李文利 劉征宇 陸雅雅 章忠輝 李曉暉

(上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致藍(lán)藻水華的爆發(fā)日趨頻繁，嚴(yán)重破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)，危及人類和水生生物的健康。常用的除藻方法包括物理法、化學(xué)法和生物法[1-2]。物理法除藻最為方便可行，效果也比較顯著，對(duì)于緊急處理時(shí)有很好的成效，但成本過高，治標(biāo)不治本；化學(xué)法除藻通過向水體中投加化學(xué)藥劑，能快速殺死藻細(xì)胞，但大多數(shù)化學(xué)藥劑有毒，易造成二次污染；生物法除藻是目前來說操作最簡單、成本最低、對(duì)環(huán)境最安全的方法[3-5]。溶藻細(xì)菌是一類能通過直接接觸藻細(xì)胞或間接分泌胞外代謝產(chǎn)物來抑制藻類生長，甚至溶解藻細(xì)胞、殺死藻類的細(xì)菌的統(tǒng)稱[6]。溶藻細(xì)菌治理藍(lán)藻水華是生物除藻的一種方式[7-8]。

本研究從太湖水華水域分離得到一株蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，是一種有效的溶藻細(xì)菌。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、裝瓶量、接種量、發(fā)酵時(shí)間等培養(yǎng)條件，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，得到蠟樣芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件，從而提高溶藻細(xì)菌培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻905(Microcystisaeruginosa905)的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藻種和菌種

銅綠微囊藻905購自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫——淡水藻種庫，轉(zhuǎn)種到新鮮的BG11培養(yǎng)基后在溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光暗比為14 h∶10 h的條件下培養(yǎng)[9]。

蠟樣芽孢桿菌從太湖水華水域分離得到并經(jīng)鑒定確認(rèn)。

1.1.2 培養(yǎng)基

蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO40.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.15 g/L、MnSO40.5 g/L，調(diào)pH=8.2。

1.1.3 主要儀器

智能型光照培養(yǎng)箱(SPX-250PG)；紫外—可見分光光度計(jì)(SQ-UV2300)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，CX21)；多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(TDZ5-WS)等。

1.2 方 法

1.2.1 溶藻實(shí)驗(yàn)

蠟樣芽孢桿菌經(jīng)過營養(yǎng)瓊脂活化后接種在新鮮的培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min的條件下發(fā)酵12 h。發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后，取上清液0.5 mL與對(duì)數(shù)生長期的銅綠微囊藻905藻液4.5 mL混合，同時(shí)取0.5 mL無菌的培養(yǎng)基與生長對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻905藻液4.5 mL混合后作為對(duì)照(T0)，放置在溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光暗比為14 h∶10 h的條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.2 銅綠微囊藻905生物量的測定

用光學(xué)顯微鏡視野計(jì)數(shù)法測定銅綠微囊藻905的藻細(xì)胞濃度[10]。

銅綠微囊藻905中含有葉綠素a，因此在超聲振蕩的條件下使銅綠微囊藻905藻細(xì)胞破碎釋放出葉綠素a，也可以用葉綠素a的濃度間接表征銅綠微囊藻905的生物量。葉綠素a的測定方法：用丙酮在低溫黑暗條件下萃取待測培養(yǎng)液12 h后離心，取上清液分別在 630、647、664、750 nm波長下測定吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算葉綠素a的濃度[11]。

c=11.85(A664-A750)-1.54(A647-A750)-0.08(A630-A750)

(1)

式中，c為葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；A630、A647、A664、A750分別為630、647、664、750 nm波長下的吸光度。

通過清除率來評(píng)價(jià)蠟樣芽孢桿菌的溶藻效率，計(jì)算公式見式(2)。

η=(1-ce/cc)×100%

(2)

式中，η為藻細(xì)胞或葉綠素a的清除率，%；ce為實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞濃度或葉綠素a質(zhì)量濃度，單位根據(jù)實(shí)際情況確定；cc為對(duì)照組的藻細(xì)胞濃度或葉綠素a質(zhì)量濃度，單位根據(jù)實(shí)際情況確定。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

將活化好的蠟樣芽孢桿菌接種在250 mL錐形瓶中培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、裝瓶量、接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。研究培養(yǎng)溫度對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、接種量為4%、發(fā)酵時(shí)間為12 h，培養(yǎng)溫度設(shè)置為27、32、37、42、47 ℃；研究轉(zhuǎn)速對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、裝瓶量為50 mL、接種量為4%、發(fā)酵時(shí)間為12 h，轉(zhuǎn)速設(shè)置為60、100、140、180、220 r/min；研究裝瓶量對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、接種量為4%、發(fā)酵時(shí)間為12 h，裝瓶量設(shè)置為25、50、75、100、125 mL；研究接種量對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、發(fā)酵時(shí)間為12 h，接種量設(shè)置為2%、4%、6%、8%、10%；研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為4、6、8、10、12 h。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)溫度(X1)、轉(zhuǎn)速(X2)和發(fā)酵時(shí)間(X3)3個(gè)主要因素再進(jìn)一步采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，綜合考慮因素間的交互作用。利用Design-Export 8.0軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)的因素水平表見表1。

