郭 津， 劉 陽(yáng),4， 王 超， 白玲玲， 韓小唯， 張?chǎng)侮?yáng)， 孫艷秋， 王魯川△， 姜志梅，3△

(1. 佳木斯大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154002； 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 4. 哈爾濱市第四醫(yī)院， 黑龍江 哈爾濱 150026)

慢性癲癇大鼠心肌中鈣敏感受體及絲裂原活性蛋白激酶表達(dá)的改變*

郭 津1， 劉 陽(yáng)1,4， 王 超2， 白玲玲1， 韓小唯2， 張?chǎng)侮?yáng)1， 孫艷秋1， 王魯川2△， 姜志梅1，3△

(1. 佳木斯大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154002； 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 4. 哈爾濱市第四醫(yī)院， 黑龍江 哈爾濱 150026)

目的：觀察鈣敏感受體在癲癇大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)和絲裂原活化蛋白激酶途徑的變化。方法：戊四氮成功點(diǎn)燃慢性癲癇模型；Wistar健康雄性大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組；癲癇組；癲癇+精胺組；癲癇+精胺+Chalhex231組；癲癇+Chalhex231組，每組各12只。模型組用PTZ亞驚厥劑量(35 mg/kg)持續(xù)腹腔注射28 d后停藥1周，再用相同劑量的PTZ測(cè)試，對(duì)照組以等容生理鹽水代替PTZ 腹腔注射，依據(jù)Racine行為學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)連續(xù)5次出現(xiàn)Ⅱ級(jí)以上發(fā)作者視為成功點(diǎn)燃慢性癲癇模型；以鈣敏感受體激動(dòng)劑精胺，鈣敏感受體抑制劑Chalhex231做為干預(yù)因素，(精胺3 μmol/L和Chalhex231 2 μmol/L)；檢測(cè)血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶；檢測(cè)心肌功能、大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化、心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、心肌中鈣敏感受體以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 ERK、 p-ERK、p-JNK表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，癲癇組CK、CK-MB含量明顯升高，心臟超聲顯示心臟順應(yīng)性下降，左室功能降低，E/A<1。心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示損傷嚴(yán)重。CaSR表達(dá)進(jìn)一步增加，p-JNK蛋白表達(dá)增加，p-ERK蛋白表達(dá)減少。精胺能夠促進(jìn)癲癇所誘發(fā)的CaSR蛋白表達(dá)增多、p-JNK蛋白表達(dá)增加，p-ERK蛋白表達(dá)減少；Chalhex231的作用相反。結(jié)論：慢性癲癇可誘發(fā)心肌改變，CaSR表達(dá)增多可能參與癲癇慢性發(fā)作時(shí)心肌損傷，MAPK信號(hào)通路可能參與慢性癲癇心肌損傷過(guò)程。

