēng)為VEGF-A)是1989年Gospodarowicz等[18]從牛的垂體濾泡細(xì)胞中分離出一種能選擇性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)。隨后，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了VEGF的其他家族成員：VEGF-B、C、D和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PLGF)。人的VEGF基因最先從人白血病HL-60細(xì)胞系中克隆出來(lái)，定位于6p21.3，有8個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子，其mRNA通過(guò)不同的剪切方式編碼5中不同的VEGF，分別由121、145、165、189和206個(gè)氨基酸組成，其中VEGF121和VEGF165為分泌型細(xì)胞因子，具有促進(jìn)新生血管形成的活性。VEGF189、VEGF206及少量VEGF165與硫酸乙酰肝素具有親和力而存在于細(xì)胞內(nèi)。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，二條分子量各為24kDa的單鏈以二硫鍵組成二聚體。隨著人們對(duì)VEGF深入了解，發(fā)現(xiàn)在成人和動(dòng)物的正常組織中VEGF合成很少，但在胎兒、胎盤(pán)、黃體及大部分人類(lèi)腫瘤等存在血管新生的組織中高表達(dá)。眾所周知，血管形成是所有器官再生、創(chuàng)傷愈合、功能恢復(fù)的基本條件。急性肝衰竭時(shí)，肝細(xì)胞大塊壞死，肝血竇塌陷。肝功能的恢復(fù)不僅需要肝細(xì)胞的再生，且依賴(lài)肝血竇等結(jié)構(gòu)的重建。肝細(xì)胞再生、肝血竇重建，是決定急性肝衰竭患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。實(shí)質(zhì)上，殘余肝細(xì)胞再生不充分是ALF患者死亡的主要原因。因此，肝細(xì)胞再生和血管形成關(guān)系密切。在所有的調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)的因子中, VEGF是血管生成過(guò)程中最重要的因子[19]。在肝衰竭患者的肝細(xì)胞再生和修復(fù)中，是否有VEGF的參與，逐漸受到了科研人員的關(guān)注。Dfixler等[20]認(rèn)為肝細(xì)胞再生是肝內(nèi)血管形成的伴隨現(xiàn)象。Maximilian等研究發(fā)現(xiàn)VEGF可以明顯增加微血管密度及直徑，可能通過(guò)刺激肝細(xì)胞HGF、IL-6、Ki-67的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，恢復(fù)肝功能[21-23]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者對(duì)ALF大鼠肝殘存組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGF高表達(dá)，也側(cè)面驗(yàn)證了VEGF作為肝細(xì)胞再生不可或缺的因子發(fā)揮了重要作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)VEGF參與ALF的肝細(xì)胞修復(fù)和再生的機(jī)制研究甚少。而以VEGF作為靶基因通過(guò)MSCs進(jìn)行ALF的干預(yù)治療尚未開(kāi)展?；蛑委熞云淞己玫陌邢蛐詮V泛應(yīng)用于臨床，而MSCs不僅易于外源性基因的導(dǎo)入，而且轉(zhuǎn)染率高并能穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因，是基因治療的良好細(xì)胞載體。兩者的結(jié)合可優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，既可以利用基因載體擴(kuò)大干細(xì)胞的用途以治療更多的疾病，又可以避免單純基因治療的缺陷，具有安全 、穩(wěn)定而高效地表達(dá) 、不引起免疫反應(yīng) 、可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)。最近研究表明，MSCs不僅能夠分泌VEGF，且經(jīng)VEGF基因修飾的MSCs具有心肌保護(hù)作用[33]。因此，MSCs成為細(xì)胞移植和基因治療中理想的載體細(xì)胞。

三、總結(jié)

近年來(lái)干細(xì)胞移植及基因治療研究取得很大進(jìn)展，將二者綜合利用有望成為治療ALF的另一種有效手段。由于肝臟的再生潛力很大，移植干細(xì)胞所提供的暫時(shí)、有效的肝功能支持，為受體肝臟的再生恢復(fù)贏得了時(shí)間，從而可使ALF患者有時(shí)間等待肝移植，甚至避免肝移植。而進(jìn)一步研究ALF干細(xì)胞移植后的肝再生及機(jī)制，探討其影響因素，對(duì)干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用亦具有重要的意義。

[1]肝衰竭診治指南(2012年版).中華臨床感染病雜志, 2012, 5: 321-327.

