張敏，孔雁，姜達(dá)

(1邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北邢臺(tái)054001；2河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院)

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普伐他汀對人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖的抑制作用及其機(jī)制

張敏1，孔雁2，姜達(dá)2

(1邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北邢臺(tái)054001；2河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院)

摘要：目的探討普伐他汀對人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖的抑制作用及其機(jī)制。方法 分別用含普伐他汀0、1、5、10、15、20、25、50 μmol/L的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞SW1990，24、48、72、96 h后采用MTT比色法檢測細(xì)胞抑制率，以觀察普伐他汀對SW1990細(xì)胞增殖的影響。48 h后采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布并測算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)，以觀察0、5、10、20 μmol/L普伐他汀對SW1990細(xì)胞周期分布和凋亡的影響，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀及間接免疫熒光技術(shù)分析普伐他汀作用后SW1990細(xì)胞p21Ras、細(xì)胞周期蛋白激酶4(CDK4)、Bax蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果普伐他汀(1、5、10、15、20、25、50 μmol/L)對SW1990細(xì)胞具有抑制增殖的作用，有明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系(P均<0.05)。普伐他汀作用SW1990細(xì)胞后，有明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀作用SW1990細(xì)胞48 h后，隨藥物濃度增大, G0/G1期細(xì)胞逐漸增多; S期和G2/M期細(xì)胞則逐漸減少(P均<0.05)。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀處理細(xì)胞48 h后，出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，依普伐他汀濃度增大而逐漸升高；細(xì)胞凋亡率分別為1.06%、6.24%、12.46%、17.21%。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀處理SW1990細(xì)胞48 h后，p21Ras、CDK4的熒光指數(shù)FI值隨處理濃度增大而逐漸降低；Bax的FI值則隨處理濃度增大而逐漸升高(P均<0.05)。結(jié)論 普伐他汀可通過下調(diào)p21Ras、CDK4蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖、誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用。

關(guān)鍵詞：胰島腫瘤;普伐他汀;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;SW1990

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤[1]。其起病隱襲，缺乏特異癥狀和體征，惡性度極高。他汀類藥物是內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶-羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑，能有效抑制膽固醇合成及阻礙甲羥戊酸(MVA)途徑，臨床普遍用于治療和預(yù)防高脂血癥和其他心血管事件。近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。2011年12月~2013年12月，本實(shí)驗(yàn)通過研究普伐他汀對SW1990細(xì)胞的體外作用及其相關(guān)機(jī)制，旨在為臨床治療胰腺癌提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。將SW1990細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(含青霉素100 U/mL,鏈霉素100 U/mL)中，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)處理后調(diào)整適宜細(xì)胞濃度，以臺(tái)酚藍(lán)測定細(xì)胞活力在95%以上備用。普伐他汀為中國藥品生物制品鑒定所產(chǎn)品，將普伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇溶解，加0.1 mol/L的NaOH激活，水浴滴定后，配制成1 mmol/L。MTT溶液用pH值7.4的0.1 mol/L的PBS配制成5 mg/mL，分裝保存。鼠抗人單克隆抗體p21Ras、鼠抗人單克隆抗體細(xì)胞周期蛋白激酶4(CDK4)、鼠抗人單克隆抗體Bax均為美國Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品。

1.3SW1990細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將SW1990細(xì)胞以4×105/瓶接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后, 用含普伐他汀0、5、10、20 μmol/L的RPMI1640培養(yǎng)基換液,繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，分別于不同時(shí)相點(diǎn)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并隨機(jī)拍照。

2結(jié)果

2.1不同濃度普伐他汀不同時(shí)間對SW1990細(xì)胞增殖的影響見表1。

表1　不同濃度普伐他汀不同時(shí)間對SW1990細(xì)胞增殖的影響±s)

注：與0 μmol/L普伐他汀比較，*P<0.05 ,**P<0.01。

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果光學(xué)顯微鏡下可見，未加普伐他汀組細(xì)胞數(shù)目較多，形態(tài)規(guī)則，呈長條形貼壁生長。在普伐他汀作用下，SW1990細(xì)胞縮小呈紡錘狀，兩端各有一細(xì)長的偽足。隨普伐他汀濃度增大和作用時(shí)間延長，這種變化逐漸明顯，SW1990細(xì)胞漸變圓，貼壁細(xì)胞減少，脫落細(xì)胞增多。同時(shí)，可見到細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞皺縮、破裂呈不規(guī)則形，在細(xì)胞周圍有放射狀分布的點(diǎn)片狀細(xì)胞碎片，有的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡。隨藥物濃度增加和作用時(shí)間延長，細(xì)胞破碎增多，培養(yǎng)基中可見到大量細(xì)胞碎片。

