鄧德紅,胡　菊

(1.湖北省孝感麻風(fēng)防治中心,湖北漢川 431600；2.湖北工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程系，湖北十堰 442000)

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·論著·

狼毒藥材HPLC指紋圖譜研究

鄧德紅1,胡菊2△

(1.湖北省孝感麻風(fēng)防治中心,湖北漢川 431600；2.湖北工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程系，湖北十堰 442000)

摘要:目的采用高效液相色譜法(HPLC)建立狼毒藥材的指紋圖譜。方法2013年10月至2014年10月，使用Hypersil ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，柱溫20 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣20 μL。結(jié)果對(duì)不同來源15批狼毒藥材進(jìn)行了分析，標(biāo)定了15個(gè)共有峰，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)≤3.7%，相對(duì)峰面積 RSD≤3.6%；各色譜峰分離度較好，相似度較高，15批不同來源狼毒藥材中，除了廣西南寧藥材料相似度為0.858，其他產(chǎn)地藥材料相似度均在0.95以上。達(dá)到了中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于狼毒指紋圖譜的測(cè)定及質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:狼毒；高效液相；指紋圖譜；質(zhì)量控制

狼毒為瑞香科植物瑞香狼毒或大戟科植物狼毒大戟、月腺大戟的根，有毒。中醫(yī)學(xué)上用其根祛痰、止痛、消積、殺蟲[1]。狼毒主要含有二萜、黃酮、木質(zhì)素、香豆精類成分；其中二萜類主要包括格尼迪木任、河朔蕘花素、赭雷毒素等；黃酮類主要包括狼毒素A、狼毒素B、狼毒素C、異狼毒素、7-甲氧基狼毒素、新狼毒素等[2-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其提取物具有良好的抗腫瘤、抗病毒、殺菌、抗癲癇和免疫調(diào)節(jié)作用[4-6]。因此，近年來，加快了狼毒的化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本文對(duì)不同來源15批狼毒藥材進(jìn)行了分析，從而建立了狼毒藥材的指紋圖譜，為狼毒的體內(nèi)外研究和臨床應(yīng)用等提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源2013年10月至2014年10月，狼毒素A購(gòu)于中國(guó)藥物檢定研究院,異狼毒素B為實(shí)驗(yàn)室自制(面積歸一化法，其純度為98.2%)。乙醇(AR，北京化學(xué)試劑廠)，乙腈(色譜純，歐普森)。15批不同來源狼毒藥材經(jīng)鑒定為瑞香科植物瑞香狼毒的干燥根。

1.2儀器與試劑2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司)，超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多有限公司)；中藥粉碎機(jī)(瑞安市百信藥機(jī)器械廠)，鼓風(fēng)干燥箱(廣州泰思科學(xué)儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取狼毒素A和異狼毒素B適量，置10 mL的容量瓶中，加乙腈-水定容至10 mL。制成質(zhì)量濃度分別為30.15、12.96 mg/L混合對(duì)照品溶液，置4 ℃冰箱冷藏備用[7-9]。

1.3.2供試品溶液的制備將狼毒藥材打成粉，過40目篩。稱取狼毒藥材粉末2.5 g，加甲醇-水25 mL，稱重，超聲處理35 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足重量。過0.45 μm 微孔濾膜，即得狼毒藥材供試品[10]。

1.3.3測(cè)定方法按上述對(duì)照品與供試品制備方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各20 μL[7]。采用 HPLC 法對(duì)15 批狼毒藥材進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，以狼毒素A和異狼毒素B的峰面積和保留時(shí)間為參考，計(jì)算共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。

1.4方法學(xué)考察

1.4.1精密度試驗(yàn)稱取狼毒藥材適量，按供試品溶液的方法制備，照上述方法測(cè)定，且重復(fù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間。

1.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析。

1.4.3重復(fù)性試驗(yàn)稱取狼毒藥材適量，按上述供試品溶液制備方法制備6 份樣品，按照測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5色譜條件Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-水(B) 洗脫梯度(0～5 min，20%～30% A；5～10 min，30%～45% A；10～30 min，45%～55% A；30～70 min，55%～60% A；70～80 min，60%～65% A；80～100 min，65%～70% A)，流速為1.0(mL/min)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量20 μL[8]。

2結(jié)果

2.1指紋圖譜分析對(duì)15批不同來源的狼毒藥材HPLC指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，見圖1(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。標(biāo)定了分離度較高的15個(gè)峰作為共有峰。其中狼毒素A和異狼毒素B出峰位適中，且分離效果好，無前沿和拖尾，因此選定其為參照峰，并計(jì)算各峰的相對(duì)峰面積,見表1。

