王森，張文宏

復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040

·綜述·

結(jié)核病診斷技術(shù)新進展

王森，張文宏

復旦大學附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040

摘要：結(jié)核病疫情亟需快速、有效的診斷方法，但長久以來其診斷一直依靠傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片和培養(yǎng)技術(shù)，并不能滿足快速診斷的需要。為解決這個全球性的問題，近年來出現(xiàn)了多種結(jié)核病新的診斷技術(shù)和方法，如新的影像學檢查及計算機輔助技術(shù)、顯微鏡學診斷技術(shù)、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)、免疫學診斷技術(shù)，以及結(jié)核分枝桿菌特異性核酸擴增技術(shù)。本文主要介紹幾種最有代表性的技術(shù)和方法，其中部分技術(shù)已獲得世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的推薦，部分正在進行大規(guī)模臨床研究或驗證，反映了近年來結(jié)核病診斷發(fā)展的新方向。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；診斷；核酸擴增技術(shù)

目前，全球的結(jié)核病(tuberculosis，TB)負擔仍很重。中國疾病預防控制中心2010年全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查資料顯示，我國結(jié)核病年發(fā)病例約為100萬，年死亡病例5.4萬，其中每年新發(fā)耐多藥結(jié)核(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)患者約10萬例。結(jié)核病疫情亟需有效的診斷和治療手段。長久以來，結(jié)核病診斷一直依賴傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片和培養(yǎng)技術(shù)，但痰涂片的靈敏度較差，且存在標本獲取的問題；培養(yǎng)所需時間較長，不能滿足快速診斷的需要。隨后，以細胞免疫為基礎(chǔ)的結(jié)核分枝桿菌γ干擾素釋放試驗(interferon γ release assay，IGRA)獲得了飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。該項技術(shù)以T-SPOT.TB和QuantiFERON-TB Gold試劑盒為代表，能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)接種，特別適用于BCG廣泛接種的地區(qū)[1-2]，但無法區(qū)分活動性結(jié)核病與潛伏性結(jié)核感染。不久，以結(jié)核分枝桿菌特異性核酸擴增技術(shù)(nucleic acid amplification technology，NAAT)為代表的分子診斷技術(shù)獲得了較快發(fā)展。目前，新的結(jié)核病診斷技術(shù)分成以下幾個方向：①影像學技術(shù)及計算機輔助診斷技術(shù)；②顯微鏡學診斷技術(shù)；③結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)；④活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染的免疫學診斷技術(shù)；⑤分子診斷技術(shù)：包括病原體檢測及耐藥檢測。本文總結(jié)了近幾年來結(jié)核病診斷領(lǐng)域中新的診斷技術(shù)，其中著重介紹已獲得世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦或通過初步驗證并正在大規(guī)模評估的新技術(shù)和新產(chǎn)品。

1影像學技術(shù)及計算機輔助技術(shù)

X線胸片檢查仍被WHO推薦用于結(jié)核病疑似患者篩查，特別是在低收入和條件受限制的地區(qū)。數(shù)字化X線攝影(digital radiography，DR)操作便捷，獲得結(jié)果迅速且費用較低，診斷結(jié)核病有較高的靈敏度和特異度。最近，在DR胸片的基礎(chǔ)上建立了計算機輔助圖像分析系統(tǒng)，直接通過軟件對DR圖像進行分析。這種軟件的應(yīng)用使X線胸片檢查不再需專業(yè)技術(shù)人員或影像學專家讀片，更適用于人員和技術(shù)匱乏的地區(qū)[3-5]。該軟件由挪威Radboud大學開發(fā)，稱為CAD4TB系統(tǒng)，已發(fā)展至第4代，軟件同時提供電腦版本和手機APP版本下載。CAD4TB系統(tǒng)的主要工作流程是對X線胸片圖像中的可疑病灶進行搜索，包括肺部陰影、畸變和空洞等，然后與數(shù)據(jù)庫中的圖像進行比對和計算，最終得出結(jié)果。CAD4TB系統(tǒng)能自動對圖像進行分析，1 min內(nèi)就能獲得診斷結(jié)果。研究表明，以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為金標準，CAD4TB軟件的分析結(jié)果與人工讀片相比較未見顯著差異[3-4]。CAD4TB系統(tǒng)另一大優(yōu)點在于配合便攜式DR的應(yīng)用，可建立移動式檢查站，直接到結(jié)核病流行地區(qū)進行篩查，不需特殊專業(yè)人員，還大大降低了篩選成本[5]。最新研究表明，首先通過X線胸片和CAD4TB篩選出疑似結(jié)核分枝桿菌感染者，然后通過分子檢測如Xpert MTB/RIF等進一步明確并進行耐藥測定，與直接應(yīng)用Xpert MTB/RIF篩選相比，成本降低一半以上，且準確率無顯著差異[3]。

