熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測肺炎支原體方法的建立

郭東星，胡文娟，李 丹，李靜宜，栗紹剛，吳趙永，田秀君，辛德莉

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熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測肺炎支原體方法的建立

郭東星，胡文娟，李 丹，李靜宜，栗紹剛，吳趙永，田秀君，辛德莉

[摘要]目的 建立檢測肺炎支原體的熒光定量PCR法，并與市售試劑盒和傳統(tǒng)巢式PCR法的檢測性能進(jìn)行比較。方法 設(shè)計針對肺炎支原體社區(qū)獲得性肺炎呼吸窘迫綜合征毒素基因的特異性引物，構(gòu)建含相應(yīng)目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用SYBR Green染料法進(jìn)行實時定量PCR，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過檢測其他細(xì)菌和170例兒童臨床咽拭子樣本，比較新建熒光定量PCR法、市售試劑盒和傳統(tǒng)巢式PCR法在臨床應(yīng)用中的差異。結(jié)果 新建熒光定量PCR法和巢式PCR法能夠檢出的肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株DNA最低模板量為10拷貝，市售試劑盒檢出最低模板量為102拷貝。在特異性實驗中3種方法均可區(qū)分肺炎支原體和其他菌種。在檢測的170例兒童臨床咽試子樣本中，新建熒光定量PCR法、市售試劑盒和傳統(tǒng)巢式PCR法的陽性率分別為60.00%、50.00%和53.53%。新建熒光定量PCR法與市售試劑盒的結(jié)果具有高度相關(guān)性（r = 0.953），2種方法的總符合率為86%，Kappa值為0.729。新建熒光定量PCR法與傳統(tǒng)巢式PCR法的結(jié)果總符合率為90%，Kappa值為0.797。結(jié)論 新建熒光定量PCR法與市售試劑盒相比靈敏性更高，特異性相同，成本低；與傳統(tǒng)巢式PCR法相比操作簡單，耗時短且污染少，具有良好的科研和臨床應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]肺炎支原體；呼吸道感染；兒童；研究設(shè)計

[作者單位] 100050，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所 熱帶病防治研究北京市重點實驗室（郭東星、胡文娟、李丹、李靜宜、栗紹剛、吳趙永、田秀君、辛德莉）

肺炎支原體是引起獲得性呼吸道感染的重要病原體之一，占社區(qū)獲得性肺炎 （community aquired pneunonia, CAP ）病因的10% ~30%[1-2]。支原體肺炎暴發(fā)最常發(fā)生在相對封閉環(huán)境中，如學(xué)校、監(jiān)獄和醫(yī)院[3-4]，對學(xué)齡期兒童和青少年危害尤其嚴(yán)重。肺炎支原體還可引起其他呼吸道疾病，如氣管炎、支氣管炎、咽炎和哮喘等[2]。另外，一些肺外表現(xiàn)，如皮膚病、造血系統(tǒng)、關(guān)節(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、胰腺、腎臟等的損害及心血管綜合征等也被認(rèn)為是原發(fā)性肺炎支原體感染的后遺癥[5-6]。

肺炎支原體感染潛伏期較長 （平均1 ~2周 ），致使根據(jù)臨床癥狀出現(xiàn)之后才能進(jìn)行臨床診斷和相應(yīng)治療，因此從病原學(xué)方面及時準(zhǔn)確地診斷肺炎支原體感染對臨床治療相關(guān)疾病具有重要意義。目前肺炎支原體感染的診斷方法主要有分離培養(yǎng)法、雙份血清檢測法和核酸檢測法[7]。由于肺炎支原體生長緩慢，所需培養(yǎng)時間長 （一般需10 ~21 d ）且陽性率低，不能快速診斷，無法在臨床上推廣使用[6]；雙份血清檢測方法中，由于血清收集困難且耗時較長 （前后2份血清須間隔2 ~3周 ），無助于早期診斷；核酸擴增方法因快速、靈敏和特異性強而受到愈來愈多的關(guān)注。本研究建立了熒光定量PCR檢測肺炎支原體核酸的方法，并將新建立的方法與市售試劑盒和傳統(tǒng)的巢式PCR方法的檢測性能進(jìn)行了比較，以期能夠找到一種快速、靈敏、準(zhǔn)確且經(jīng)濟的適合廣泛應(yīng)用于臨床檢測肺炎支原體感染的方法。