鈣敏感受體；絲裂原活化蛋白激酶；癲癇；心肌；大鼠

癲癇是一種常見(jiàn)的以反復(fù)突然發(fā)作的意識(shí)喪失伴抽搐為主要癥狀的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全世界有超過(guò)五千萬(wàn)的癲癇患者[1,2]，其中10%～15%的癲癇突發(fā)死亡為不明原因的猝死[3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究認(rèn)為,癲癇不明原因的猝死可能與癲癇頻繁發(fā)作導(dǎo)致的呼吸與循環(huán)功能紊亂有關(guān)。癲癇發(fā)作時(shí),患者常出現(xiàn)心率改變,甚至心律失常、心臟驟停等,這種由腦部病變引起的心臟損傷稱(chēng)為腦心綜合征。自1954年Bruch首次報(bào)道腦心綜合征以來(lái)，其逐漸為大家所認(rèn)識(shí)。但是臨床尚未將腦心綜合征發(fā)病機(jī)制完全闡明，多認(rèn)為關(guān)聯(lián)于腦損傷后體液調(diào)節(jié)障礙、血流動(dòng)力學(xué)改變以及血管病變等[4]。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C家族成員，主要功能為維持機(jī)體鈣與其他金屬離子的穩(wěn)定狀態(tài)，參與基因表達(dá)，調(diào)節(jié)激素分泌，激活離子通道，細(xì)胞分化與凋亡以及衰老等過(guò)程[5,6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase, MAPK)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一類(lèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動(dòng)物中，MAPK 可以被物理應(yīng)激、細(xì)胞因子和細(xì)菌復(fù)合物等細(xì)胞外信號(hào)或刺激激活，并將這些刺激信號(hào)通過(guò)三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方式傳遞到細(xì)胞核中，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、侵襲、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[7]。本課題組曾用戊四氮(pentetrazole, PTZ)復(fù)制大鼠癲癇發(fā)作模型可引起大鼠腦組織CaSR表達(dá)增加和細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能也參與癲癇的發(fā)作[8]。癲癇是腦部疾患的一種，本研究將從腦心綜合癥的角度出發(fā)，觀察CaSR在癲癇大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)和MAPK途徑的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成年雄性清潔級(jí)Wistar大鼠，體重(180±10) g(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)；RIPA裂解液(索萊寶科技有限公司)；Anti-CaSR,Anti-p-ERK,Anti-p-JNK,Anti-p-P38(Cell Signaling Technology,USA)； 電泳儀JY600C(北京六一電泳設(shè)備有限公司)；H-600A型透射電鏡(日立)；視頻腦電(EMS 奧地利)；超聲(飛利浦 德國(guó))。

1.2 分組及模型制作

健康成年雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為5組(n=12)：(1)正常組(C)：每天腹腔注射生理鹽水，劑量等同PTZ，連續(xù)28 d；(2)癲癇組(EP)：每天腹腔注射PTZ(35 mg/kg)1次，連續(xù)28 d，停藥7 d，再用同劑量注射一次；配制方法：將戊四氮溶解在0.9%生理鹽水中，戊四氮的濃度為20 mg/ml。注射后記錄癲癇發(fā)作的級(jí)別、發(fā)作持續(xù)時(shí)間 (s)及發(fā)作潛伏期(即注入PTZ 到首次癇性發(fā)作之間經(jīng)歷的時(shí)間)，出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以上發(fā)作的大鼠視為模型制備成功[9]。(3) EP+精胺(CaSR激動(dòng)劑)：同2組，停藥7 d里每天尾靜脈注射精胺(3 μmol/L)一次；(4) EP+Calhex231+精胺：同2組，停藥7 d里每天尾靜脈注射Calhex231(2 μmol/L)和精胺(3 μmol/L)各1次；(5) EP+ Calhex231(CaSR抑制劑)：同2組，停藥7 d里每天尾靜脈注射Calhex231(2 μmol/L)1次。

1.3 大鼠心臟超聲心動(dòng)圖檢查

腹腔水合氯醛 (劑量為350 mg/kg) 腹腔麻醉,仰臥位固定麻醉的大鼠后,胸部備皮,應(yīng)用線(xiàn)陣探頭，選擇探頭頻率為7.0 MHz，對(duì)大鼠心臟行超聲檢查。探頭置于大鼠左胸,首先在胸骨旁左心室短軸取得滿(mǎn)意的二維圖像后,然后將M型取樣線(xiàn)在乳頭肌水平，垂直于室間隔和左心室后壁獲取大鼠心臟M型超聲心動(dòng)圖。

1.4 大鼠心肌酶學(xué)檢測(cè)

將麻醉后大鼠, 取眼球血2 ml, 3 000 r/min 4℃離心10 min,取上層血清, 按照試劑盒說(shuō)明嚴(yán)格操作, 分別檢測(cè)肌酸激酶(phosphocreatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)的活性。

1.5 心肌組織形態(tài)學(xué)的光鏡觀察

于大鼠心尖部切取1 mm×1 mm×1 mm心室組織，4%多聚甲醛磷酸緩沖溶液固定24～48 h。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、染色、透明和封片, 制作成普通的HE染色切片。用日本產(chǎn)Nikon ECLIPSE顯微圖像分析系統(tǒng)E100進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 心肌超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察

