劉小東，王 偉，黃 勇，張湘莉蘭，孫 強(qiáng)，安小平，米志強(qiáng)，童貽剛

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

一株弗氏檸檬酸桿菌噬菌體IME-CF2的分離、測(cè)序及全基因組分析

劉小東1，2，王 偉2，黃 勇2，張湘莉蘭2，孫 強(qiáng)2，安小平2，米志強(qiáng)2，童貽剛1，2

目的從醫(yī)院污水中分離一株能裂解弗氏檸檬酸桿菌的噬菌體，觀察其形態(tài)，并進(jìn)行全基因組測(cè)序和全基因組分析，為治療和控制弗氏檸檬酸桿菌感染提供基礎(chǔ)。方法以弗氏檸檬酸桿菌為宿主，從醫(yī)院污水分離噬菌體，用透射電鏡觀察其形態(tài)；使用Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行噬菌體全基因組測(cè)序，測(cè)序后進(jìn)行噬菌體全基因組序列組裝、注釋、進(jìn)化分析和比較分析。結(jié)果成功分離一株弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，命名為IME-CF2；電鏡觀察顯示，該噬菌體具有二十面體的頭部，形態(tài)類似肌尾噬菌體科；IME-CF2核酸類型為DNA，基因組全長為177 685 bp，GC含量為43.2%；編碼267個(gè)編碼區(qū)（CDS），2個(gè)tRNA；進(jìn)化分析表明，IME-CF2屬于T4類噬菌體，全基因組比較分析表明，IME-CF2與檸檬酸桿菌噬菌體Miller同源性最高。結(jié)論分離鑒定了一株弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，進(jìn)行了全基因組測(cè)序和分析，為噬菌體治療多重耐藥細(xì)菌奠定了基礎(chǔ)。

弗氏檸檬酸桿菌；噬菌體；全基因組測(cè)序；基因組分析

弗氏檸檬酸桿菌屬腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬，是發(fā)酵型革蘭陰性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，是人體腸道正常菌群，也是條件致病菌。近年來，隨著抗生素的濫用，弗氏檸檬酸桿菌對(duì)常見的抗生素產(chǎn)生耐藥［1］，給臨床感染治療帶來極大挑戰(zhàn)。噬菌體是一種能特異性感染細(xì)菌的病毒，廣泛存在于自然環(huán)境中，毒性噬菌體能引起宿主菌裂解死亡［2］。噬菌體是一種潛在的抗生素替代品，能有效治療細(xì)菌性感染，同時(shí)減輕細(xì)菌耐藥的發(fā)生。目前，噬菌體與抗生素聯(lián)合用藥及多種噬菌體雞尾酒療法對(duì)細(xì)菌性感染的治療效果較好［3-4］。該研究從醫(yī)院污水中分離一株毒性弗氏檸檬酸桿菌噬菌體IME-CF2，并對(duì)其進(jìn)行了全基因組測(cè)序、基因組分析及進(jìn)化分析。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料弗氏檸檬酸桿菌分離于中國人民解放軍307醫(yī)院檢驗(yàn)科，經(jīng)過生化性質(zhì)鑒定和16S rDNA測(cè)序鑒定，保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2方法

1.2.1 IME-CF2的分離與鑒定 取未經(jīng)處理的解放軍307醫(yī)院污水，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，并通過0.45μm的濾膜。取上述過濾液0.100 ml，加入到5 ml對(duì)數(shù)期指示菌弗氏檸檬酸桿菌中，于37℃震蕩過夜培養(yǎng)。第2天，取培養(yǎng)液12 000 r/min離心10 min，收集上清液，并通過0.45μm的濾器，所得過濾液即為噬菌體原液。使用噬菌體原液點(diǎn)滴法檢測(cè)是否分離到敏感性噬菌體。在鋪有指示菌的雙層平板2區(qū)域滴加0.001 5 ml的噬菌體原液，1區(qū)域滴加0.001 5 ml的PBS（磷酸鹽緩沖液）作為陰性對(duì)照組；觀察有無噬菌斑。