1　對象與方法

1.1對象 研究對象為2014年就診于民航總醫(yī)院和北京兒童醫(yī)院兒科門診及住院的6月齡 ~14歲CAP患者，共170例，其中男87例，女83例，平均年齡 （5.0±2.9 ）歲。采集患兒咽拭子標(biāo)本，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。入組標(biāo)準(zhǔn)：具有發(fā)熱、伴咳嗽或咽痛等呼吸道感染癥狀之一，病程為1 ~7 d的門診和住院患者；白細(xì)胞總數(shù) （5.0 ~12.0 ）×109/L，中性粒細(xì)胞比例＜70%；年齡6月齡 ~14歲；性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：重癥肺炎或出現(xiàn)多系統(tǒng)、多器官損害者；患嚴(yán)重肝臟、腎臟、心血管及造血系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病及精神疾病的患兒。

1.2菌株 肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株為本實驗室保存FH菌株（ATCC 15531D） ；人型支原體（ATCC 15488）、陰溝腸桿菌（ATCC 700323）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯臨床分離株（ATCC 1705）和大腸埃希菌（ATCC 25922）均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗科惠贈。

1.3主要試劑儀器 通用型柱式基因組提取試劑盒、高純度質(zhì)粒提取試劑盒和微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；用于實時定量PCR的熒光染料Power SYBR Green PCR Master 2×Mix和ABI Prism@7500型熒光定量PCR儀均為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；用于方法比較的市售肺炎支原體核酸檢測試劑盒（熒光法） （以下簡稱市售試劑盒）購自上海復(fù)興長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1原理 首先設(shè)計針對肺炎支原體社區(qū)獲得性肺炎呼吸窘迫綜合征 （community-acquired respiratory distress syndrome, CARDS）毒素基因的特異性引物，構(gòu)建含相應(yīng)目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。然后采用SYBR Green染料法進(jìn)行實時定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合反應(yīng)熒光信號達(dá)到閾值時的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù) （cycle threshold, Ct ）值，就可以確定待測樣本含量；然后通過檢測肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株和其他細(xì)菌，比較新建立的檢測CARDS基因的熒光實時定量PCR法 （以下簡稱新建熒光定量PCR法 ）與市售試劑盒的靈敏性與特異性差異；通過檢測170例兒童臨床咽拭子樣本，比較新建熒光定量PCR法、市售試劑盒和傳統(tǒng)巢式PCR法在臨床應(yīng)用中的差異。

1.4.2引物設(shè)計 根據(jù)肺炎支原體CARDS毒素基因序列 （GenBank, accession No. DQ447750 ）設(shè)計特異性引物SD-CARDS-F/SD-CARDS-R （表1 ）。引物由美國Invitrogen公司合成，經(jīng)HPLC方式純化。

表1　檢測樣本所用引物序列及位置Table 1 Oligonucleotide sequences and their location on the CARDS (DQ447750)

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 以FH標(biāo)準(zhǔn)株為模板，使用引物SD-CARDS-F/SD-CARDS-R擴增CARDS基因片段，擴增片段長度為243 bp。PCR反應(yīng)體系：5×緩沖液10 μl，dNTP 混合液4 μl，10 μmol/L 的SD-CARDS-F/SD-CARDS-R引物各2 μl，F(xiàn)H DNA 5 μl，高保真酶0.25 μl，ddH2O 27 μl。反應(yīng)條件：98 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物切膠回收并連入pMDl8-T載體中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化、篩選陽性單克隆并進(jìn)行測序鑒定。提取測序驗證正確的克隆菌液的質(zhì)粒，對質(zhì)粒定量分析后進(jìn)行10倍梯度稀釋，以濃度為106、105、104、103、102、101copies/μl的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×SYBR Green緩沖液12.5 μl，10 μmol/L的SD-CARDS-F/SDCARDS-R引物各0.5 μl，DNA模板1.0 μl，ddH2O 10.5 μl，總體積25.0 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用ABI公司熒光定量PCR儀7500的SDS軟件分析實驗結(jié)果并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5方法學(xué)驗證