[2]Zhao P, Wang C, Liu W, et al. Causes and outcomes of acute liver failure in China. PLoS One, 2013, 8: e8099.

[3]Ostapowicz G, Fontana RJ, Schiodt FV, et al. Results of a prospective study of acute liver failure at 17 tertiary care centers in the United States. Ann Intern Med, 2002, 137: 947-954.

[4]Reuben A, Koch DG, Lee WM. Drug-induced acute liver failure: results of a U.S. multicenter, prospective study. Hepatology, 2010, 52: 2065-2076.

[5]Leise MD1, Poterucha JJ2, Talwalkar JA2.Drug-induced liver injury. Mayo Clin Proc, 2014, 89: 95-106.

[6]Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.Transplantation, 1968, 6: 230-247.

[7]Owen M.Marrow stromal stem cells.J Cell Sci Suppl, 1988, 10: 63-76.

[8]Lee SH, Jang AS, Kim YE, et al. Modulation of cytokine and nitric oxide by mesenchymal stem cell transfer in lung injury/fibrosis. Respir Res, 2010, 11:16.

[9]Mader EK, Maeyama Y, Lin Y, et al. Mesenchymal stem cellcarriers protect oncolytic measles viruses from antibody neutralization in an orthotopic ovarian cancer therapy model.Clin Cancer Res, 2009, 15: 7246-7255.

[10]van Poll D, Parekkadan B, Cho CH, et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo.Hepatology, 2008, 47: 1634-1643.

[11]Hagiya M, Francavilla A, Polimeno L, et al. Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration(ALR) gene: expression of biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution. Proc Natl Acad Sci USA,1994, 91: 8142-8146.

[12]Lisowsky T, Weinstat-Saslow DL, Barton N, et al. A new human gene located in the PKD1 region of chromosome 16 is a functional homologue to ERV1 of yeast. Genomics, 1995, 29: 690-697.

[13]Morley CG, Kingdon HS: The regulation of cell growth. I. Identification and sect1ial characterization of a DNA synthesis stimulating factor from the serum of sect1ially hepatectomized rats. Biochim Biophys Acta,1973, 308: 260-275.

[14]Hongbo S, Yu C, Ming K, et al. Augmenter of liver regeneration may be a candidate for prognosis of HBV related acute-on-chronic liver failure as a regenerative marker. Hepatogastroenterology, 2012, 59: 1933-1938.

[15]Ilowski M, Putz C, Weiss TS, et al. Augmenter of liver regeneration causes different kinetics of ERK1/2 and Akt/PKB phosphorylation than EGF and induces hepatocyte proliferation in an EGF receptor independent and liver specific manner. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 394: 915-920.

[16]Dayoub R, Thasler WE, Bosserhoff AK,et al. Regulation of polyamine synthesis in human hepatocytes by hepatotrophic factor augmenter of liver regeneration. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345:181-187.

[17]Wang N, Wang Z, Sun H, et al. Augmenter of liver regeneration improves therapeutic effect of hepatocyte homotransplantation in acute liver failure rats. Int Immunopharmacol, 2013, 15: 325-332.

[18]Tischer E, Gospodarowicz D, Mitchell R, et al. Vascular endothelial growth factor: a new member of the platelet-derived growth factor gene family. Biochem Biophys Res Commun, 1989, 165: 1198-1206.

[19]Ribatti D. The crucial role of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor in angiogenesis: a historical review. Br J Haematol, 2005, 128: 303-309.

[20]J Bal-Price A, Brown GC. Nitric oxide-induced necrosis and apoptosis in PC12 cells mediated by mitochondria. J Neurochem, 2000, 75: 1455-1464.

[21]LeCouter J, Moritz DR, Li B, et a1. Angiogenesis-independent endothelial protection of liver:role of VEGFR-1. Science, 2003, 299: 890-893.

[22]Dong XL, Wang SG, Zhang YJ, et al. VEGF enhances serum levels of HGF and IL-6 in rats following 50 percent sect1ial liver transplantation.Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 2003, 11: 1037-1039.

[23]Bockhorn M, Goralski M, Prokofiev D, et al. VEGF is important for early lier regeneration after sect1ial hepatectomy. J Surg Res, 2007, 138: 291-299.

(本文編輯：張苗)

2016-01-05)

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(D201106)面上項(xiàng)目

150086哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院傳染科

楊寶山，Email：baoshanyang@126.com