將上述敏感性噬菌體原液梯度系列稀釋后與對(duì)數(shù)期指示菌混勻鋪板做空斑形成實(shí)驗(yàn)。37℃溫箱孵育6 h，挑取單個(gè)噬菌斑接種到對(duì)數(shù)期的指示菌中；37℃震蕩培養(yǎng)6 h后，再次鋪雙層瓊脂板觀察噬菌斑，重復(fù)3次挑取單個(gè)空斑過程，分離到純種噬菌體。

1.2.2 IME-CF2電鏡觀察 噬菌體樣品使用磷鎢酸染色2 min，室溫干燥后在Philips TECNAI-10型透射電子顯微鏡（TEM）下觀察噬菌體的形態(tài)。

1.2.3 IME-CF2基因組DNA提取 參照Lu et al［5］的方法（略有改動(dòng)），抽提核酸。取0.600 m l的噬菌體液（滴度約4.3×1012PFU/L），加入胰DNaseⅠ和RNase A至終濃度1 mg/L，37℃過夜處理，隨后80℃滅活15 min，以使上述酶失活。然后加入0.5 mol/L EDTA（終濃度0.02 mol/L），20 g/L蛋白酶K（終濃度50 mg/L），10%SDS（終濃度0.5%），56℃水浴1 h。加入等體積酚抽提核酸，10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層水相到一新的1.5 ml離心管中。向上述離心管中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），溫和混勻后10 000 r/min離心5 min，以去除蛋白、糖類等物質(zhì)污染。取上述離心管中水相到一個(gè)新的離心管中，并加入等體積異戊醇，-20℃下靜止3 h后12 000 r/min離心25 min，收集沉淀。用75%的冰乙醇洗滌上述DNA沉淀，室溫干燥后用去離子水重懸浮上述DNA沉淀。

1.2.4 IME-CF2高通量測(cè)序文庫的構(gòu)建與上機(jī)取0.100 mg的高質(zhì)量噬菌體基因組DNA加水稀釋到0.050 mg，超聲打斷約20 min，末端補(bǔ)平，兩端鏈接接頭。加入1.8倍體積的AMPure XP Beads純化DNA，使用E-Gel膠選擇長約380 bp的DNA片段。PCR擴(kuò)增上述DNA片段，加入1倍體積的AMPure XP Beads純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。隨后取上述工作庫進(jìn)行油包水PCR反應(yīng)，堿法制備單鏈DNA測(cè)序模板。最后將帶有模板的微磁珠離心到318C芯片的微孔中，上機(jī)測(cè)序。

1.2.5 IME-CF2全基因組序列分析 IME-CF2全基因組序列組裝使用Newbler v2.9（454 Life Sciences Corporation）軟件。全基因組使用RAST（Rapid Annotation using Subsystem Technology）［6］和BASys（Bacterial Annotation System）在線注釋。序列相似性比對(duì)分析使用BLAST在線工具及mauve v.2.3.1，使用MEGA5.0建立進(jìn)化樹。使用DNAPlot1.11繪制基因組圈圖。

2 結(jié)果

2.1IME-CF2的形態(tài)弗氏檸檬酸桿菌888分離于解放軍307醫(yī)院患者血液，抗生素耐藥性見表1。以上述弗氏檸檬酸桿菌888作指示菌，成功從污水中分離到一株毒性弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，命名為IME-CF2。IME-CF2能在鋪有指示菌的雙層平板上2區(qū)形成透亮的圓形噬菌環(huán)，而點(diǎn)有PBS的對(duì)照區(qū)1區(qū)無明顯變化，見圖1A。IME-CF2能形成直徑約1 mm清晰透亮的噬菌斑，見圖1B。電鏡照片表明該噬菌體具有典型的二十面體結(jié)構(gòu)和以收縮的尾部，頭部直徑約0.080μm，尾部長約0.120μm，歸屬于肌尾噬菌體科，見圖2。根據(jù)國際委員會(huì)關(guān)于噬菌體命名的方法，該噬菌體可命名為vB_CFRMIME-CF2。