1.5.1靈敏性 采用試劑盒提取肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株FH基因組DNA，測定濃度后進(jìn)行梯度稀釋，分別以107、106、105、104、103、102、101copies/μl作為驗證靈敏性實驗的待測樣品。分別采用新建熒光定量PCR法、市售試劑盒和巢式PCR法對待測樣品進(jìn)行檢測，比較3種方法的靈敏性。新建熒光定量PCR法檢測待測樣品的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的反應(yīng)體系及條件相同。根據(jù)市售試劑盒的產(chǎn)品說明書檢測待測樣品。參照文獻(xiàn)報道的巢式PCR法合成相應(yīng)引物，采用相同的反應(yīng)條件及體系對待測樣品進(jìn)行檢測[8]，并根據(jù)測序結(jié)果判定陰性和陽性。

1.5.2特異性 采用通用型柱式基因組提取試劑盒提取大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株FH的基因組DNA作為特異性實驗的待測樣本。分別采用新建熒光定量PCR法、市售試劑盒和巢式PCR法對待測樣品進(jìn)行檢測，對巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，并比較3種方法的特異性。

1.5.3臨床樣本檢測 采用通用型柱式基因組提取試劑盒提取收集的170份臨床咽拭子樣本DNA，分別采用3種方法對其進(jìn)行檢測并對結(jié)果進(jìn)行比較。采用新建熒光定量PCR法檢測臨床樣本的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)體系及條件相同，根據(jù)樣本擴增Ct值及熔解曲線熔解溫度（melting temperature, Tm ）值綜合判定陰性和陽性，Ct值＜38且 Tm值與標(biāo)準(zhǔn)品相同則判定為陽性。根據(jù)市售試劑盒說明書，臨床樣本Ct值＜38即判定為陽性。巢式PCR法檢測臨床樣本則須將PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序后根據(jù)序列分析結(jié)果判定陰性和陽性。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。對新建熒光定量PCR法檢測結(jié)果與市售試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析；用新建熒光定量PCR結(jié)果分別與市售試劑盒和傳統(tǒng)巢式PCR法檢測結(jié)果建立配對設(shè)計2×2列聯(lián)表，進(jìn)行陽性符合率、陰性符合率、總符合率及Kappa一致性分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 用SD-CARDS-F/SD-CARDS-R引物擴增標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，得到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=-3.2556X+38.545，R2=0.999；模板量與Ct值具有良好的相關(guān)性，能夠?qū)δ０暹M(jìn)行定量。

圖1　新建熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Amplification curves and standard curve of the real-time fluorescence quantitative PCR

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1靈敏性 分別采用3種方法擴增梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)株FH基因組DNA，并對其靈敏性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示新建熒光定量PCR法和巢式PCR法在DNA模板量為10拷貝時仍能進(jìn)行擴增，市售試劑盒的最低檢出模板量為102拷貝 （表2 ）。新建熒光定量PCR法的靈敏性與巢式PCR法相同，市售試劑盒靈敏性相對較低。

表2　3種檢測方法靈敏性比較Table 2 Comparison of sensitivity among the three assay methods

2.2.2特異性 分別采用3種方法擴增大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、人型支原體、肺炎克雷白菌和肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株FH的基因組DNA （每個反應(yīng)重復(fù)3次 ），并對其特異性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示除FH DNA外，新建熒光定量PCR法和市售試劑盒對上述其他菌種DNA均未出現(xiàn)擴增，巢式PCR法擴增金黃色葡萄球菌DNA出現(xiàn)較弱條帶，但測序結(jié)果分析表明產(chǎn)物片段為金黃色葡萄球菌DNA序列而非肺炎支原體23S目的基因片段（表3）。說明3種方法均能區(qū)分肺炎支原體與上述其他所用菌種，均具有良好的特異性。

