王寧 衛(wèi)超 Musa Male 王珅 彭鄂軍 葉章群 陳志強(qiáng)

·臨床研究·

沙培林膀胱灌注的臨床觀察及實(shí)驗(yàn)研究

王寧 衛(wèi)超 Musa Male 王珅 彭鄂軍 葉章群 陳志強(qiáng)

目的 初步探索沙培林膀胱灌注治療的安全性、有效性和作用機(jī)制。 方法 ①臨床研究：收集膀胱腫瘤術(shù)后行沙培林膀胱灌注治療的患者40例，檢測(cè)灌注前后尿液中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ的含量，術(shù)后6個(gè)月復(fù)查膀胱鏡。②動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：取雌性大鼠75只，分為空白對(duì)照組(15只)、生理鹽水灌注組(15只)、沙培林灌注組(15只)、BCG灌注組(15只)和大腸桿菌灌注組(15只)，每周灌注治療一次，6周后停止灌注。從每組中隨機(jī)選取10只大鼠，處死后取其膀胱三角區(qū)組織做病理切片，觀察并比較免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，同時(shí)行免疫組化分析，檢測(cè)IL-2、TNF-α、INF-γ在組織中的表達(dá)情況。剩余25只大鼠不做任何處理，飼養(yǎng)2個(gè)月后全部處死，取其膀胱三角區(qū)組織做病理切片，觀察停止灌注后膀胱組織是否出現(xiàn)慢性炎性改變。 結(jié)果 ①臨床研究：膀胱腫瘤術(shù)后膀胱灌注沙培林，尿中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ均顯著升高。6個(gè)月后復(fù)查膀胱鏡見(jiàn)炎性改變且均未見(jiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，不良反應(yīng)發(fā)生率低。②動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：膀胱灌注6周后大鼠膀胱免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況與細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ的表達(dá)相似：大腸桿菌組>沙培林組≈BCG組>生理鹽水組>空白對(duì)照組；停止膀胱灌注2個(gè)月后，大腸桿菌組表現(xiàn)為膀胱炎性改變，其余各組幾乎均表現(xiàn)為正常尿路上皮。 結(jié)論 沙培林與BCG等免疫調(diào)節(jié)劑作用機(jī)制相似，通過(guò)引起膀胱上皮炎性反應(yīng)，增強(qiáng)病變部位的免疫功能，從而識(shí)別并清除變異細(xì)胞，且在一段時(shí)間后能自行恢復(fù)為正常尿路上皮，不引起慢性炎性改變，沙培林是一種安全、有效的免疫調(diào)節(jié)劑。

沙培林； 膀胱灌注； 膀胱腫瘤； 細(xì)胞因子

沙培林(sapylin,OK-432)是一種由人源A組溶血性鏈球菌Su株(低毒變異株)經(jīng)處理后獲得的新的免疫調(diào)節(jié)劑。目前沙培林通過(guò)全身或局部途徑廣泛應(yīng)用于癌性胸腹水、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、淋巴管癌等實(shí)體瘤及其轉(zhuǎn)移灶中，并取得了良好療效[1-3]。有關(guān)沙培林在泌尿系腫瘤中的應(yīng)用，已有文獻(xiàn)報(bào)道，但具體療效及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的臨床觀察[4]。有研究表明沙培林可通過(guò)激活免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。 IL-2是T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子, 它能激活自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞, 并加強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。TNF-α、INF-γ由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌, 能激活巨噬細(xì)胞、刺激T細(xì)胞增殖, 且對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ的定量、定性分析，探討沙培林激活細(xì)胞免疫，增強(qiáng)局部免疫功能達(dá)到預(yù)防病變復(fù)發(fā)的療效及作用機(jī)制。

本研究收集2015年6月至2016年3月于我院行膀胱電切術(shù)后輔助沙培林膀胱灌注治療的40例膀胱占位患者，檢測(cè)灌注前后尿液細(xì)胞因子TNF-α、INF-γ、IL-2的含量，并統(tǒng)計(jì)術(shù)后6個(gè)月患者的復(fù)發(fā)率和不良反應(yīng)發(fā)生率。同時(shí)，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察灌注沙培林后免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ的表達(dá)是否增多及停藥后尿路上皮是否發(fā)生慢性炎性改變，探討沙培林的有效性和安全性。