切取兩組大鼠心尖區(qū)心肌,進(jìn)一步切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊, 用2.5%戊二醛前固定, 1%鋨酸進(jìn)行后固定, 然后用丙酮逐級(jí)的脫水,再用環(huán)氧樹(shù)脂包埋, 超薄切片, 最后1%醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色, 然后應(yīng)用H-600A型透射電鏡(日立)觀察。

1.7 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞CaSR、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白表達(dá)水平

取20 μg蛋白，用電泳儀JY600C進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，然后用100 V電壓轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF膜)上1 h。將該膜放在含5%脫脂牛奶的封閉液中封閉，37℃ 1 h；用封閉液稀釋一抗，4℃震蕩過(guò)夜。反復(fù)洗膜，將膜在堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgG (1∶1 000)中孵育，室溫輕搖1 h，洗膜，用Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞CaSR、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulatedproteinkinas， ERK),(proteaseextracellular -signal regulatedproteinkinase，p-ERK)、(protease c -Jun amino -terminal kinase，p-JNK)蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腦電圖的變化

對(duì)照組大鼠腦電圖以α、β波為主，散在θ波，無(wú)異常放電表現(xiàn)。癲癇組大鼠腦電圖表現(xiàn)為，陣發(fā)性高幅尖波，棘波、棘慢復(fù)合波(圖1)。

Fig. 1 The EEG findings from different groups A: Control; B: Epilepsy

2.2 心臟超聲心動(dòng)圖檢查的結(jié)果

與正常大鼠超聲心動(dòng)圖比較，慢性癲癇組大鼠左室功能下降，左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular enjection fraction,LVEF)和左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening,FS),均降低，E/A<1。各組大鼠心臟超聲心動(dòng)圖變化情況見(jiàn)圖2。

Fig. 2 The echocardiography findings from different groups A: Control; B: Epilepsy

2.3 兩組大鼠心肌酶學(xué)檢測(cè)的結(jié)果

與對(duì)照組比較，癲癇組大鼠血肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量均增高(P<0.05，表1)。

GroupCK CK?MB Control827±83466±46Epilepsy2035±202?672±67?

CK： Phosphocreatine kinase； CK-MB： Creatine phosphokinase-isoenzyme-MB

*P<0.05vscontrol

2.4 兩組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察的結(jié)果

HE染色光鏡400倍視野下所見(jiàn): 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞，肌絲排列整齊, 橫紋和細(xì)胞核清晰;癲癇組心肌細(xì)胞，肌絲排列紊亂，橫紋模糊, 部分胞漿消失溶解(圖3)。

Fig. 3 Morphological observation of rat myocardial cells under light microscope (HE ×400) A: Control; B: Epilepsy

2.5 兩組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察的結(jié)果

透射電鏡下見(jiàn)：對(duì)照組心肌細(xì)胞肌絲排列得整齊, 閏盤(pán)和橫紋結(jié)構(gòu)清晰, 細(xì)胞核和線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)完整；癲癇組心肌細(xì)胞肌束間出現(xiàn)水腫，肌絲片狀溶解斷裂，線(xiàn)粒體腫脹、嵴溶解融合或有電子致密物沉積，空泡現(xiàn)象(圖4)。

Fig. 4 The ultrastructural alteration of cardiac tissues under electron microscope (×8 k) A: Control; B: Epilepsy

2.6 五組大鼠心肌細(xì)胞CaSR、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白表達(dá)水平的變化

癲癇組大鼠心肌細(xì)胞的CaSR,ERK,p-ERK,p-JNK蛋白表達(dá)變化與正常組比較。CaSR表達(dá)增高(P<0.05)。ERK表達(dá)減少(P<0.05), p-JNK表達(dá)增高(P<0.05)而p-ERK表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05，圖5-7)。

Fig. 5 Western blot analysis for CaSR in rat cardiac tissue of different groups. The protein changes values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

Fig. 6 Western blot analysis for p-JNK in rat cardiac tissue of different groups. The proteins change values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