表3　3種檢測方法的特異性比較Table 3 Comparison of specificity among the three assay methods

2.2.3臨床樣本檢測 分別采用3種方法擴增170份臨床咽試子樣本DNA，并對相應(yīng)的檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。新建熒光定量PCR法檢測臨床樣本結(jié)果顯示，170例標(biāo)本中，102例Ct值＜38且Tm值與標(biāo)準(zhǔn)品相同，結(jié)果判定為陽性 （圖2 ），陽性檢出率為60.00%。市售試劑盒檢測臨床樣本結(jié)果顯示，170例標(biāo)本中，85例Ct值＜38判定為陽性，陽性檢出率為50.00%。巢式PCR法最終測序結(jié)果分析表明91例為陽性，陽性檢出率為53.53%。 2.2.3.1 新建熒光定量PCR法與市售試劑盒檢測陽性臨床樣本的Ct值相關(guān)性 新建熒光定量PCR法與市售試劑盒的檢測結(jié)果具有高度相關(guān)性（n=82， r=0.953，P=0.001 ）。見圖3。 2.2.3.2 3種方法的一致性分析 見表4~5。一致性分析所用公式為：陽性符合率=2種方法均為陽性標(biāo)本數(shù)/新建熒光定量PCR法陽性標(biāo)本數(shù)；陰性符合率=2種方法均為陽性標(biāo)本數(shù)/新建熒光定量PCR法陽性標(biāo)本數(shù)；總符合率= （2種方法均為陽性標(biāo)本數(shù)+2種方法均為陰性標(biāo)本數(shù) ）/樣本總數(shù)。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)品和陽性代表樣本的擴增曲線和熔解曲線

圖3　新建熒光定量PCR與市售試劑盒檢測結(jié)果Ct值相關(guān)性Figure 3 Comparison of the correlation of Ct value between real-time fluorescence quantitative PCR and the kit

表4　新建熒光定量PCR與傳統(tǒng)巢式PCR檢測結(jié)果（例）Table 4 Comparison of consistency between the realtime fluorescence quantitative PCR and nested PCR (cases)

表5　新建熒光定量PCR與市售試劑盒檢測結(jié)果（例）Table 5 Comparison of consistency between the realtime fluorescence quantitative PCR and the kit (cases)

新建熒光定量PCR法與市售試劑盒的陽性符合率為80%，陰性符合率為96%，總符合率為86%，Kappa值為0.729；新建熒光定量PCR法與傳統(tǒng)巢式PCR的陽性符合率為86%，陰性符合率為96%，總符合率為90%，Kappa值為0.797。說明本研究所建立的新建熒光定量PCR法與市售試劑盒、傳統(tǒng)巢式PCR法的符合率及一致性均良好。

3　討 論

肺炎支原體是引起呼吸道感染和肺外并發(fā)癥的重要病原體之一，建立能夠快速、準(zhǔn)確且經(jīng)濟地適用于臨床廣泛應(yīng)用的檢測肺炎支原體感染的方法具有重要意義。實時定量PCR法與傳統(tǒng)檢測肺炎支原體方法相比因具有更高的靈敏性、特異性且耗時短而受到廣泛關(guān)注[9]。CARDS因子能夠使宿主細(xì)胞空泡化，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，參與了肺炎支原體所引發(fā)的疾病過程，是肺炎支原體的一個重要毒力因子[10-12]。CARDS的研究對闡明肺炎支原體感染的發(fā)病機制具有重要意義。本研究建立了針對檢測肺炎支原體CARDS毒力基因片段的熒光實時定量PCR法，共設(shè)計了針對CARDS基因中不同片段的4對引物，通過比較其靈敏性，最終選擇SD-CARDS-F/SD-CARDS-R作為本研究的引物，并與市售試劑盒和傳統(tǒng)巢式PCR法比較，驗證該方法的靈敏性和特異性。新建熒光定量PCR法和巢式PCR法能夠檢測出低至10 拷貝DNA，市售試劑盒的最低檢出模板量為102拷貝，說明新建熒光定量PCR法能夠達(dá)到巢式PCR法的靈敏性，較市售試劑盒高出一個數(shù)量級，對于檢測低拷貝量的臨床標(biāo)本較目前市售試劑盒具有較大優(yōu)勢。

本研究采用3種方法擴增人型支原體、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷白桿菌和肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株FH的基因組DNA，結(jié)果表明，3種方法均能區(qū)分FH與其他菌種DNA，與其他常見的支原體或細(xì)菌無交叉反應(yīng)，均具有良好的特異性。但所選用的特異性實驗菌種較為有限，在后續(xù)研究中，還應(yīng)選擇更多的菌種進(jìn)行實驗，對其特異性進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。

