闞金蘭

( 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621000)

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分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物檢測(cè)和污染治理中的應(yīng)用

闞金蘭

( 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621000)

摘要綜述了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)、生物芯片技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)、生物傳感器4 種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的基本原理及其在環(huán)境微生物檢測(cè)和治理中的應(yīng)用，以期為現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物檢測(cè)和治理中的進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞環(huán)境微生物；聚合酶鏈反應(yīng)；生物芯片；酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)；生物傳感器

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新的微生物檢驗(yàn)技術(shù)和方法被廣泛研究和應(yīng)用。近年來經(jīng)過國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷努力，已建立了多種快速、簡(jiǎn)便、特異和低耗的微生物檢驗(yàn)技術(shù)和方法。分子生物學(xué)技術(shù)為研究微生物種群多樣性、菌種鑒定和分析提供了全新的技術(shù)手段，大大提高了對(duì)復(fù)雜微生物體系的認(rèn)識(shí)和分析能力。微生物是生態(tài)系統(tǒng)中的分解者， 有助于水體自凈和水體修復(fù)。微生物可去除有機(jī)污染物和無機(jī)污染物，為保護(hù)和修復(fù)環(huán)境創(chuàng)造了條件。微生物在環(huán)境監(jiān)測(cè)和治理中存在兩面性，水環(huán)境與微生物之間相互依存又互相影響。筆者綜述了近年來應(yīng)用于各種環(huán)境微生物檢測(cè)和治理中的分子生物學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用，以期為相關(guān)的研究提供參考。

1幾種分子生物學(xué)技術(shù)及其在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)是美國(guó)科學(xué)家 Mullis等[1]發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法,又稱基因的體外擴(kuò)增。此反應(yīng)以4種脫氧核苷酸為底物，在耐高溫聚合酶的作用下,對(duì)DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR技術(shù)的基本原理與DNA的天然復(fù)制過程相似，其特異性由寡核苷酸引物決定。PCR由變性、退火、延伸3個(gè)基本步驟構(gòu)成：①變性。模板DNA經(jīng)加熱至93 ℃左右后或在堿性條件下，DNA雙鏈的氫鍵斷裂，雙鏈DNA解離成為單鏈，稱之為DNA變性，以便與引物特異性結(jié)合； ②退火。溫度降至55 ℃左右后，解離后的單鏈DNA與引物特異性結(jié)合，形成局部雙鏈，引物一般根據(jù)目標(biāo)DNA序列人工合成； ③延伸。在Taq酶的最適溫度(72 ℃)下，以引物3′端為合成起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，在 72 ℃下，TaqDNA 聚合酶從引物的 3′端起始，dNTP為底物，靶序列為模板，以5′→3′方向延伸，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成DNA新鏈。重復(fù)循環(huán)變性、退火、延伸過程即可獲得更多的新鏈，這種新鏈又緊接著成為下次循環(huán)的模板。由此看來，PCR 反應(yīng)速度極快，待擴(kuò)增基因呈2n倍擴(kuò)增，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)單拷貝的基因經(jīng)30個(gè)左右循環(huán)即可擴(kuò)增百萬倍[2]。PCR 技術(shù)中， 設(shè)計(jì)引物的質(zhì)量至關(guān)重要。在使用 Primer Premier 5.0 等軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)， 要對(duì)引物的5′端和3′端進(jìn)行修飾。為提高擴(kuò)增產(chǎn)物的量，可以將產(chǎn)物DNA稀釋100倍左右作為第二輪模板進(jìn)行擴(kuò)增，一般二次擴(kuò)增后的DNA數(shù)量能滿足所有分子生物學(xué)操作的要求。與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法相比，PCR 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作快捷、迅速省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。

目前，PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)中運(yùn)用最廣泛的是對(duì)樣本中病原微生物的核酸進(jìn)行檢測(cè)。通過在反應(yīng)試管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，可鑒定出一種以上的病原體。此技術(shù)不受混合標(biāo)本多少和微生物生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)短的限制，即便存在大量死菌也能得到準(zhǔn)確結(jié)果，如對(duì)乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒和禽流感病毒的檢測(cè)等。PCR技術(shù)可改變微生物檢測(cè)的方式和方法，促進(jìn)分子生物學(xué)和環(huán)境微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的相互發(fā)展，使微生物檢測(cè)可在分子水平上確診，而不再局限于外部特征、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性等。