對(duì)象與方法

一、一般資料

40例膀胱占位患者，男29例，女11例，年齡38～79歲，平均年齡58歲；單發(fā)病例34例，多發(fā)6例；初發(fā)病例32例，復(fù)發(fā)病例8例；腫瘤大小0.5～3.7 cm，平均2.1 cm。膀胱電切術(shù)后病檢結(jié)果：34例為低級(jí)別膀胱尿路上皮癌，未見(jiàn)肌層浸潤(rùn)；6例為高級(jí)別膀胱尿路上皮癌，未見(jiàn)肌層浸潤(rùn)。SD大鼠(購(gòu)于湖北省疾病預(yù)防控制中心，SPF級(jí)大鼠)75只，體重(260±20)g，分籠飼養(yǎng)(華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，屏障系統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)。

二、材料

沙培林[國(guó)藥集團(tuán)魯亞(山東)制藥有限公司]；BCG(必賽吉，中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司)；尿液(從患者采集)；TNF-α、INF-γ、IL-2 ELISA試劑盒(購(gòu)于聯(lián)科生物公司)；TNF-α、INF-γ、IL-2免疫組化(一抗、二抗購(gòu)于谷歌生物公司；DAB購(gòu)于DAKO公司)；DH5α(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院)；SD大鼠膀胱HE染色組織；電腦體式顯微鏡(購(gòu)于德國(guó)Leica)、成像系統(tǒng)。

三、臨床觀察、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

1.臨床觀察：①膀胱灌注：40例患者術(shù)后肉眼血尿消失即予沙培林膀胱灌注(所有患者青霉素皮試均為陰性)。排空膀胱，生理鹽水40 ml加沙培林5 KE經(jīng)導(dǎo)尿管灌入膀胱保留2 h以上，囑患者在床上每15 min改變一次體位，以便藥物浸及膀胱各壁。每周1次，連續(xù)6次，之后每個(gè)月1次，連續(xù)6次。②尿液收集：膀胱灌注沙培林前，用無(wú)菌干凈器皿收集患者晨尿的中段尿10 ml左右，立即送實(shí)驗(yàn)室，3 000 r/min，5 min，離心后取上清1 ml, 4 ℃冰箱保存。膀胱灌注后第二天，以同樣的方法收集患者尿液。所有尿液收集后當(dāng)天即應(yīng)用TNF-α、INF-γ、IL-2 ELISA試劑盒檢測(cè)尿液中TNF-α、INF-γ、IL-2含量。③隨訪：每月電話隨訪一次，詳細(xì)記錄每次灌藥后全身及局部反應(yīng)情況：有無(wú)發(fā)熱癥狀、有無(wú)尿路刺激癥狀、有無(wú)過(guò)敏反應(yīng)、有無(wú)肉眼血尿及其他不良反應(yīng)。術(shù)后6個(gè)月返院復(fù)查膀胱鏡，觀察是否發(fā)生膀胱炎性改變及腫瘤復(fù)發(fā)情況。