2.3不同濃度普伐他汀對SW1990細(xì)胞周期分布和凋亡的影響不同濃度普伐他汀對SW1990細(xì)胞周期分布的影響見表2。SW1990細(xì)胞經(jīng)不同濃度普伐他汀處理48 h后，流式細(xì)胞儀測得典型的亞二倍體凋亡峰,隨普伐他汀濃度增大而逐漸升高; 0、5、10、20 μmol/L普伐他汀處理SW1990細(xì)胞48 h后，凋亡率分別為1.06%、6.24%、12.46%、17.21%。

表2　不同濃度普伐他汀對SW1990細(xì)胞周期

注：與0 μmol/L普伐他汀比較，*P<0.05 ,**P<0.01。

2.4不同濃度普伐他汀對SW1990細(xì)胞p21Ras、CDK4、Bax蛋白表達(dá)的影響見表3。

表3　不同濃度普伐他汀對SW1990細(xì)胞p21Ras、

注：與0 μmol/L普伐他汀比較，*P<0.05 ,**P<0.01。

3討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2，3]、抑制VEGF表達(dá)從而具有抗腫瘤血管生成[4]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡、降低腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力[5]及放化療增敏、逆轉(zhuǎn)耐藥[6]等作用。他汀類藥物在胰腺癌的作用日益受到重視，一些臨床研究也證實(shí)他汀類藥物能延長可切除胰腺癌患者的生存期[7]、降低胰腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[8]、協(xié)同進(jìn)展期胰腺癌化療增敏作用。

Ras是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)癌基因，廣泛存在于動(dòng)物和酵母細(xì)胞中。Bos等認(rèn)為Ras和腫瘤的發(fā)生及腫瘤細(xì)胞的異常增殖相關(guān)。國外研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用他汀類藥物后膜結(jié)合的Ras蛋白減少，而胞質(zhì)中的Ras蛋白含量增加[9]。楊士杰等報(bào)道，辛伐他汀能阻滯p21Ras蛋白錨定于肝癌細(xì)胞SMMC-7721的細(xì)胞膜上，使膜表面的p21Ras蛋白水平下降。本實(shí)驗(yàn)中, 普伐他汀作用SW1990細(xì)胞后, 具有抑制SW1990細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用，此作用隨藥物濃度增加和處理時(shí)間延長而增強(qiáng)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn), 隨普伐他汀抗增殖作用和誘導(dǎo)凋亡作用的增強(qiáng)，SW1990細(xì)胞膜表面p21Ras蛋白水平進(jìn)行性下降。說明他汀類藥物能通過靶向抑制HMG-CoA還原酶及MVA途徑，干擾Ras蛋白的膜定位從而阻滯Ras功能的正常發(fā)揮，產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用。

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制涉及細(xì)胞周期蛋白(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)及細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑(CKIs)等。細(xì)胞周期調(diào)控的核心是cyclins和CDKs結(jié)合形成的絲/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合體的激活。大量研究顯示，他汀類藥物能阻滯多種腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程于G1期，同時(shí)伴有cyclins、CDKs的表達(dá)降低，CKIs p21和p27水平升高。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)普伐他汀可阻滯SW1990細(xì)胞于G1期，同時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)CDK4蛋白表達(dá)以一種劑量依賴性方式下降。推測普伐他汀作用SW1990細(xì)胞后，CDK4表達(dá)降低，某些p21家族和(或)p16家族的CDIs制劑水平升高，與CDK4-cyclinD結(jié)合增強(qiáng)，抑制其活性，阻止pRb蛋白磷酸化，從而阻滯細(xì)胞周期于G1期，介導(dǎo)了SW1990細(xì)胞的增殖受抑和凋亡發(fā)生。

近年來，細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)系逐漸得到人們的認(rèn)識(shí)和重視。Bcl-2家族是目前最重要的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，其成員可分為兩大類：凋亡抑制基因(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等)和促凋亡基因(Bax、Bad、Bak等)。Bcl-2是重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因，而Bax和Bcl-2的作用相反。一般認(rèn)為Bax基因和 Bcl-2基因兩者表達(dá)水平之間的平衡與否，決定了細(xì)胞是否凋亡。許多研究者認(rèn)為他汀類藥物通過上調(diào)Bax基因表達(dá)和下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，介導(dǎo)了多種腫瘤細(xì)胞的線粒體凋亡通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普伐他汀可誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞發(fā)生凋亡, 該作用呈劑量依賴關(guān)系。0、5、10、20 μmol/L普伐他汀作用細(xì)胞48 h后，隨著濃度增加，Bax表達(dá)上調(diào), 推測Bax基因的過表達(dá)是普伐他汀誘發(fā)SW1990細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

總之，普伐他汀可通過下調(diào)p21Ras、CDK4蛋白的表達(dá)和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖、誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用。

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(收稿日期：2015-05-21)

中圖分類號(hào)：R736.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)01-0030-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.010