2.2IME-CF2全基因組測(cè)序和組裝約0.600 ml的噬菌體液（滴度約4.3×1012PFU/L）用于基因組DNA提取，成功提取濃度為178 g/L的高質(zhì)量噬菌體核酸。約0.100 mg的噬菌體基因組DNA用于構(gòu)建測(cè)序文庫，測(cè)序約產(chǎn)生694 679條平均長度287 bp的高質(zhì)量測(cè)序片段（Reads），約200 543 826個(gè)堿基，測(cè)序深度高達(dá)1 129倍（200 543 826÷177 689≈1 129）。約有17 280條平均長度約266 bp的Reads用于基因組序列組裝，參與組裝堿基約4 606 735個(gè)，平均覆蓋倍數(shù)為26（4 606 735÷177 689≈26）倍。噬菌體IME-CF2基因組組裝結(jié)果產(chǎn)生長約177 kbp的單一contig（重疊群），隨后成功環(huán)化此重疊群，即測(cè)序數(shù)據(jù)分析可知該噬菌體基因組是環(huán)狀的。環(huán)化后完整基因組長度為177 685 bp。

2.3IME-CF2高通量測(cè)序（HTS）高頻序列分析

噬菌體末端序列通常在其基因組復(fù)制、包裝等方面有重要作用。序列分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體高通量測(cè)序中高頻出現(xiàn)的測(cè)序序列就是該噬菌體末端序列［7］。根據(jù)文獻(xiàn)［8］建立的病毒基因組末端結(jié)構(gòu)分析方法，通過把所有原始高通量測(cè)序的Reads映射到（mapping）到組裝好基因組上，統(tǒng)計(jì)分析所有Reads的出現(xiàn)次數(shù)，并根據(jù)出現(xiàn)次數(shù)從高到底排序。大部分高通量測(cè)序Reads重復(fù)次數(shù)小于10，沒有特別高頻的測(cè)序Reads出現(xiàn)，見圖3（X軸表示Reads重復(fù)次數(shù)取值范圍。例如，X=10表示Reads重復(fù)次數(shù)在0到10之間的所有測(cè)序Reads總數(shù)，X=15表示Reads重復(fù)次數(shù)在10到15之間的所有測(cè)序Reads總數(shù)。Y軸表示Reads條數(shù)的統(tǒng)計(jì)）。高通量測(cè)序Reads的排序，見圖4，只列出前20條。從該圖可以看出最高頻的序列大概出現(xiàn)20多次，沒有特別高頻的序列出現(xiàn)，符合上述統(tǒng)計(jì)。所以，IME-CF2沒有固定的基因組末端序列，復(fù)制時(shí)開環(huán)及末端切割是隨機(jī)的。

2.4IME-CF2基因組分析IME-CF2全基因組長度為177 685 bp，基因組A、C、G、T堿基含量分別為28.3%、21.8%、21.4%和28.5%，GC含量為43.2%，共有269個(gè)開放閱讀框（ORFs），包括267個(gè)CDS和2個(gè)tRNA。269個(gè)ORF中大部分ORF的起始密碼是ATG，約占91%。CDS核酸序列長度在117～3 360 bp，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列長度在38～1 219 aa。全部的ORF共含166 089 bp的堿基，基因組基因密度高達(dá)94%。圖5為IME-CF2全基因組圈圖：共6圈，由外到內(nèi)依次為線性基因組長度代表、位于正鏈CDS、位于負(fù)鏈CDS、gene和tRNA、GC含量和GC偏移。由圖可以看出編碼區(qū)在該噬菌體正負(fù)鏈上長度大約相等，基因成簇分布，相似功能的基因鄰近，符合T4類噬菌體基因組特征。BLASTN比對(duì)表明IME-CF2與檸檬酸桿菌噬菌體Miller（178 Kbp）的同源性最高，其次是腸道菌噬菌體RB43（179 Kbp），比對(duì)覆蓋率分別為97%和92%。Miller分離于美國、RB43分離于法國，核酸序列GenBank登錄號(hào)分別為KM236237和HE858210。表2為三株噬菌體堿基組成比較。圖6為MAUVE v.2.3.1所作三株噬菌體之間的同源分析圖，可見基因組高度同源，沒有發(fā)現(xiàn)大的插入、缺失等突變，基因組間同源性較高。