本研究分別采用3種方法擴增170份臨床咽拭子樣本DNA，并對相應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，新建熒光定量PCR法、市售試劑盒和巢式PCR法檢測臨床樣本的陽性檢出率分別為60.00%、50.00%和53.53%。相關(guān)性分析表明，新建熒光定量PCR法與市售試劑盒檢測臨床樣本的結(jié)果具有高度相關(guān)性（r=0.953）；一致性分析表明，新建熒光定量PCR與市售試劑盒和巢式PCR法的總符合率分別為86%和90%，Kappa值分別為0.729 和0.797，說明新建熒光定量PCR法與其他2種方法的符合率及一致性均良好。因臨床樣本在采集、運輸和DNA提取操作過程中存在諸多不確定因素，本研究采用的3種方法僅能對臨床樣本中肺炎支原體菌體進(jìn)行定性檢測。在后續(xù)研究中，可以選擇特定的看家基因作為內(nèi)參，在反應(yīng)體系中加入相應(yīng)的檢測引物，對臨床樣本進(jìn)行相對定量研究。

目前市售試劑盒均采用探針法，探針合成成本較高，導(dǎo)致其售價較高，使其在實驗室或臨床的大樣本量檢測中的推廣應(yīng)用受到一定限制；而巢式PCR法須進(jìn)行2輪PCR擴增反應(yīng)，還需開蓋操作和電泳鑒定，致使污染風(fēng)險較高，且須進(jìn)一步測序分析，操作繁瑣、耗時較長，也不利于其在臨床大樣本量檢測中的應(yīng)用；而新建熒光定量PCR法只需1輪PCR操作，無須進(jìn)行電泳及測序，提高了檢測效率，且采用染料法進(jìn)行擴增降低了實驗成本，通過對其引物的深入優(yōu)化克服了染料法相對探針法靈敏性較低的缺點，甚至使其靈敏性高于現(xiàn)市售試劑盒。因此，新建熒光定量PCR法是一種能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確且經(jīng)濟地檢測肺炎支原體的方法，具有較高的臨床推廣應(yīng)用價值。

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（2015-08-20 收稿 2015-10-15 修回）

（責(zé)任編委 趙 敏 本文編輯 張云輝）

·專題綜述·

Development of real-time fluorescence quantitative PCR for the detection of Mycoplasma pneumoniae

GUO Dong-xing, HU Wen-juan, LI Dan, LI Jing-yi, LI Shao-gang, WU Zhao-yong, TIAN Xiu-jun, XIN De-li*
Beijing Key Laboratory for Research on Prevention and Treatment of Tropical Diseases, Beijing Tropical Medicine Research Institute,
Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China
*Corresponding author, E-mail: xindl48@126.com

[Abstract]Objective To develop a new real-time fluorescence quantitative PCR assay for the detection of Mycoplasma pneumoniae, and to compare its detection performance with the kit and traditional nested PCR method. Methods According to the sequence of community-acquired respiratory distress syndrome toxin gene in Mycoplasma pneumoniae, specific primers were designed and the standard plasmids were constructed. The standard curve was drawn in the real-time PCR using SYBR green as fluorescence reporter. And then the sensitivity and specificity of the newly-developed real-time PCR assay were compared with those of the kit and traditional nested PCR method by detecting other bacteria and 170 throat swab samples from child patients. Results In the sensitivity tests, the newly-developed real-time fluorescence PCR and nested PCR could detect 10 copies of FH DNA, while the kit could detect 100 copies. In the specificity tests, no amplification of other Mycoplasma or bacteria was observed using newly-developed real-time fluorescence PCR and the kit. In detecting the 170 throat swab samples from child patients, the positive rates of newly-developed real-time fluorescence PCR, the kit and nested PCR were 60.00%, 50.00% and 53.53%, respectively. The newly-developed realtime fluorescence PCR had good correlation with the kit (r=0.953), and the total consistency rate of these two methods was 86% with Kappa value of 0.729, while that of the newly-developed real-time fluorescence PCR and nested PCR was 90% with Kappa value of 0.797. Conclusions The newly-developed real-time fluorescence PCR assay is more sensitive and cheaper than the kit with the same specificity, and more rapid and laborsaving than the nested PCR in detecting Mycoplasma pneumoniae from the clinical samples. So the newly-developed real-time fluorescence PCR assay can be used widely in scientific research and clinical application.

[Key words]Mycoplasma pneumoniae; respiratory tract infections; child; research design

[通訊作者]辛德莉，E-mail: xindl48@126.com

[基金項目]北京市科技計劃課題（Z131100004013029）；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)-臨床課題（14JL28）

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.01.010

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號] R375.2；R517.6 A

[文章編號]1007-8134(2016)01-0052-05