1.2生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來影響深遠(yuǎn)的科技進(jìn)展之一，是融合微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等學(xué)科為一體的高度交叉的尖端新技術(shù)[3]。按照芯片上固化的生物材料不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、多糖芯片等；根據(jù)反應(yīng)體系狀態(tài)的不同，可分為固相芯片和液相芯片。液相芯片較傳統(tǒng)的固相芯片相比，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，信息質(zhì)量更穩(wěn)定，檢測(cè)用時(shí)更少以及操作更簡(jiǎn)便。因此，液相芯片更廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，特別在病原菌感染的檢測(cè)方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。法國(guó)某企業(yè)開發(fā)了一種生物芯片，可隨時(shí)檢測(cè)飲用水中微生物的變化[4]。目前，液相芯片技術(shù)在基因檢測(cè)、細(xì)胞檢測(cè)、蛋白質(zhì)分析和藥物檢測(cè)等方面運(yùn)用廣泛，是臨床檢測(cè)和科學(xué)研究的推動(dòng)力[5]。

1.2.1基因芯片技術(shù)。隨著“人類基因組計(jì)劃”的完成，基因芯片技術(shù)已發(fā)展成為生物芯片技術(shù)一個(gè)最完備的分支，迅速成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。其原理是根據(jù)核酸的分子雜交衍生而來，用已知序列的核酸探針對(duì)未知序列的核酸序列進(jìn)行雜交檢測(cè)[6]，通過雜交信號(hào)進(jìn)一步分析目的序列?；蛐酒址Q DNA 微 陣 列(DNA microarray)，可以分為兩類 ：一是 cDNA 芯片，用于表達(dá)譜的研究，二是寡核苷酸芯片，用于表達(dá)譜的研究和基因組學(xué)的相關(guān)研究。基因芯片技術(shù)的興起給微生物檢測(cè)帶來了新的技術(shù)革命，近年來已有此技術(shù)應(yīng)用于大腸埃希菌、痢疾志賀菌、傷寒沙門菌檢測(cè)的報(bào)道[7]?；蛐酒夹g(shù)還可用于檢測(cè)多部位基因序列和基因變異，具有檢測(cè)突變點(diǎn)多、準(zhǔn)確性高、快速等優(yōu)點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)廣泛應(yīng)用于病毒病的流行病學(xué)調(diào)查，可達(dá)到對(duì)傳染病的流行進(jìn)行預(yù)測(cè)和防控的目的。在環(huán)境微生物學(xué)中，基因芯片技術(shù)可用于檢測(cè)環(huán)境微生物群落的組成結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)、功能活動(dòng)和系統(tǒng)發(fā)育等。

1.2.2蛋白芯片技術(shù)。蛋白芯片技術(shù)作為生命科學(xué)研究的新技術(shù)平臺(tái)，可以彌補(bǔ)基因芯片技術(shù)的不足，能在翻譯水平上對(duì)蛋白、 抗體等進(jìn)行檢測(cè)。蛋白芯片技術(shù)的原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，而基因芯片技術(shù)的原理是通過堿基的特異性互補(bǔ)配對(duì)。蛋白芯片技術(shù)的研究對(duì)象是蛋白質(zhì)，通過對(duì)固相載體進(jìn)行特殊化處理，將已知的蛋白產(chǎn)物固定在酶、抗原、受體等載體上，根據(jù)這些生物分子的特性，即可捕獲與之特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白，后經(jīng)洗滌、純化，再利用熒光掃描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行確認(rèn)和生化分析，可判斷生物體中是否含有該蛋白對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分，進(jìn)一步還可測(cè)定該蛋白質(zhì)功能。蛋白芯片技術(shù)的快速發(fā)展，有力地促進(jìn)了蛋白診斷和蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)研究。蛋白芯片技術(shù)可應(yīng)用于艾滋病病毒的檢測(cè)和鑒定、乙型肝炎表面抗原的鑒定和血清中多種抗體的同時(shí)檢測(cè)等。

生物芯片技術(shù)與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法相比，樣品需求量少，檢測(cè)效率高，快速直接，可方便快捷地幫助醫(yī)學(xué)工作者揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制，從而尋找更為合理有效的治療方法和途徑，在微生物檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

1.3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)(ELISA)ELISA是將酶的催化作用與抗原抗體特異性技術(shù)手段相結(jié)合而建立的一種超微量的測(cè)定技術(shù)。ELISA法是在熒光免疫和放射免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,酶標(biāo)記抗原或抗體后，不會(huì)影響抗原抗體的活性和酶自身的活性。對(duì)受檢樣品中的酶標(biāo)免疫反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果，用光學(xué)分析儀器進(jìn)行光度測(cè)定。此技術(shù)特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)用時(shí)短，成本價(jià)格低，判斷結(jié)果精確等，已被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)和污染物中農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。有些發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)、德國(guó)已開發(fā)出試劑盒應(yīng)用于食品、蔬菜和環(huán)境中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析[8]。