表1 因素與水平表

1.2.5 蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式探究

為探討蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式，對(duì)其培養(yǎng)液進(jìn)行如下處理：(1)用 121 ℃、103.4 kPa高溫高壓滅菌20 min，記為T1；(2)用0.2 μm濾膜過濾，記為T2；(3)用12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 min，記為T3；(4) 用250 W超聲振蕩15 min，記為T4；(5)不做任何處理，記為T5。將上述處理的培養(yǎng)液再按照1.2.1的溶藻實(shí)驗(yàn)進(jìn)行溶藻方式探究[12]。

2 結(jié) 果

2.1 蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)可見，37 ℃時(shí)蠟樣芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率最高達(dá)92.30%，溫度過高或過低都會(huì)影響溶藻效果；圖1(b)顯示，轉(zhuǎn)速為60～180 r/min時(shí)，蠟樣芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率隨轉(zhuǎn)速的升高而升高，180 r/min時(shí)葉綠素a清除率達(dá)到最高(89.92%)，轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)葉綠素a清除率反而有所降低；裝瓶量通過影響發(fā)酵過程的通氣量而影響蠟樣芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率，圖1(c)結(jié)果顯示，當(dāng)裝瓶量為75 mL時(shí)葉綠素a清除率最高(90.53%)；從圖1(d)可以看出，蠟樣芽孢桿菌接種量為2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)～6%時(shí)，銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率隨接種量增加而升高，當(dāng)接種量達(dá)到6%以后，葉綠素a清除率基本保持不變；圖1(e)為發(fā)酵時(shí)間對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率的影響，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長葉綠素a清除率先升高后降低，發(fā)酵時(shí)間為8 h時(shí)葉綠素a清除率最高(91.97%)。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of the single factor experiments

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蠟樣芽孢桿菌在培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為75 mL、接種量為6%、發(fā)酵時(shí)間為8 h的條件下對(duì)葉綠素a的清除率最高。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)葉綠素a清除率結(jié)果見表2，以葉綠素a清除率(Y)為因變量得到二次回歸方程如式(3)所示，并對(duì)各變量的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性分析(見表3)。

(3)

從表4可知，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的回歸模型P<0.000 1，失擬的P=0.681 3，因此回歸模型高度顯著(P≤0.05)，但失擬檢驗(yàn)不顯著(P>0.05)；蠟樣芽孢桿菌菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化的回歸模型的校正決定系數(shù)R2(adj)為0.939 8，說明模型能解釋約93.98%的總變異；決定系數(shù)R2為0.968 3，說明模型擬合程度良好，誤差較小，可以用來分析和預(yù)測蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化情況。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)葉綠素a清除率結(jié)果

表3 回歸系數(shù)的顯著性分析

最終，Design-Expert 8.0軟件的預(yù)測結(jié)果為：培養(yǎng)溫度39.35 ℃，轉(zhuǎn)速170.40 r/min，發(fā)酵時(shí)間9.08 h?？紤]到實(shí)際條件的可控制性，把最佳培養(yǎng)條件修正為：接種量6%、裝瓶量75 mL、培養(yǎng)溫度39 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min、發(fā)酵時(shí)間為9 h，此時(shí)葉綠素a清除率為86.72%。

表4 回歸模型的方差分析1)

注：1)模型R2(adj)=0.939 8，R2=0.968 3。

2.3 蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式探究

溶藻方式的探究結(jié)果見表5，除T4的藻細(xì)胞清除率較低外，T1～T3處理方式與T5幾乎沒有差別，而蠟狀芽孢桿菌耐高溫性較差，經(jīng)高溫處理后細(xì)胞已經(jīng)失活[13]，由此可以初步判斷蠟狀芽孢桿菌可能通過分泌一種耐高溫的代謝產(chǎn)物或是細(xì)胞外物質(zhì)來抑制銅綠微囊藻905的生長，溶藻方式屬于間接溶藻，超聲振蕩可能會(huì)破壞這種代謝產(chǎn)物或細(xì)胞外物質(zhì)。

表5 溶藻方式的研究結(jié)果

3 討 論

微囊藻是藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻類，其中以銅綠微囊藻最具代表性，會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的微囊藻毒素[14]。利用溶藻細(xì)菌治理藍(lán)藻水華已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和趨勢。溶藻細(xì)菌的溶藻方式分為直接溶藻和間接溶藻[15-16]。直接溶藻是指溶藻細(xì)菌與藻細(xì)胞直接接觸，通過破壞藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)達(dá)到溶藻效果；間接溶藻是指溶藻細(xì)菌通過分泌代謝產(chǎn)物或細(xì)胞外物質(zhì)來抑制藻類的生長，如抗生素、多肽、蛋白質(zhì)等。崔亞青等[17]從太湖水域分離得到一株水單胞菌屬的溶藻細(xì)菌，菌體無溶藻作用，主要是通過代謝產(chǎn)物達(dá)到溶藻的效果，與本研究發(fā)現(xiàn)的蠟樣芽胞桿菌的溶藻方式一致，屬于間接溶藻細(xì)菌，但其溶藻效果不穩(wěn)定、溶藻效率較低。微生物生長和代謝與很多因素有關(guān)，如培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量等[18]。因此，徐長安等[19]對(duì)溶藻細(xì)菌的培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量等發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵條件對(duì)溶藻效果影響顯著。許珂等[20]利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)溶藻細(xì)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，溶藻效率提高了10倍。因此，對(duì)溶藻細(xì)菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化是必要的。