2顯微鏡學診斷技術(shù)

顯微鏡下痰標本中結(jié)核分枝桿菌檢查是確診肺結(jié)核病最特異性的方法。涂片抗酸染色鏡檢快速、簡便，采用苯酚復紅抗酸染色及金胺O-羅丹明等熒光染料涂片鏡檢仍是在臨床標本中檢測結(jié)核分枝桿菌的主要依據(jù)，被WHO推薦并廣泛使用。熒光顯微鏡檢測在一定程度上提高了檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度，但其對光源的嚴格要求限制了熒光顯微鏡的廣泛應(yīng)用。近年來，發(fā)光二極管(light-emitting diode，LED)熒光顯微鏡的出現(xiàn)完美結(jié)合了LED光源與熒光顯微鏡技術(shù)。與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比，LED使用壽命更長，價格更低廉，不需復雜的光路調(diào)節(jié)和暗室操作。由于LED熒光顯微鏡在結(jié)核分枝桿菌檢測方面的優(yōu)異表現(xiàn)，WHO于2011年推薦LED顯微鏡逐步取代傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，并可作為以Ziehl-Neelsen染色為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)光學顯微鏡檢測的替代方法[6]。最近又發(fā)展了建立在熒光染色基礎(chǔ)上的全自動化讀片系統(tǒng)TBDx(Applied Visual Sciences Inc.，USA)，將熒光染色后的涂片標本放入TBDx系統(tǒng)，可自動讀取并報告檢驗結(jié)果，每小時能處理10～12張涂片，其診斷準確率與專業(yè)人員判斷結(jié)果無顯著差異[7]。

3結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是結(jié)核分枝桿菌檢測和藥敏試驗(drug sensitivity testing，DST)的金標準。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法耗時較長，需4～6周。液體培養(yǎng)系統(tǒng)如Bactec MGIT 960(BD Diagnostics, Sparks, Maryland，USA)提供了較傳統(tǒng)固體培養(yǎng)更為敏感和快速的方法，1～3周即可檢測到分枝桿菌的生長。分枝桿菌生長指示管法(mycobacterial growth indicator tube，MGIT)中，管底含熒光復合物，可被氧氣淬滅。當分枝桿菌生長時，管內(nèi)氧氣逐漸被消耗即可探測到管底的熒光復合物。MGIT技術(shù)不到8 d即可顯示結(jié)果。自動化MGIT還可通過添加臨界濃度的鏈霉素、異煙肼、利福平和乙胺丁醇進行藥敏檢測。目前，WHO和結(jié)核戰(zhàn)略技術(shù)顧問組推薦在有條件的地區(qū)逐步啟用液體培養(yǎng)，包括低收入國家。另外一種改良液體培養(yǎng)方法稱為TK SLC-L結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)，通過液體培養(yǎng)基顏色改變(紅色變?yōu)辄S色)可檢測到結(jié)核分枝桿菌的早期擴增，并可區(qū)分真菌及其他革蘭陰性桿菌的污染。研究結(jié)果表明[8]，與MGIT方法相比，TK SLC-L將報告時間縮短至3～5 d，且污染概率較低。TK SLC-L液體培養(yǎng)基在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用還在進一步評估和驗證中。

4活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染的免疫學診斷技術(shù)

以細胞免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的IGRA如T-SPOT.TB和QuantiFERON-TB Gold檢測近年來獲得了較好發(fā)展并廣泛應(yīng)用，但仍存在一定問題：診斷靈敏度有待提高，會出現(xiàn)無法判定結(jié)果的情況；無法區(qū)分活動性結(jié)核病與潛伏性結(jié)核感染；無法預測潛伏性感染者的活動風險等。改進IGRA的研究一直在進行，如增加新的診斷抗原、增加IFN-γ以外的診斷標記等。Qiagen公司2015年底公布了新一代結(jié)核診斷試劑盒QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT?-Plus) (http://www.quantiferon.com)。QFT?-Plus含4根采血管，管壁上分別包被有陽性對照、陰性對照和兩個結(jié)核分枝桿菌特異性抗原。與上一代產(chǎn)品相比，新產(chǎn)品宣稱第一次加入了CD8+T細胞應(yīng)答數(shù)據(jù)，可對潛伏性感染發(fā)展為活動性結(jié)核病的風險進行評估，并改進了工作流程，提高了操作效率，便于同時對多個樣本進行檢測。

