陳沖　張毅　卓其斌　陳良

?

·綜述·

乙型肝炎核心抗體定量檢測的研究進展

陳沖張毅卓其斌陳良

據(jù)WHO統(tǒng)計，世界上有超過20億HBV感染者和大約3.78億慢性HBV患者，每年大約450萬HBV新發(fā)感染[1]。我國是HBV感染的中高流行區(qū)，2006年全國乙肝血清流行病學調查結果顯示，我國的慢性HBV攜帶率為7.18%，而乙型肝炎一旦慢性化后，10%～20%可發(fā)展為肝硬化，部分轉變?yōu)橹匦透窝?、肝衰? 1%～5%可演變?yōu)楦伟┒＜吧黐2]。由此看來，優(yōu)化乙型病毒性肝炎HBV的診治是一項非常重要和艱巨的任務。

乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)是乙型肝炎核心抗原(HBcAg)對應的抗體，HBcAg在乙型肝炎病毒感染后即可編碼產(chǎn)生，其免疫原性極強，在急性乙型肝炎早期即可達高峰值，HBcAg感染的肝細胞是細胞免疫效應攻擊的靶細胞，故HBcAg含量與肝臟損害程度相關，也是HBV病毒復制的有力證據(jù)。HBcAg主要存在于肝細胞內(nèi)和血清Dane顆粒中，HBcAg與抗-HBc具有很強的親和力，能迅速結合形成免疫復合物，故難以在血清中測得游離的HBcAg，所以臨床上以檢測抗-HBc來間接反應HBcAg水平[3-5]。然而既往研究中對抗-HBc的檢測均采用競爭抑制法和間接法，其檢測敏感度和特異度欠佳，臨床應用價值有限[6]。近年來，隨著抗-HBc檢測方法學的進展，抗-HBc水平定量分析的臨床價值已受到越來越多關注。本文就目前抗-HBc定量對乙型肝炎的臨床診斷、治療效果評價等相關研究進展及臨床意義進行如下綜述。

一、抗-HBc檢測方法學研究進展

(一)酶聯(lián)免疫吸附法測定(ELISA)實驗室檢測HBV血清標志物的方法很多，其中以酶聯(lián)免疫吸附法最為常見。雖然ELISA試劑盒的靈敏度和特異性較好，但比較耗時、過程較為復雜、且價格相對昂貴[7]。近年來開發(fā)了一種新型的雙抗原夾心ELISA檢測抗-HBc，其原理為應用重組乙型肝炎核心抗原(rHBcAg)固定在固相載體上，并結合辣根過氧化物酶(HRP-HBcAg)進行檢測，rHBcAg在大腸桿菌中表達，利用單克隆抗體特異的親和層析來純化，其純度和特性通過SDS-PAGE，Western印跡和ELISA分析獲得，蛋白濃度的測定以牛血清白蛋白為標準來分析，純化的rHBcAg與HRP偶聯(lián)以獲得捕獲抗-HBc的能力，此雙抗原夾心ELISA相當于半定量測定血清中抗-HBc，實驗用血清樣本從地區(qū)醫(yī)院采集，可靠性高，通過平行對照來比較競爭性ELISA與雙抗原夾心ELISA測定抗-HBc的特異性和敏感性，結果顯示，雙抗原ELISA獲得98.4%的良好檢測效果，比競爭性ELISA表現(xiàn)更敏感[8]。然而ELISA這種半定量檢測特異性抗體的方法只涉及總抗體活性的檢測(相當于簡單的定性)，而對抗體親和力或抗體含量的分析遠遠不夠，尤其是當需要定量抗-HBc評估患者的免疫狀態(tài)時，精確的定量檢測方法顯得更為重要，故此雙抗原夾心ELISA檢測法的應用存在一定局限性。