3 討論

癲癇是人類(lèi)一大頑疾，但癲癇是否引起心臟損傷，具體損傷機(jī)制如何仍不清楚。目前癲癇模型中以點(diǎn)燃模型應(yīng)用最為廣泛，認(rèn)為其機(jī)制與人類(lèi)癲癇發(fā)病機(jī)制相類(lèi)似[10]。PTZ 點(diǎn)燃不僅可以提高發(fā)作的易感性，還可以導(dǎo)致腦部功能的改變，目前認(rèn)為PTZ 點(diǎn)燃癲癇模型為難治性癲癇較為理想的模型[11]。介于以上原因，本實(shí)驗(yàn)采用了腹腔內(nèi)注射PTZ 的方法制作慢性癲癇模型。腦電圖表現(xiàn)的癇性發(fā)放和臨床發(fā)作是判斷癲癇發(fā)作的兩個(gè)主要特征。本實(shí)驗(yàn)采取臨床觀察與腦電圖監(jiān)測(cè)，其結(jié)果顯示大鼠慢性癲癇模型制作成功。

Fig. 7 Western blot analysis for ERK in rat cardiac tissue of different groups. The protein changes values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

采用超聲心動(dòng)圖和血清心肌酶檢測(cè)。超聲心動(dòng)圖觀察到模型組左室順應(yīng)性減低，射血分?jǐn)?shù)降低，心肌酶學(xué)檢查中模型組CK,CK-MB升高，其中的CK-MB被認(rèn)為能夠特異性地反映心肌受損。綜上所述，故可推斷，在慢性癲癇發(fā)病過(guò)程中存在著心臟功能與心肌的受損。

采用HE染色和透射電鏡觀察。HE染色發(fā)現(xiàn)模型組與對(duì)照組相比心肌形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)肌絲排列紊亂，橫紋模糊，部分胞漿消失溶解；透射電鏡下模型組表現(xiàn)心肌細(xì)胞肌束間出現(xiàn)水腫，肌絲片狀溶解斷裂，線(xiàn)粒體腫脹、嵴溶解融合，空泡現(xiàn)象。從形態(tài)學(xué)角度均能說(shuō)明慢性癲癇發(fā)病中心肌細(xì)胞發(fā)生損傷。

從病理生理角度分析，癲癇發(fā)病過(guò)程中心肌損傷可能與以下因素有關(guān)：癲癇發(fā)作時(shí)，腦電沖動(dòng)異常增加，導(dǎo)致交感和副交感神經(jīng)失衡，影響心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)和心肌的復(fù)極化,造成心臟損傷，癲癇發(fā)作時(shí)，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，交感-腎上腺系統(tǒng)釋放大量?jī)翰璺影?、去甲腎上腺素，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈痙攣或收縮，造成心肌缺血性損傷。

眾多實(shí)驗(yàn)已表明，CaSR表達(dá)增多時(shí)心肌損傷較重,并已有文獻(xiàn)證實(shí)CaSR通過(guò)G蛋白-PLCIP3通路引起細(xì)胞內(nèi)鈣增加，參與心肌鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，是細(xì)胞鈣超載的發(fā)生機(jī)制之一[12,13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫蛋白印記法證實(shí)在慢性癲癇大鼠模型中，CaSR表達(dá)增加(P<0.05)。說(shuō)明鈣敏感受體的增加可能參與了慢性癲癇心肌的損傷過(guò)程。