表1　　狼毒藥材指紋圖譜15個(gè)共有峰相對(duì)峰面積值

2.2相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A版)》軟件[11]，導(dǎo)入15批樣品色譜圖，結(jié)果表明，15批不同來源狼毒藥材中，除了廣西南寧藥材料相似度為0.858，其他產(chǎn)地藥材料相似度均在0.95以上。

表2　　不同來源狼毒藥材相似度計(jì)算結(jié)果

3討論

瑞香狼毒屬于瑞香科植物的干燥根，也稱為斷腸草，其性平、味苦、辛，有毒，可入肺脾肝經(jīng)，具有坡積殺蟲、逐水祛痰的作用。狼毒通常廣泛分布于我國(guó)黑龍江、內(nèi)蒙古、西北等地，并在西北地區(qū)銷售、應(yīng)用?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)狼毒的化學(xué)成分進(jìn)行了深入的探究，從中發(fā)現(xiàn)了許多二萜類、香豆素類、黃酮類等成分均存在較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤等作用，尤其是抗人類免疫缺陷病毒的作用。部頒標(biāo)準(zhǔn)對(duì)狼毒藥材的質(zhì)量控制局限于理化鑒別，無法完整、系統(tǒng)的體現(xiàn)狼毒的內(nèi)在質(zhì)量。近些年來，指紋圖譜已經(jīng)成為國(guó)際統(tǒng)一公認(rèn)的控制中藥、天然藥物質(zhì)量最有效的手段。為了更有效地控制狼毒中藥材，或是含有狼毒的中藥復(fù)方劑的質(zhì)量，本次試驗(yàn)采用HPLC建立狼毒藥材的指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同來源15批狼毒藥材，標(biāo)定了15個(gè)共有峰，15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間 RSD≤3.7%，相對(duì)峰面積 RSD≤3.6%；各色譜峰分離度較好，相似度較高，15批不同來源狼毒藥材中，除了廣西南寧藥材料相似度為0.858，其他產(chǎn)地藥材料相似度均在0.95以上。達(dá)到了中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。

本研究考察了不同的提取溶媒和提取方法，分別為索氏，超聲、回流及冷浸，以及提取時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明以乙腈超聲提取35min，能全面反應(yīng)狼毒全譜峰，且峰面積較大，方法簡(jiǎn)單。試驗(yàn)比較了乙腈-水、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸3種體系；以及通過二極管陣列進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明，以乙腈-水梯度洗脫、210nm為波長(zhǎng)時(shí)，各色譜峰均有較大的吸收，且峰

數(shù)較多，各峰分離情況良好。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，廣西產(chǎn)地的狼毒藥材與其他產(chǎn)地的藥材存在差異。因此，在臨床用藥等方面應(yīng)當(dāng)關(guān)注藥材的來源與產(chǎn)地。

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Study on HPLC fingerprint of radix euphorbiae fischerianae

DengDehong1,HuJu2△

(1.HubeiXiaoganLeprosyPreventionandControlCenter,Hanchuan,Hubei431600,China;2.DepartmentofEnvironmentalEngineering，HubeiIndustrialPolytechnic，Shiyan,Hubei442000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish fingerprint of Radix Euphorbiae Fischerianae by high performance liquid chromatography(HPLC).MethodsThe samples were separated on Hypersil ODS(250 mm × 4.6 mm,5 μm) column with gradient mobile phase of acetic-water,the column temperature was 20 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min and UV detection wavelength was 210 nm.the sample injection was 20 μL.Results15 samples of different origin Radix Euphorbiae Fischerianae were detected and each chromatographic peak was separated well with conforming to the requirements of fingerprint by calibrating the 15 peaks.15 common peak retention time RSD，relative peak area RSD were 3.7%,3.6% or less respectively；The chromatographic peak separation degree was better，similarity was higher，15 batches of different sources of stellera medicinal materials,in addition to the Guangxi nanning medicine material similarity was 0.858,other origin medicine material similarity above 0.95.Have reached the technical requirements of traditional Chinese medicine (TCM) fingerprint.ConclusionThe method is accurate,reliable,and the HPLC fingerprint shows good repeatability,which can be used for one of the quality control of Radix Euphorbiae Fischerianae.

Key words:Radix Euphorbiae Fischerianae;high performance liquid chromatography;fingerprints;quality control

(收稿日期：2015-10-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.006

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)04-0447-03

作者簡(jiǎn)介：鄧德紅，男，副主任技師，主要從事檢驗(yàn)方法學(xué)研究。△通訊作者，E-mail:734339604@qq.com。