(二)化學發(fā)光免疫微粒分析法(CMIA)化學發(fā)光免疫微粒分析法進行抗-HBc定量測定在實驗室應用也逐漸增多，是利用化學發(fā)光劑直接標記抗體的免疫分析方法，以HRP為標記酶，HRP與待測抗-HBc的血清樣本加入到固相載體上，通過抗原抗體特異性結合來測定抗-HBc，再加入發(fā)光底液后由化學反應釋放的自由能激發(fā)中間體，從基態(tài)回到激發(fā)態(tài)，能量以光子的形式釋放，將微孔板置入分析儀內(nèi)，通過儀器內(nèi)部的三維傳動系統(tǒng)，依次由光子計數(shù)器讀出光子數(shù)，抗-HBc濃度根據(jù)標準品建立的數(shù)學模型進行定量分析。具體操作即可在連續(xù)稀釋的樣本中檢測抗-HBc活性、定量抗-HBc含量以及比較抗-HBc親和力。以樣本對臨界值(光譜)比值(S/CO)作為量化指標，將稀釋倍數(shù)對數(shù)轉換成具有線性關系的算術數(shù)值(如2,20,200轉化成0.301,1.301,2.301等)，以各稀釋標本檢測的臨界值作為X軸，對數(shù)轉化后的計算值作為Y軸，進行實驗數(shù)據(jù)的擬合，通過受試者特征曲線來記錄各稀釋樣本的量化值[9-10]。這項檢測技術的使用大大節(jié)省了臨床及科研工作者的操作步驟，因為在以往的檢測方法中，抗-HBc活性在抗體濃度不同的樣本中測量單位不同，其中高濃度和低濃度的血清樣本需分別進行計算，而在此項技術中，不同濃度樣本檢測值的比率能夠反映抗體的親和力，避免進一步建立復雜的數(shù)學建模，簡化了實驗操作，且通過ROC分析，也可以間接得出抗-HBc抗體的具體含量。利用統(tǒng)計學軟件SPSS來分析，在確定檢驗標準后，比較數(shù)據(jù)可以觀察到抗-HBc抗體活性、親和力、抗體含量有一定的關聯(lián)性，且抗-HBc與ALT，HBV DNA之間也存在一定相關性，這也表明CMIA用于抗-HBc檢測在臨床上可能具有更大的實用性。當然也有研究人員認為，對HBeAg陰性慢性HBV感染患者來說，不應首選CMIA，除非有確切的肝炎病毒活動或者復制的證據(jù)，這種情況下，抗-HBc IgM抗體應該由微粒酶免疫測定(MEIA)量化[11]，這是我們需要進一步探討研究的地方,對不同情況的病人，CMIA檢測的可操作性和實用性有待大量實驗和進一步的數(shù)據(jù)來評估分析。

(三)時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)時間分辨熒光免疫分析近年也逐漸被應用于測定抗體濃度，用鑭系元素Eu3-(銪)螯合物作為示蹤物標記抗原或抗體，在免疫反應完成后加入特殊的增強液，將Eu3-從標記的抗原或抗體上解離下來，并與增強液中的組分形成新的具有強烈熒光的螯合物，用特定的儀器測定熒光強度，從而判斷反應體系中被測物濃度。同時檢測時間和波長兩個參數(shù)進行信號分辨，可特異性排除非特異熒光的干擾，提高抗體檢測的靈敏度。與雙抗原夾心ELISA及CMIA相比，此法目前應用較少，但這一項操作技術推廣到臨床用于檢測抗-HBc也是極具前景的。

二、抗-HBc定量水平與慢性乙型肝炎(CHB)自然病程的相關性

歐洲肝臟病協(xié)會將CHB的自然病程分為4個時期：免疫耐受期( IT)、免疫清除期(IC)、低復制或非復制期( LR)及HBeAg陰性慢性乙型肝炎期(ENH)，且CHB不同階段存在免疫學動態(tài)變化[12]。近年各種新穎的檢測方法用來檢測乙型病毒性肝炎血清學標志物，然而，具有實踐意義的用來表現(xiàn)宿主免疫狀態(tài)的生化標志物始終不明確[13]。