2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：取75只雌性大鼠，隨機(jī)分為5組，每組15只，第1組為空白組，不做任何處理；第2組灌注生理鹽水；第3組灌注大腸桿菌培養(yǎng)液；第4組灌注120 mg/50 ml BCG溶液；第5組灌注5 KE/40 ml沙培林溶液。每只大鼠灌注量均為0.3 ml，每周灌注1次，連續(xù)灌注6周。6周后停止灌注，從各組隨機(jī)選取10只大鼠，處死后取其膀胱三角區(qū)組織做病理切片并行TNF-α、INF-γ、IL-2免疫組化分析。2個(gè)月后處死剩余的25只大鼠，取其膀胱三角區(qū)組織做病理切片，觀察膀胱組織恢復(fù)情況。①大鼠膀胱內(nèi)灌注方法：按30 mg/kg體重腹腔注射1%的戊巴比妥鈉麻醉SD雌性大鼠，固定仰臥大鼠，常規(guī)消毒會(huì)口陰部。將無(wú)菌硬膜外導(dǎo)管用無(wú)菌液體石蠟潤(rùn)滑后，提起尿道外口的皮膚, 沿尿道后壁插入尿道3 cm 以上。通過(guò)抽吸導(dǎo)管排除大鼠殘余尿液，分別用 1 ml 注射器向大鼠膀胱注入0.3 ml灌注液,然后退出導(dǎo)管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。②大腸埃希菌溶液的制備：無(wú)菌條件下，從-70 ℃冰箱取出DH5α大腸埃希菌菌種，挑起單菌落接種在裝有10 ml LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖晃過(guò)夜后，以2%接種量接入100 ml LB培養(yǎng)液中，置于37 ℃恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200 r/min。4 h后，用分光光度儀測(cè)定大腸埃希菌的濃度，測(cè)得OD值為0.6～0.8后，將培養(yǎng)瓶置于冰浴中10 min使細(xì)菌停止生長(zhǎng)，后4 ℃冰箱保存，保持菌種濃度。③膀胱標(biāo)本的處理：將各組大鼠用25%烏拉坦溶液按1.0 g/kg劑量麻醉，固定仰臥大鼠，剪開(kāi)會(huì)陰部皮膚，提起大鼠膀胱底部，分離至尿道近端剪斷。取出膀胱，觀察膀胱的大體形態(tài)，迅速將膀胱體部和膀胱三角區(qū)固定在10%的甲醛溶液中。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定、脫水、透明、石蠟包埋。5 μm厚連續(xù)常規(guī)切片, 行蘇木精-伊紅染色或免疫組化抗體孵育、染色。④判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠膀胱組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫組化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(TNF-α、INF-γ、IL-2任意一個(gè)達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn))：無(wú)明顯免疫細(xì)胞或陽(yáng)性顆粒(陰性或面積<5%);明顯免疫細(xì)胞或陽(yáng)性顆粒1+(面積<25%);免疫細(xì)胞或明顯陽(yáng)性顆粒2+(面積介于25%與75%之間);免疫細(xì)胞或明顯陽(yáng)性顆粒3+(面積>75%)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料數(shù)據(jù)符合近似正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)，等級(jí)資料運(yùn)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis 檢驗(yàn))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床研究

與灌注前比較，沙培林灌注后40例膀胱腫瘤患者尿液中細(xì)胞因子TNF-α、INF-γ、IL-2含量顯著升高(表1)，隨訪過(guò)程中均未出現(xiàn)明顯的全身不良反應(yīng)，僅有3例訴灌注后出現(xiàn)輕度尿路刺激癥狀，停止灌注后癥狀消失。6個(gè)月后復(fù)查膀胱鏡檢，鏡檢報(bào)告：膀胱電切術(shù)后，未見(jiàn)明顯占位性病變，膀胱呈炎性改變。

表1 沙培林灌注前后尿液中TNF-α、INF-γ、IL-2含量比較(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)

與灌注前比較*P< 0.01

二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

連續(xù)灌注6周后，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況與細(xì)胞因子TNF-α、INF-γ、IL-2免疫組化分析情況相似，表現(xiàn)為大腸桿菌組>沙培林組≈BCG組>生理鹽水組>空白對(duì)照組(表2、圖1)。停止灌注2個(gè)月后，大腸桿菌灌注組仍表現(xiàn)為嚴(yán)重的炎性改變，而沙培林、BCG灌注組中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)明顯減少,趨向正常。

圖1 灌注6周后膀胱組織中細(xì)胞因子表達(dá)情況

組別例數(shù)陽(yáng)性率(%)陰性率(%)陽(yáng)性等級(jí)構(gòu)成比1+2+3+大腸桿菌101000028沙培林101000181BCG101000271生理鹽水102080110空白對(duì)照100100000