IFN-γ誘導蛋白10(interferon γ-induced protein 10，IP-10)又稱為CXC-10，是CXC家族成員。它是一種促炎趨化因子，主要由炎癥部位的單核-巨噬細胞分泌，這些細胞受T細胞釋放的IFN-γ和其他促炎因子刺激后釋放IP-10。研究表明[9]，IP-10與炎癥反應(yīng)所造成的急性肺損傷有關(guān)，并與結(jié)核分枝桿菌感染密切相關(guān)。IP-10的釋放水平與IFN-γ有一定的相關(guān)性，但釋放量為IFN-γ的10～100倍。近期一系列研究表明，建立在現(xiàn)有IGRA的基礎(chǔ)上，IP-10可作為一種新的診斷標記。2014年，Guo等對14項IP-10診斷研究數(shù)據(jù)進行的Meta分析表明，IP-10診斷結(jié)核分枝桿菌感染的總靈敏度為73%(95%CI：71%～76%)，特異度為83%(95%CI：81%～86%)，其診斷活動性結(jié)核病的曲線下面積為0.88[10]。這些研究均表明，IP-10可作為診斷結(jié)核分枝桿菌感染的生物標記，從而提高診斷準確率。此外，由于IP-10釋放水平較高，理論上用少量標本即獲得檢測數(shù)據(jù)，因此可采指尖血而不用靜脈血進行檢測。目前已能直接對濾紙上的指尖血斑點進行IP-10水平檢測，操作簡便易行，可用于診斷或監(jiān)測結(jié)核病治療效果[11]，正在進行大樣本和多地區(qū)的臨床研究。

近年來還出現(xiàn)了一項新的免疫學檢測技術(shù)，即Determine TB-LAM Ag(Alere, Waltham, MA, USA)免疫檢測試紙條，用于檢測尿液標本中的脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)抗原。LAM是相對分子質(zhì)量為17 500的糖脂成分，是分枝桿菌細胞壁的組成成分[12]，能被腎小球濾過并在尿液中測出，因此廣泛用作結(jié)核分枝桿菌感染的診斷抗原[13]。Determine TB-LAM Ag直接檢測人尿液標本，加入試紙條后，無需做任何處理。若檢測到LAM抗原，則試紙條上出現(xiàn)條帶，全過程僅需25 min。由于LAM抗原在結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌中存在交叉反應(yīng)，所以不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。一項在人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染人群中的檢測結(jié)果表明，Determine TB-LAM Ag在全血標本中的檢測靈敏度較高，且與HIV感染患者的CD4+細胞計數(shù)有很大關(guān)系[14]。結(jié)核分枝桿菌感染是HIV感染患者最重要的致死原因之一，特別是在CD4+細胞計數(shù)較低者中。在此類人群中，痰涂片及培養(yǎng)等方法的靈敏度和特異度較低，迫切需要更為簡便快捷、準確率更高的檢測方法。Determine TB-LAM Ag能方便快捷地檢測HIV感染患者中的結(jié)核分枝桿菌感染。另一項南非的描述性研究表明[15]，Determine TB-LAM Ag檢測在CD4+細胞計數(shù)低的人群中具有較高的靈敏度，在CD4+細胞計數(shù)<50/μL的患者中為66.7%，在<100/μL的患者中為51.7%，在<200/μL的患者中為39.0%，特異度在各人群中均>98%。Determine TB-LAM Ag聯(lián)合痰涂片檢測，在CD4+細胞計數(shù)<50/μL的患者中靈敏度為72.2%。與Xpert MTB/RIF檢測相比，靈敏度無統(tǒng)計學差異。因此，在CD4+細胞計數(shù)較低的HIV感染患者中，Determine TB-LAM Ag檢測可作為現(xiàn)有診斷方法的補充，與痰涂片方法聯(lián)合應(yīng)用具有較高的靈敏度[16]。

5分子診斷技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌分子診斷技術(shù)近幾年出現(xiàn)了突破，其標志就是以Xpert MTB/RIF為代表的盒式診斷技術(shù)。Xpert MTB/RIF 檢測試劑盒為美國Cepheid公司開發(fā)，適用于GeneXpert儀器，可直接從患者新鮮痰液或凍存痰液中檢測結(jié)核分枝桿菌及其對利福平的耐藥性，整個過程在一密閉環(huán)境中進行，手動操作時間不超過5 min，對操作者和周圍環(huán)境安全，全程約2 h即獲得結(jié)果。Xpert MTB/RIF以半套式實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增技術(shù)為基礎(chǔ)，能自動抽提DNA并擴增rpoB基因。由于95%以上的利福平耐藥菌株有rpoB基因變異，所以在擴增rpoB基因的同時可鑒定是否為利福平耐藥菌株；而大部分利福平耐藥菌株同時對異煙肼耐藥，因此rpoB基因的檢測又可在一定程度上判斷是否為MDR-TB菌株。2010年《新英格蘭雜志》公布了一項多中心研究結(jié)果，表明以培養(yǎng)法為參考標準，Xpert MTB/RIF的靈敏度為92.2%，特異度為99.2%[17]。此后，Xpert MTB/RIF在多個國家和地區(qū)完成了診斷效果的研究和評估，其作為疑似結(jié)核分枝桿菌感染的初篩方法，總靈敏度為88% (95%CI：83%～92%)，特異度為98% (95%CI： 97%～99%)[18]。Xpert MTB/RIF也被證實可用于兒童結(jié)核病、肺外結(jié)核病及對非痰標本的檢測，均具有較好的診斷效能[19-21]。