抗-HBc定量已被廣泛應用于HBsAg陽性的CHB臨床篩查[14]。Song等[15-16]利用三組橫截面隊列(隊列樣本來自地區(qū)醫(yī)院或采血機構，包括535名既往感染者、56名隱匿性感染者、598名CHB患者)，應用新型的雙抗原夾心ELISA檢測CHB不同自然病程階段的抗-HBc水平，結果顯示IT、IS、LR、ENH抗-HBc平均水平分別為：3.17 、4.39、3.29、4.12 log10IU/mL，且IT、IS、LR、ENH各階段HBV DNA及HBsAg水平分別為8.42 、6.92 、2.67 、5.32 log10IU/mL與4.84 、4.14 、2.88 、3.31 log10IU/mL(P<0.001)，可以觀察到IC、ENH等免疫激活狀態(tài)的病程階段有較高的抗-HBc水平，且將抗-HBc水平與其他指標如ALT、AST、HBsAg、HBV DNA 、總膽紅素、白蛋白在各階段進行比較，經(jīng)過多因素分析，發(fā)現(xiàn)ALT、AST在IC、ENH患者中顯示較高水平(P值均<0.05)，這也表明抗-HBc水平主要與機體的免疫狀態(tài)和肝炎活動相關，而不是由HBV DNA或HBsAg水平所決定。另外，抗-HBc分泌效應B細胞參與CHB免疫學應答的過程，產(chǎn)生的肝細胞毒性效應反映慢性乙型肝炎的嚴重程度，而抗-HBc在這個過程中又扮演著極為重要的角色。因此，盡管抗-HBc具體的免疫學機制尚未完全明確[17]，但若抗-HBc水平高于基線，則往往能夠反映患者的免疫狀態(tài)。

三、抗-HBc定量水平與慢性乙型肝炎抗病毒治療應答的相關性

(一)抗-HBc定量水平與聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)治療應答的相關性利用敏感的、定量的、可預測抗病毒治療療效的指標對患者進行個體化診療分析是CHB研究的熱點。Yuan等在一項入組140名HBeAg陽性且接受PEG-IFN治療的CHB患者中發(fā)現(xiàn)應答較好的患者其抗-HBc水平均顯著高于基線，在P<0.05時，血清學應答率(SR)、病毒學應答率(VR)、聯(lián)合應答率(CR)均較高。另外單因素相關性分析，發(fā)現(xiàn)雖然高水平的ALT與SR、VR和CR也有一定關聯(lián)，但當我們納入了抗-HBc變量，則無論哪種情況，ALT均被排除。這些結果表明，抗-HBc抗體水平比ALT在預測PEG-IFN療效應答方面更有價值。對比分析示基線抗-HBc水平≥30 000 IU/mL的患者應答效果更為顯著，治療過程中也能更好地抑制HBV DNA，且在PEG-IFN治療過程中能較好的控制乙肝疾病的進展[18]。Yuen等[19]也認為盡管基線ALT ≥5 ULN對于PFG-IFN抗病毒治療應答是一個較好的預測指標，但探究一種更加敏感的臨床指標是非常緊迫的。

在另一個核苷酸類藥物(NUC)及IFN治療的小樣本隊列中，較高水平抗-HBc水平(NUC隊列≥29 000 IU/mL，IFN隊列≥9 000 IU/mL)的研究組有相對高的SR，在阿德福韋酯的隊列中，其靈敏度和特異性達到77.8%和77.5%，證實了治療前定量抗-HBc可以作為INF或者UNC的治療過程中HBeAg血清學轉換的一個預測指標[20]。同時在另一項包括231例和560例分別以PEG-IFN或UNC為基礎治療長達2年的患者，抗-HBc基線≥4.4 log10IU/mL、HBV DNA基線<9 log10拷貝/mL的HBeAg陽性慢性患者在PEG-IFN、UNC兩種抗病毒藥物抗病毒治療時，血清學轉換率分別為65.8%和37.1%，說明不論CHB抗病毒治療的藥物是PEG-IFN，還是UNC，亦或是兩種藥物的聯(lián)合治療，基線抗-HBc定量都是獨立預測HBeAg血清學轉換的最好的指標[21]。所以抗-HBc這一指標在未來的診療過程中或將可以用來指導慢性乙型病毒性肝炎的優(yōu)化治療。