卡方=40.843，自由度=4，P<0.01;按α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)，認(rèn)為5組的陽(yáng)性率不全相同

討 論

膀胱腫瘤術(shù)后有一定的復(fù)發(fā)率，臨床上術(shù)后常規(guī)行膀胱灌注。本研究顯示，與灌注前比較，沙培林灌注后患者尿液中IL-2、TNF-α、INF-γ的含量均顯著升高，說(shuō)明沙培林灌注可刺激膀胱產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使免疫細(xì)胞聚集并分泌大量的細(xì)胞因子，增強(qiáng)膀胱局部免疫功能。與文獻(xiàn)報(bào)道相符。隨訪中不良反應(yīng)發(fā)生率低且輕。術(shù)后6個(gè)月膀胱鏡檢，此時(shí)患者灌注尚未結(jié)束，見(jiàn)膀胱內(nèi)呈炎性改變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，因細(xì)胞因子均由免疫細(xì)胞合成、分泌，故免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)與細(xì)胞因子的表達(dá)情況大致相同。沙培林灌注正常大鼠膀胱，在膀胱組織切片中發(fā)現(xiàn)大量免疫細(xì)胞聚集，同時(shí)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ在膀胱組織中的合成也顯著增多，說(shuō)明灌注沙培林后，膀胱局部免疫系統(tǒng)被激活，主要以細(xì)胞免疫為主，而由免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ能進(jìn)一步增強(qiáng)和促進(jìn)免疫細(xì)胞的功能，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤及抗炎作用。停止灌注2個(gè)月后，與大腸桿菌組產(chǎn)生慢性膀胱炎不同，沙培林組及卡介苗組大鼠膀胱組織基本恢復(fù)正常，說(shuō)明沙培林膀胱灌注具有安全性和有效性。

目前應(yīng)用于膀胱灌注的藥物主要分為化療藥物和生物免疫制劑，其中化療藥(如羥基喜樹(shù)堿、絲裂霉素等)存在較高的細(xì)胞毒性和刺激性，患者往往難以耐受，灌注后不良反應(yīng)發(fā)生率高，因灌注化療藥物可通過(guò)各種途徑促進(jìn)DNA的聚集及阻斷復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，在殺傷不典型增生細(xì)胞的同時(shí)也損傷了正常尿路細(xì)胞，具有一定的盲目性，濃度高時(shí)還有可能造成血管損傷引起化學(xué)性膀胱炎[4]。而生物免疫調(diào)節(jié)劑(如BCG、沙培林OK-432、IL-2)可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，也可以通過(guò)激活機(jī)體和/或局部免疫細(xì)胞識(shí)別和殺傷異型細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)損傷，具有一定的選擇性；同時(shí)分泌的大量細(xì)胞因子有增強(qiáng)免疫作用，從而治療和預(yù)防腫瘤[5-6]。從機(jī)制上看，生物免疫調(diào)節(jié)劑明顯優(yōu)于化療藥物。在療效方面，國(guó)外一份關(guān)于絲裂霉素和BCG灌注預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)的研究表明，兩者5年生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)上，BCG明顯優(yōu)于絲裂霉素[7]。另外一項(xiàng)2 749例患者的meta分析也表明，無(wú)論腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高低，BCG對(duì)非浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)發(fā)的預(yù)防作用均優(yōu)于絲裂霉素[8]。也有一些學(xué)者提出將化療藥物與生物免疫制劑聯(lián)合應(yīng)用于膀胱灌注，充分利用它們不同的作用機(jī)制，從而達(dá)到最大療效和最小的毒副作用，還能消除腫瘤細(xì)胞對(duì)單一藥物的耐藥性。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)關(guān)于沙培林聯(lián)合羥基喜樹(shù)堿與單獨(dú)灌注預(yù)防膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)療效對(duì)比研究表明，聯(lián)合應(yīng)用沙培林與羥基喜樹(shù)堿的療效優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，預(yù)防復(fù)發(fā)的療效更好[9]。