2.5IME-CF2功能性O(shè)RF分析使用BLASTP分析，將具有推定基因功能的ORF分成4類：結(jié)構(gòu)與包裝模塊（紅色）；生物合成與代謝模塊（藍(lán)色）；裂解相關(guān)基因（黃色）；假想蛋白（灰色），見圖5。

使用BLASTP對(duì)蛋白序列分析表明，ORF262（噬菌體末端酶大亞基）和ORF264（噬菌體末端酶小亞基）在噬菌體包裝時(shí)起重要作用。ORF259（噬菌體口蛋白）編碼的蛋白質(zhì)能使細(xì)菌細(xì)胞膜形成空洞，這有利于噬菌體基因組核酸注入到受體細(xì)菌，同時(shí)該蛋白還具有鏈接噬菌體頭部與尾部的功能。通常上述三個(gè)ORF在基因組上臨近。結(jié)構(gòu)蛋白ORF254（主要衣殼蛋白）1 575 bp是噬菌體主要衣殼蛋白，與包裝蛋白鄰近。ORF201～ORF207編碼噬菌體尾部相關(guān)蛋白，ORF93～ORF100主要負(fù)責(zé)噬菌體尾部基底板，這兩個(gè)基因簇在噬菌體感染、吸附宿主菌時(shí)發(fā)揮重要作用。

噬菌體DNA復(fù)制及調(diào)控相關(guān)基因主要包括：ORF159（DNA聚合酶），ORF162（DNA引物酶），ORF187（DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶），ORF251（單鏈DNA結(jié)合蛋白），ORF248（DNA解旋酶）和ORF184（轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）等。ORF160（噬菌體重組蛋白）與噬菌體基因組DNA整合到宿主基因組有關(guān)。

ORF50（噬菌體裂解酶）和ORF200（溶菌蛋白）是噬菌體裂解相關(guān)基因。ORF200編碼穿孔蛋白，使細(xì)菌細(xì)胞膜穿孔。該噬菌體可能是通過同時(shí)表達(dá)上述兩種蛋白來介導(dǎo)宿主細(xì)胞裂解的。

2.6IME-CF2進(jìn)化分析為了分析IME-CF2與其他噬菌體之間的關(guān)系，采用噬菌體IME-CF2主要衣殼蛋白（ORF254）序列構(gòu)建了進(jìn)化樹。ClustalW multiple alignments軟件比對(duì)主要衣殼蛋白氨基酸序列，使用Neighbor-Joining建樹。括號(hào)為用于比對(duì)的各噬菌體蛋白質(zhì)序列登錄號(hào)。（圖7）。IME-CF2與檸檬酸桿菌噬菌體Miller及腸道菌噬菌體RB43處于同一分支，即IME-CF2與Miller及RB43親緣關(guān)系最近，屬T4類噬菌體，與全基因組比較分析相吻合。