(二)抗-HBc定量水平與核苷(酸)類似物治療應答的相關性2014年Jian sun等在替比夫定優(yōu)化治療CHB臨床試驗中也對抗-HBc進行了定量檢測，抗-HBc水平>10 000 IU/mL聯(lián)合24周HBV DNA<300拷貝/mL可有效預測2年替比夫定治療CHB的療效應答。實驗分析表明基線抗-HBc水平≥4.4 log10IU/mL是預測替比夫定治療下HBeAg血清轉換的獨立影響因素(多元隊列分析下其OR：1.994，95%CI：1.336～2.975，P=0.001)，相反，抗-HBc<4.4 log10IU/mL的患者僅僅只有14.5%(23/159)得到HBeAg血清學轉換。另外單因素分析提示，抗-HBc在隊列中有最高的OR值(OR：2.110)，相比HBV DNA(OR：1.930)及ALT(OR：1.514)，抗-HBc是較好的預測因子。且在單因素分析條件下發(fā)現(xiàn)應用NUC治療的患者其血清抗-HBc的水平下降的幅度顯著高于應用PEG-INF治療的患者，其原因可能與NUC與PEG-INF抗病毒的作用機制不同有關，也有可能是抗-HBc分泌效應B細胞的反應頻率和數(shù)量不同有關。然而這些僅僅是臨床研究者們的假設，具體機制目前還不太明確[22]。這提示，應用不同抗病毒藥物治療或一種抗病毒藥治療的不同時期其抗-HBc定量水平均有顯著差異，這極有可能反映著機體重要的免疫學變化，值得我們列入更多的對照變量以及相關數(shù)據(jù)進一步探究和驗證。

四、抗-HBc定量水平與人類免疫缺陷病毒(HIV)/HBV混合感染患者的診斷價值

泰國HIV/HBV混合感染的青少年約占HIV陽性感染者的3.3%[23]，HIV感染的青少年多數(shù)沒有乙型肝炎保護性抗體，因此相關人員建議接種乙肝疫苗。另有一項土耳其地區(qū)的研究提示單項抗-HBc陽性在HIV感染者中的檢出率為19.1%，HIV陽性共感染HBV的情況顯著高于輸血感染HBV的患者，因此，相關部門也建議所有HIV感染者在開始抗病毒治療前應進行抗-HBc篩查，以此來優(yōu)化艾滋病患者的診療[24]。這兩個報道表明，抗-HBc對HIV-HBV共感染具有一定實驗室診療價值。

London艾滋病定點診療處收集了HIV陽性患者的血清標本，回顧性統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，抗-HBc陽性率在艾滋病患者群體中非常高，達18.7%，Pallawela等[25]認為盡管患者HBeAg陰性或者HBV DNA低于檢測下限，但是仍存在較高的HBV再激活的危險。在近期的一項實驗中，從614名HIV陽性確診的獻血者和患者中抽取血液樣本，進行HBV血清標志物的篩查，發(fā)現(xiàn)HIV陽性個體罹患HBV的概率非常高，達到12.9%，故建議對新近診斷HIV陽性/艾滋病的患者常規(guī)檢測HBV。而且發(fā)現(xiàn)如果僅僅用傳統(tǒng)的HBV血清學標志物篩查，一些HIV-HBV共感染的患者仍不能得到明確診斷，HBV DNA雖然是一項比較好的檢測指標，但是在HBeAg陰性患者中仍有約10%的共感染患者漏診[26]。因為在隱匿性HBV感染(OBI)的情況下，HBV DNA值往往低于檢測下限或無法檢出。此時，抗-HBc定量檢測就顯得尤為重要。已經(jīng)有不少研究表明，在OBI的隊列中，抗-HBc定量檢測有利于協(xié)助診斷HBV感染，采用新型的雙夾心免疫測定方法(動態(tài)范圍在0.08～2.5 IU/mL的試劑盒)，將樣品在稀釋至1∶10至1∶100 000(增長10倍)，如果抗-HBc水平>2.5 IU/mL，則表明存在HBV的感染，且在OBI中，抗-HBc水平在(1.02 ± 0.76) log10IU/mL的波動范圍內(nèi)，故將抗-HBc水平 >7 820 IU/mL作為區(qū)分感染基礎上有無實質性的肝臟炎癥的一個界限[27-28]，這有利于臨床工作者進一步評估HIV感染基礎上的肝臟器官功能。且在免疫功能不佳的情況下，若HIV感染未接受高效抗反轉錄病毒治療、患者年齡過大或免疫活性較低(此時抗-HBs低于檢測下限或無法檢測出)，HIV患者體內(nèi)單項抗-HBc陽性可以預測HIV-HBV共感染[29]。