1.4生物傳感器生物傳感器集微電子學(xué)、材料科學(xué)和生物技術(shù)等多種學(xué)科，是一種對(duì)生物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器。生物傳感器是一個(gè)獨(dú)立的、完整的裝置，通過利用與換能器保持直接空間接觸的生物識(shí)別元件，提供特殊的定量與半定量分析信息。生物傳感器由生物識(shí)別元件和換能器兩部分組成。采用常用識(shí)別原件如酶、抗體、核酸、細(xì)胞受體等識(shí)別待測(cè)物的濃度等，然后轉(zhuǎn)譯為一定靈敏度的生物活性信號(hào)，再由換能器將生物活性信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。常用的換能器有電化學(xué)器件、光電管、聲波器件、壓電器件和熱敏電阻器等。生物傳感器應(yīng)用十分廣泛，可用于水環(huán)境和大氣環(huán)境的檢測(cè)、微生物細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定，其在發(fā)酵工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等也早有應(yīng)用。白志輝等[9]利用硫化物桿菌制成硫化物傳感器，應(yīng)用于生活污水、工業(yè)廢水等樣品中的硫化物測(cè)定。

微生物傳感器是將微生物細(xì)胞與換能器結(jié)合在一起，所固定的微生物可以是有活力的細(xì)胞，可利用其呼吸代謝作用；也可以是無活力的微生物細(xì)胞，常被用作酶的廉價(jià)替代品。微生物傳感器具有3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①穩(wěn)定性好，使用壽命長(zhǎng)；②專一性強(qiáng)，只對(duì)特定的底物起反應(yīng)，且不受顏色、濁度的影響；③可克服酶提取困難、價(jià)格昂貴和不穩(wěn)定的缺點(diǎn)[10]。

2分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物治理中的應(yīng)用

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可從微觀角度分析污染物的組成成分，從而降解污染物，有助于治理環(huán)境污染，既快速又高效。利用分子生物學(xué)技術(shù)篩選有價(jià)值的功能性微生物并加以培養(yǎng)和利用，對(duì)污水處理效果明顯。利用微生物處理環(huán)境污染物具有快速、低耗、成本低、反應(yīng)條件溫和以及無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。因此，科學(xué)家運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效菌種來治理環(huán)境中難以降解的復(fù)雜毒害化合物，如人工合成塑料、除草劑等。超級(jí)細(xì)菌在石油烴污染的環(huán)境修復(fù)中起到了重要作用：將微生物分解纖維素和木質(zhì)素的基因轉(zhuǎn)入中溫細(xì)菌中,使發(fā)酵在較高溫度下也能進(jìn)行，還可用于發(fā)酵廢棄物產(chǎn)生天然氣[11]。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的加強(qiáng)和分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)步[12]，環(huán)境污染治理的相關(guān)研究已滲透到各個(gè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。近年來,消除重金屬污染一直是世界性難題，人類運(yùn)用植物提取修復(fù)技術(shù)消除重金屬污染物已取得顯著成果[13]。其原理是將環(huán)境中殘存的重金屬污染物吸收、富集到植物體內(nèi),然后將植物經(jīng)過焚燒等途徑回收重金屬,以此減少重金屬對(duì)環(huán)境的污染。植物提取修復(fù)技術(shù)操作簡(jiǎn)單，效益高，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14]。

3結(jié)語

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，運(yùn)用各種生物學(xué)技術(shù)鑒定污水中微生物種群和基因型,更進(jìn)一步掌握污水生物處理系統(tǒng)中微生物群體的多樣性和功能特點(diǎn)，從而達(dá)到環(huán)境污染治理的目的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的日趨成熟，分子生物學(xué)技術(shù)越來越多地被應(yīng)用于污染治理研究中,因其高度的特異性、靈敏性在環(huán)境微生物污染治理中的應(yīng)用必將更為廣泛。從分子水平上闡述污水生物處理的機(jī)制，對(duì)微生物環(huán)境治理具有深刻的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。新技術(shù)的日益成熟必將對(duì)環(huán)境微生物的研究有一個(gè)整體的、系統(tǒng)的認(rèn)識(shí),也必將使研究更具目標(biāo)性和可控性。

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Application of Molecular Biology Technology in Environmental Microbe Monitoring and Management

KAN Jin-lan (College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621000)

AbstractThe basic principles of 4 kinds of modern molecular biology techniques including polymerase chain reaction(PCR)，biochip technology，enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)，biosensors were reviewed，as well as their application in environmental microbe monitoring and management. The aim was to provide reference for further research of modern molecular biology technique in environmental microbe monitoring and management.

Key wordsEnvironmental microbes; Polymerase chain reaction; Enzyme labeled immunosorbent assay; Biosensor

收稿日期2015-12-14

作者簡(jiǎn)介闞金蘭(1993- )，女，四川成都人，本科生，專業(yè)：生物工程。

中圖分類號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-171-03