自1976年Morales等[10]報(bào)道了應(yīng)用BCG膀胱灌注治療淺表性膀胱腫瘤后，免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于膀胱灌注逐漸為人們所熟知并認(rèn)可。BCG作為一種有效的生物免疫調(diào)節(jié)劑在治療膀胱腫瘤方面取得了良好效果，被認(rèn)為是目前最為有效的膀胱腫瘤輔助治療劑之一。但以下因素限制了BCG的臨床應(yīng)用[11-12]：不良反應(yīng)，包括治療期間出現(xiàn)膀胱炎，甚至肺部感染、肝肉芽腫等致命的并發(fā)癥；仍有約20%的患者對(duì)其治療無(wú)效；對(duì)肌層浸潤(rùn)的腫瘤效果較差；BCG相對(duì)短缺，無(wú)法普及應(yīng)用。沙培林的作用機(jī)理大致與BCG相似，Nakahara等[13]比較了OK-432與BCG對(duì)胃癌患者外周血單核細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是激活NK細(xì)胞，還是誘導(dǎo)細(xì)胞因子(IL-2、TNF-α、INF等)的分泌方面，OK-432的作用均明顯強(qiáng)于BCG。目前已有沙培林應(yīng)用于膀胱腫瘤的治療并取得良好療效的報(bào)道。劉波等[14]對(duì)50例高危非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌行經(jīng)尿道等離子電切術(shù)聯(lián)合沙培林膀胱灌注，結(jié)果亦表明沙培林膀胱灌注有效、安全，但仍缺乏大樣本、多中心臨床研究及合理的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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(本文編輯：徐漢玲)

Study of intravesical instillation with sapylin on the clinical observation and animal experiment

WANGNing,WEIChao,MusaMale,WANGShen,PENGE-jun,YEZhang-qun,CHENZhi-qiang.

DepartmentofUrology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

PENGE-jun，E-mail：penggejun@126.com

Objective To investigate the efficacy, safety and the mechanism of intravesical instillation of OK-432 (sapylin) by the clinical observation and animal's experiment. Methods ①Clinical research: 40 cases diagnosed with bladder tumor which used OK-432 (sapylin) for intravesical instillation in the postoperative period were collected, and determing the content of cytokine TNF-α, INF-γ and IL-2 in the urine collected before and after infusion respectively, reviewing the cystoscopy 3 months after operation, and counting the adverse effects. ②Animal experiment: divided 75 female rats into five groups: blank control group (15), saline perfusion group (15), sapylin perfusion group (15), BCG vaccine perfusion group (15), E.coli perfusion group (15), perfusion treatment once a week, continuous 6 weeks, then selected 10 rats from each group randomly, killed the rats and took the trigone tissue for pathological salices and immunohistochemical analysis of cytokine TNF-α, INF-γ and IL-2. The rest 25 rats just raised after 2 months without any treatment, after 2 months killed the rest rats and took the trigone tissue for pathological salices. Results ①Clinical research: the content of urine cytokine TNF-α, INF-γ and IL-2, after perfusion of OK-432 (sapylin)rose significantly, after 6 months reviewed the cystoscopy and reported inflammatory changes, no tumor recurrence, and low incidence of adverse reactions. ②Animal experiment: after 6 weeks intravesical instillation with different solutions, infiltration of immune cell in the rat bladder tissue and expression of cytokines TNF-α, INF-γ and IL-2 were similar: E. coli group > sapylin group ≈BCG group > saline group > blank control group; stopped perfusion 2 months was shown as: E. coli group characterized by bladder inflammatory change, almost all the rest of the group was turn to normal transitional epithelium. Conclusions Sapylin's action mechanism is similar with BCG, mainly through activating the bladder epithelial inflammatory reaction enhance the immune function of the lesion site, and than recognize and eliminate the mutant cells, and can recover to normal transitional epithelium after a period of time, therefore sapylin is a kind of safe and effective immune regulator.

Sapylin; Intravesical instillation; Bladder tumor; Cytokines

430030 武漢，華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科

彭鄂軍，E-mail：pengejun@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.06.007

2016-09-01)