五、小結

盡管臨床上用于乙型病毒性肝炎診療的免疫生化指標很多，但是靈敏度和特異性各異?？?HBc的臨床應用價值已經(jīng)在各項研究中得到證實，定量檢測抗-HBc不僅體現(xiàn)在反映慢性乙型病毒性肝炎自然病程方面，更體現(xiàn)在乙型肝炎病毒隱匿性感染的協(xié)助診斷、乙型病毒性肝炎抗病毒療效應答的預測評估、以及HIV/HBV混合感染時檢測抗-HBc對HIV患者優(yōu)化診療等領域。雖然目前我們對抗-HBc陽性指標的意義尚未完全澄清，但可以清楚地認識到抗-HBc定量分析對臨床診療已具有重要意義，隨著抗-HBc檢測方法學的不斷研究和發(fā)展，抗-HBc定量的臨床意義將會有更深入的認識和闡明，臨床應用也將得到更多的推廣和開發(fā)。

[1]Franco E,Bagnato B,Marino MG,et al.Hepatitis B: epidemiology and prevention in developing countries. World J Hepatol, 2012, 4: 74-80.

[2]Lu FM, Zhuang H. Management of hepatitis B in China. Chin Med J (Engl), 2009, 122: 3-4.

[3]Maruyama T,Schodel F,Iino S,et al.Distinguishing between acute and symptomatic chronic hepatitis B virus infection. Gastroenterology, 1994, 106: 1006-1015.

[4]Chu CM,Yeh CT, Sheen IS,et al.Subcellular localization of hepatitis B core antigen in relation to hepatocyte regeneration in chronic hepatitis B. Gastroenterology, 1995, 109: 1926-1932.

[5]Hyodo N,Nakamura I, Imawari M.Hepatitis B core antigen stimulates interleukin-10 secretion by both T cells and monocytes from peripheral blood of patients with chronic hepatitis B virus infection. Clin Exp Immunol, 2004, 135: 462-466.

[6]Zlotnick A, Johnson JM, Wingfield PW,et al.A theoretical model successfully identifies features of hepatitis B virus capsid assembly. Biochemistry, 1999, 38: 14644-14652.

[7]Soeung SC, Rani M, Huong V, et al. Results from nationwide hepatitis B serosurvey in Cambodia using simple and rapid laboratory test: implications for National Immunization Program. Am J Trop Med Hyg, 2009, 81: 252-257.

[8]Deng LJ, Xu Y, Huang J. Developing a double-antigen sandwich ELISA for effective detection of human hepatitis B core antibody. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2008, 31: 515-526.

[9]Han Y,Wang B and Liu H. The novel use of a routine quantitative system to analyze the activity, content and affinity of an antibody to hepatitis B core antigen. J Clin Virol, 2011, 52: 295-299.

[10]Liu H, Han Y, Wang B. A simple method to measure antibody affinity against the hepatitis B surface antigen using a routine quantitative system. J Virol Methods, 2011, 173: 271-274.

[11]Hadziyannis E, Manesis E, Vassilopoulos D, et al. Performance characteristics of microparticle enzyme and chemiluminescence immunoassays for measurement of anti-HBc immunoglobulin M in sera of patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B virus infection. Clin Vaccine Immunol, 2008, 15: 385-387.

[12]EASL clinical practice guidelines: Management of chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol, 2012, 57: 167-185.

[13]Rijckborst V, Hansen BE, Cakaloglu Y, et al. Early on-treatment prediction of response to peginterferon alfa-2a for HBeAg-negative chronic hepatitis B using HBsAg and HBV DNA levels. Hepatology, 2010, 52: 454-461.