4 結(jié) 論

蠟樣芽胞桿菌的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度39 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min、裝瓶量75 mL、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間為9 h，葉綠素a清除效率可達(dá)86.72%；通過溶藻方式的探究，可以初步判斷蠟樣芽孢桿菌是通過分泌一種耐高溫的代謝產(chǎn)物或是細(xì)胞外物質(zhì)來抑制銅綠微囊藻905生長的，溶藻方式屬于間接溶藻，超聲波處理可能會(huì)破壞這種代謝產(chǎn)物或細(xì)胞外物質(zhì)。

[1] 劉勇,黃志宇,陸屹,等.水體富營養(yǎng)化及其防治措施研究進(jìn)展[J].玉溪師范學(xué)院學(xué)報(bào),2004,20(8):63-65.

[2] BRICKER S B,LONGSTAFF B,DENNISON W,et al.Effects of nutrient enrichment in the nation’s estuaries:a decade of change[J].Harmful Algae,2008,8(1):21-32.

[3] CHEN Yuwei，QIN Baoqiang，TEUBNER K，et al.Long-term dynamics of phytoplankton assemblages:microcystis-domination in Lake Taihu，a large shallow lake in China[J].Journal of Plankton Research,2003，25(4):445-453.

[4] GANNON D，MCCABE E，CAMILLERI S A，et al.Effects ofKareniabrevisharmful algal blooms on near shore fish communities in southwest Florida[J].Marine Ecology Progress，2009，378(12):171-186.

[5] CARMICHAEL W.A world overview - one-hundred-twenty-seven years of research on toxic bacterial - where do we go from here?[J].Advances in Experimental Medicine and Biology，2011，10(7):2643-2654.

[6] WANG Ganlin,LI Junsheng,CHANG Bing,et al.Monitoring bacterial-dominant algal blooms in eutrophicated Taihu Lake in China with synthetic aperture radar images[J].Chinese Journal of Oceanology and Immunology,2015,33(1):139-148.

[7] CHEN Jun,XIE Ping,MA Zhinei,et al.A systematic study on spatial and seasonal patterns of eight taste and odor compounds with relation to various biotic and abiotic parameters in Gonghu Bay of Lake Taihu,China[J].Science of the Total Environment,2010,409(2):314-325.

[8] BALL A,WILLIAMS M,VINCENT D,et al.Algal growth control by a barley straw extract[J].Bioresource Technology,2001,77(2):177-181.

[9] HU Xi,LIU Yunguo,ZENG Guangming,et al.Effects of limonene stress on the growth of and microcystin release by the freshwater cyanobacteriumMicrocystisaeruginosaFACHB-905[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2014,105(1):121-127.

[10] 常顯波,張鵬,楊啟霞,等.一株高效溶藻放線菌的分離及溶藻特性的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(23):11545-11546.

[11] TIAN Chuan,LIU Xianglong,TAN Jing,et al.Isolation，identification and characterization of an algicidal bacterium from Lake Taihu and preliminary studies on its algicidal compounds[J].Journal of Environmental Sciences,2012,24(10):1823-1831.

[12] GUMBO J,CLOETE T.The mechanism ofMicrocystisaeruginosadeath upon exposure toBacillusmycoides[J].Physics and Chemistry of the Earth,2011,36(4):881-886.

[13] 何月英,曾德年,胡仕鳳,等.蠟狀芽孢桿菌的分離培養(yǎng)與鑒定[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,31(2):203-205.

[14] 孔繁翔,高光.大型淺水富營養(yǎng)化湖泊中藍(lán)藻水華形成機(jī)理的思考[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2005,25(3):589-595.

[15] 魏雅冬,王雙俠,戴明,等.溶藻細(xì)菌溶藻活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].黑龍江科學(xué),2011,2(3):45-47.

[16] WEN M C,FU S S,SHI Y S.Novel L-amino acid oxidase with algicidal activity against toxic cyanobacteriumMicrocystisaeruginosasynthesized by a bacteriumAquimarinasp.[J].Enzyme and Microbial Technology,2011,49(4):372-379.

[17] 崔亞青,雍曉雨,張風(fēng)革,等.一株溶藻細(xì)菌的分離鑒定及溶藻效果[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2012,18(5):752-760.

[18] 肖海群.脂肪酶產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵條件的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2007.

[19] 徐長安,羅秀針,俞超超.海洋源生防細(xì)菌LHB02的篩選、鑒定及其抑菌譜檢測[J].海洋與湖沼,2011,42(2):284-288.

[20] 許珂,吳剛,余文平,等.溶藻細(xì)菌W5培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵培養(yǎng)[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2009，32(2):12-15.