近年來(lái)，在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方面，已經(jīng)對(duì)凋亡的效應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制特別針對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行深入的研究，其中酪氨酸激酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK通路在CaSR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用開(kāi)始受到人們重視。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已鑒定4條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本實(shí)驗(yàn)選取其中兩條通路即ERK通路和JNK通路。磷酸化的ERK和JNK為其活性狀態(tài)。在大多數(shù)情況下，ERK發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，而JNK表現(xiàn)為促凋亡作用[14]。這與本實(shí)驗(yàn)采用Western bolt技術(shù)所得出結(jié)果相吻合，ERK的表達(dá)減少(P<0.05), p-JNK表達(dá)增加(P<0.05),說(shuō)明ERK通路和JNK通路參與慢性癲癇心肌損傷的過(guò)程。運(yùn)用CaSR激動(dòng)劑和阻斷劑，進(jìn)一步證實(shí) CaSR的表達(dá)增加通過(guò)分別激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的ERK通路保護(hù)心肌細(xì)胞和JNK通路促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)p-ERK表達(dá)無(wú)顯著變化，可能因?yàn)榱姿峄牡鞍自谠囼?yàn)操作過(guò)程中發(fā)生去磷酸化，而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PTZ點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠模型，觀察到CaSR參與大鼠癲癇發(fā)作時(shí)心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡，并揭示CaSR的表達(dá)增多可分別使ERK通路和JNK通路中的ERK磷酸化減少和JNK磷酸化增加，進(jìn)而表現(xiàn)出相應(yīng)保護(hù)心肌細(xì)胞和促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡的作用。這對(duì)癲癇引起的心肌損傷機(jī)制研究有一定的意義，并為臨床治療癲癇引起的心肌損傷提供新的視角。

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The expression of calcium sensing receptor(CaSR) and MAPK pathway changes in myocardial cells of epilepsy rats

GUO Jin1， LIU Yang1,4， WANG Chao2， BAI Ling-ling1， HAN Xiao-wei2， ZHANG Xin-yang1， SUN Yan-qiu1， WANG Lu-chuan2， JIANG Zhi-mei1，3△

(1. The Affiliated the Third Hospital, 2. The Affiliated the First Hospital Jiamusi University, Jiamusi 154002； 3. Harebin Medical College of Public Health, 4.Harebin NO.4 Hospital, Harebin 150026, China)

Objective: To investigate the changes of the myocardial cells in chronic epileptic rat model and to observe the expression of calcium sensing receptor(CaSR) and mitogen-activated proteinkinase(MAPK)pathway changes in epilepsy rats. Methods: The chronic epileptic rat model was induced by pentetrazole (PTZ). Adult male Wistar rats were divided into 5 groups randomly, and there were 12 rats in each group. The rats in model group were treated with a sub-convulsive dose of PTZ (35 mg/kg) by intraperitoneal injection for 28 d. After stopping a week, the same dose of PTZ test was conducted. The control group was treated with isovolumetric saline instead of PTZ by intraperitoneal injection. According to Racine behavior grading standards the rat emerged two levels above epileptic seizure 5 consecutive times, which was considered the chronic epilepsy model successful ignition. The intervention factors included spermine(calcium-sensing receptor agonist， 3 μmol/L) and Chalhex231(calcium-sensing receptor inhibitor， 2 μmol/L). The serum creatine kinase (CK) and creatine kinase isoenzyme(CK-MB)were detected. The cardiac functions, morphological changes of rat myocardial tissue, myocardial cell ultrastructure, myocardial cell calcium sensing receptor and extracellular regulated protein kinase (ERK), p-ERK, p-JNK expression were carried out. Results： Compared with normal control group, CK, CK-MB in PTZ group were increased obviously. The cardiac compliance and left ventricular function were decreased, E/A<1 by echocardiography. The myocardial ultrastructure showed serious injury. The expressions of CaSR and p-JNK were increased, but the expression of p-ERK was decreased. Spermine could promote the expressions of CaSR and p-JNK, and decrease the expression of p-ERK in epilepsy; however, the role of Chalhex231 was opposite. Conclusion: The level of CaSR expression increased in chronic epileptic rat model. CaSR activated the expressions of MAPK of the myocardial cells,and then influenced the cardiac myocyte apoptosis.

calcium-sensing receptor; mitogen-activated proteinkinase; epilepsy; myocardial cells

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81300122)；黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(QC2016130)；佳木斯大學(xué)校級(jí)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(Cxtd201302)

2015-04-14

2016-04-19

R363

A

1000-6834(2016)05-454-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.018

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