2010年12月，WHO首次推薦Xpert MTB/RIF技術(shù)的使用。截至2014年3月，共有104個國家采購了超過2 300臺GeneXpert檢測儀器和超過600萬個Xpert MTB/RIF標本收集盒。2013年，WHO再次更新了對Xpert MTB/RIF的推薦意見[22]：Xpert MTB/RIF被強烈推薦作為成人和兒童懷疑MDR-TB感染或合并HIV感染的首選檢測方法，從而替代傳統(tǒng)的涂片鏡檢、培養(yǎng)和藥物試驗方法；被推薦對疑似肺外結(jié)核患者的肺外標本如腦脊液、淋巴結(jié)和其他組織進行檢測；還被推薦用于痰鏡檢方法的后續(xù)檢測，特別是對于痰涂片檢測陰性的患者。

另外一種結(jié)核分枝桿菌分子檢測技術(shù)稱為TB-LAMP，核心為環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。LAMP是一種快速、簡便、有效的DNA擴增方法，是一種手工NAAT。LAMP的特點在于擴增速度較快，檢測結(jié)果可在2 h內(nèi)完成，且DNA擴增不需熱循環(huán)儀器，不依賴特殊檢測設(shè)備。TB-LAMP采用結(jié)核分枝桿菌特異性引物，可視化熒光發(fā)光檢測，在全封閉系統(tǒng)中進行，可減少工作場所DNA污染，從而保證檢測的準確率[23]。TB-LAMP已在發(fā)展中國家進行的驗證顯示，其在痰涂片陽性結(jié)核病患者中的靈敏度為97.7%；在痰涂片陰性患者中的靈敏度為48.8%，特異度為99.0%。結(jié)果證實TB-LAMP是一種功能強大的檢測方法，具有高度穩(wěn)定性及成功率。即使是沒有分子生物學實驗經(jīng)驗的人員，也可熟練操作[24]。初步臨床研究證實，TB-LAMP檢測具有較高的靈敏度和特異度。目前，TB-LAMP在FIND基金資助下正在全球14個國家和地區(qū)開展大規(guī)模的臨床研究，并與LED顯微鏡和Xpert MTB/RIF進行了頭對頭的比較，其中在岡比亞的研究結(jié)果已于2015年12月發(fā)表，證實其診斷結(jié)核病的總靈敏度為99%，特異度為94%[25]。

綜上所述，全球結(jié)核病疫情亟需快速、簡便的診斷技術(shù)，已有多種有潛力的新診斷方法被開發(fā)并進行了廣泛評估，其中有些方法如Xpertt MTB/RIF已通過WHO評估并獲得推薦，更多的方法還在進行臨床試驗和評價中。相信在不久的將來，新技術(shù)的應(yīng)用將使人們更快、更迅速地發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染，從而更好地為結(jié)核病預防和治療服務(wù)。

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New progress on diagnosis of tuberculosis

WANG Sen, ZHANG Wenhong

Department of Infectious Disease, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China

Abstract:The epidemic of tuberculosis worldwide urgently requires quick and effective diagnostic method. However for a long time, the diagnosis of tuberculosis has been relying on the traditional acid-fast staining of smears and selective Mycobacterium tuberculosis culture techniques, which cannot meet the need for rapid diagnosis. To match this global clinical need, many new tuberculosis diagnostic techniques and methods have been developed in recent years, such as new imaging and computer-aided techniques, automated microscopy, short time culture-based diagnosis, immunological diagnosis, and Mycobacterium tuberculosis-specific nucleic acid amplification technology. This paper describes the representative of the techniques and methods, some of which have already been recommended by World Health Organization (WHO), some have been investigated under large-scale clinical studies. These new technologies reflect the future direction in the diagnosis of tuberculosis.

Key words:Mycobacterium tuberculosis; Diagnosis; Nucleic acid amplification technology

基金項目：國家自然科學基金(81301481)

通信作者：張文宏

Corresponding author. ZHANG Wenhong. E-mail: zhangwenhong@fudan.edu.cn

(收稿日期：2015-12-28)