[14]Moucari R,Mackiewicz V,Lada O,et al.Early serum HBsAg drop: a strong predictor of sustained virological response to pegylated interferon alfa-2a in HBeAg-negative patients. Hepatology, 2009, 49: 1151-1157.

[15]Tseng TC, Liu CJ, Su TH, et al. Serum hepatitis B surface antigen levels predict surface antigen loss in hepatitis B e antigen seroconverters. Gastroenterology, 2011, 141: 517-525, 525 e1-2.

[16]Tseng TC, Liu CJ, Yang HC, et al. Determinants of spontaneous surface antigen loss in hepatitis B e antigen-negative patients with a low viral load. Hepatology, 2012, 55: 68-76.

[17]Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet, 2009, 373: 582-592.

[18]Song LW, Liu PG, Liu CJ, et al. Quantitative hepatitis B core antibody levels in the natural history of hepatitis B virus infection. Clin Microbiol Infect, 2015, 21: 197-203.

[19]Jia W,Song LW,Fang YQ,et al.Antibody to hepatitis B core antigen levels in the natural history of chronic hepatitis B: a prospective observational study. Medicine (Baltimore), 2014, 93: e322.

[20]Zgair AK,Ghafil JA, Al-Sayidi RH. Direct role of antibody-secreting B cells in the severity of chronic hepatitis B. J Med Virol, 2015, 87: 407-416.

[21]Hou FQ,Song LW,Yuan Q,et al.Quantitative hepatitis B core antibody level is a new predictor for treatment response in HBeAg-positive chronic hepatitis B patients receiving peginterferon. Theranostics, 2015, 5: 218-226.

[22]Yuen MF,Yuan HJ,Hui CK,et al.A large population study of spontaneous HBeAg seroconversion and acute exacerbation of chronic hepatitis B infection: implications for antiviral therapy. Gut, 2003, 52: 416-419.

[23]Yuan Q, Song LW, Liu CJ, et al. Quantitative hepatitis B core antibody level may help predict treatment response in chronic hepatitis B patients. Gut, 2013. 62: 182-184.

[24]Fan R,Sun J,Yuan Q,et al.Baseline quantitative hepatitis B core antibody titre alone strongly predicts HBeAg seroconversion across chronic hepatitis B patients treated with peginterferon or nucleos(t)ide analogues. Gut, 2016, 65: 313-320.

[25]Aurpibul L,Lumbiganon p,Kolasaraksa p,et al.HIV and Hepatitis B coinfection among perinatally HIV-infected Thai adolescents. Pediatr Infect Dis J, 2012, 31: 943-947.

[26]Karaosmanoglu HK,Aydin OA and Nazlican O.Isolated anti-HBc among HIV-infected patients in Istanbul, Turkey. HIV Clin Trials, 2013, 14: 17-20.

[27]Liu Y,Zeng P,Wang J,et al.Hepatitis B virus infection in a cohort of HIV infected blood donors and AIDS patients in Sichuan, China. J Transl Med, 2014, 12: 164.

[28]Urbani S,Fagnoni F, Missale G,et al.The role of anti-core antibody response in the detection of occult hepatitis B virus infection. Clin Chem Lab Med, 2010, 48: 23-29.

[29]Raimondo G,Allain JP,Brunetto MR,et al.Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infection. J Hepatol, 2008, 49: 652-657.

[30]Li A,Yuan Q,Huang Z,et al.Novel double-antigen sandwich immunoassay for human hepatitis B core antibody. Clin Vaccine Immunol, 2010, 17: 464-469.

[31]Witt MD.Lewis RJ,Rieg G,et al.Predictors of the isolated hepatitis B core antibody pattern in HIV-infected and -uninfected men in the multicenter AIDS cohort study. Clin Infect Dis, 2013, 56: 606-612.

[32]Pallawela SN,Sonnex C,Mabayoje D,et al.Positive hepatitis B virus core antibody in HIV infection--false positive or evidence of previous infection J Med Virol, 2015, 87: 208-212.

(本文編輯：張苗)

201508上海市(復旦大學附屬)公共衛(wèi)生中心肝炎一科

陳良，Email:chenliang6502@126.com

2016-04-26)