3 討論

噬菌體是細(xì)菌病毒，是自然界中最具多樣性的生物之一。相對(duì)于抗生素治療，噬菌體療法具有其突出優(yōu)勢(shì)，噬菌體是自然界存在的生物，生產(chǎn)成本低，對(duì)細(xì)菌有高度特異性，不破壞有益菌群，一旦目標(biāo)細(xì)菌被清除噬菌體也自動(dòng)消失［9］。面對(duì)日益嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥問題，噬菌體療法重新獲得人們的關(guān)注，展現(xiàn)出廣闊的前景。為了解決抗生素耐藥問題，美國在20世紀(jì)90年代興起一些噬菌體研究公司［10］。由于噬菌體具有嚴(yán)格的宿主特異性，以及細(xì)菌在與噬菌體相互進(jìn)化過程中會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生耐受，單一噬菌體制劑將不能滿足治療要求。噬菌體混合制劑雞尾酒療法及個(gè)性化噬菌體治療方法可能是未來噬菌體治療的研究方向之一。此外，有些噬菌體攜帶耐藥基因甚至毒力基因，使得它們不可直接用于治療［11］。因此，對(duì)噬菌體進(jìn)行分離、鑒定、全基因組測(cè)序及基因組學(xué)分析顯得十分重要，不僅能夠獲得該噬菌體全面清晰的遺傳信息及進(jìn)化信息而且能為噬菌體治療奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用分離于307醫(yī)院檢驗(yàn)科的耐藥弗氏檸檬酸桿菌作指示菌，成功從醫(yī)院污水中分離一株毒性噬菌體，命名為IME-CF2。該噬菌體可在鋪有指示菌的雙層平板上形成清晰透亮的噬菌斑，預(yù)示著IME-CF2是一株毒性弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，在預(yù)防和治療弗氏檸檬酸桿菌感染方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。電鏡下IME-CF2具有典型的二十面體結(jié)構(gòu)及可收縮的尾部，具有典型的肌尾噬菌體科噬菌體形態(tài)?；蚪M學(xué)分析表明，IME-CF2與Miller及RB43相似，功能相關(guān)基因成簇分布，具有典型的T4類噬菌體基因結(jié)構(gòu)，同時(shí)進(jìn)化分析表明三者聚類到同一分支。綜合以上分析，可以確定噬菌體IME-CF2屬雙鏈DNA噬菌體下有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科的T4類噬菌體。噬菌體IME-CF2生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)值得深入研究。

（噬菌體IME-CF2全基因組核酸序列GenBank登錄號(hào)：KR869820）

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Isolation，sequencing and comp lete genome sequence analysis of bacteriophage IME-CF2 infecting Citrobacter freundii

Liu Xiaodong1，2，WangWei2，Huang Yong2，et al
（1AnhuiMedical University，Hefei 230032；2State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology，Beijing 100071）

ObjectiveTo isolate a lytic bacteriophage against Citrobacter freundii from hospital sewage，study its morphology and analyze its genome so as to provide basis for treatment and infection control of antibiotics-resistant Citrobacter freundii.MethodsA bacteriophagewas isolated from hospital sewage using Citrobacter freundii as host cell.Phagemorphology was observed using a transmission electronmicroscope and its genomewas sequenced using Ion Torrent sequencing platform.Genome annotation，comparative and evolutionary analysis were performed after the complete genome sequence was assembled.ResultsA lytic bacteriophage designed as IME-CF2 was successfully isolated against Citrobacter freundii.Transmission electronmicroscopy analysis indicated that the isolated bacteriophage IME-CF2 had an icosahedral head and displayedmorphology resembling Myoviridae family.The complete genome of IME-CF2 was 177 685 bp circular dsDNA and had a G+C content of 43.2%.The genome encodes 2 putative tRNA and 267 coding sequences（CDSs）.Phylogenetic analysis demonstrated that IME-CF2 belonged to T4-like virus and comparative analysis showed that IME-CF2 has the highest homology with previously reported Citrobacter phage Miller.ConclusionIsolation and characterization of a lytic Citrobacter phage，lay a foundation of the treatment ofmultiple drug resistant bacteria in the future.

Citrobacter freundii；bacteriophage；whole genome sequencing；genomic analysis

Q 939.48

A

1000-1492（2016）03-0315-05

時(shí)間：2016/1/28 14：23：09 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.002.html

2016-01-08接收

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（編號(hào)：2012AA022003、2014AA021402）；國家科技重大專項(xiàng)課題（編號(hào)：2013ZX10004605、2013ZX10004217-002-003）

1安徽醫(yī)科大學(xué)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，合肥 230032

2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

劉小東，男，碩士研究生；

童貽剛，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：tong62035@gmail.com