劉冠蘭?付濟(jì)寧?張龍?劉英

【摘要】 目的 觀察CD8+ T細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及其表面受體雌激素受體α（ERα）的影響。方法 應(yīng)用健康成人外周血分離得到的CD8+ T細(xì)胞與胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901混合培養(yǎng)。混合培養(yǎng)96 h后用經(jīng)流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞周期；免疫熒光法檢測分析共培養(yǎng)48 h后SGC-7901細(xì)胞的凋亡情況及雌激素受體表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢查， 混合培養(yǎng)96 h后CD8+ T細(xì)胞與SGC-7901細(xì)胞粘附， 大部分SGC-7901細(xì)胞滯留在G1期；混合培養(yǎng)組與對(duì)照組相比， SGC-7901細(xì)胞膜上表達(dá)ERα數(shù)明顯降低。結(jié)論 CD8+ T細(xì)胞抑制胃癌細(xì)胞增殖的同時(shí)降低ERα的表達(dá)， 為深入研究胃癌的生物治療及靶向治療奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 CD8+ T細(xì)胞；胃癌；SGC-7901細(xì)胞；雌激素受體

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.08.019

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一， 全球超過 40%的胃癌病例發(fā)生在中國， 死亡率在惡性腫瘤中占第二位[1]。目前對(duì)胃癌的治療主要是采用以手術(shù)為主的綜合治療， 但總體效果不令人滿意。由于腫瘤患者機(jī)體免疫功能低下或缺陷與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的各階段關(guān)系密切， 而病情發(fā)展又進(jìn)一步加重免疫低下狀態(tài)， 惡性腫瘤的免疫治療已成為目前的研究熱點(diǎn)。

CD8+ T 細(xì)胞又稱作 T 抑制細(xì)胞或細(xì)胞毒 T 細(xì)胞， 可以特異性識(shí)別細(xì)胞表面的MHCI 類抗原從而特異性殺死腫瘤細(xì)胞， 在抗腫瘤免疫中起到了重要作用。但其作用的相關(guān)機(jī)制還不清楚。在本研究中， 應(yīng)用健康成人外周血分離得到的CD8+ T細(xì)胞與胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901共培養(yǎng)， 通過免疫熒光法檢測分析共培養(yǎng)48 h后SGC-7901細(xì)胞的凋亡情況及雌激素受體表達(dá)水平， 以期為臨床篩選個(gè)體化治療方案提供理論依據(jù)， 前瞻性指導(dǎo)腫瘤患者的免疫治療， 具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 將10 ml全血（健康志愿者）轉(zhuǎn)入50 ml離心管中， 加入10 ml PBS溶液稀釋， 輕輕混勻；取兩支15 ml離心管， 先加入5 ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的Ficoll上層， 每只離心管各10 ml稀釋血液；2000 r/min， 30 min；用1 ml槍頭插到白色云五層， 吸取單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）置另一干凈的15 ml離心管中。加入PBS至10～15 ml， 1500 r/min， 10 min離心后去掉上清， 再加入培養(yǎng)基（RPMI 1640+10% FBS）進(jìn)行相同操作的清洗2次。

1. 2 外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng) 分離得到的PBMC用RPMI 1640+10% FBS+異戊烯焦磷酸（IPP） 1 μg/ml+白細(xì)胞介素-2 （IL-2） 20萬U/ml培養(yǎng)， 2～3 d換培養(yǎng)基一次， 第五代（P5）用于實(shí)驗(yàn)。

1. 3 流式細(xì)胞儀檢查T細(xì)胞表型 取100 μl細(xì)胞與PBS+2%胎牛血清（FBS）混懸液， 分別加入10 μl CD3、CD4、CD8抗體（貝克曼公司）， 震蕩器充分混勻后， 室溫避光放置10 min；裂解紅細(xì)胞：混合液放置10 min后， 加入紅細(xì)胞裂解液500 μl （貝克曼公司）， 均勻混合后， 室溫避光放置10 min；離心（2000 r/min， 5 min）后倒掉上清， 上機(jī)檢測：加入500 μl的緩沖液， 混勻后上流式細(xì)胞儀器檢測（儀器為貝克曼公司FC500型流式細(xì)胞儀）。

1. 4 CD8+ T分離 取5個(gè)小平皿（60 mm）， 加入10%多聚賴氨酸0.5 ml， 37℃5%CO2培養(yǎng)箱中過夜。4℃加入CD8抗體2 μl 4 h。加入上述單個(gè)核細(xì)胞混懸液過夜。次晨， 去上清。0.25%胰酶消化貼壁的細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后， 取10000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測， 方法同上。

1. 5 CD8+ T與SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞計(jì)數(shù)后， 平均鋪到5個(gè)小平皿（60 mm）中， 過夜培養(yǎng)讓細(xì)胞貼壁， 融合率到70%～80%。取兩小平皿用胰酶消化， 計(jì)數(shù)后分別按CD8+ T與SGC-7901細(xì)胞1∶10加入成為貼壁腫瘤細(xì)胞+T細(xì)胞培養(yǎng)組；單獨(dú)SGC-7901細(xì)胞和單獨(dú)T細(xì)胞為對(duì)照組。SGC-7901細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況；吸去舊培養(yǎng)基按相同比例換含新CD8+ T細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)96 h后， 吸去培養(yǎng)基， 進(jìn)行細(xì)胞周期檢測和免疫熒光檢查。

1. 6 細(xì)胞周期檢測 CD8+ T與SGC-7901細(xì)胞混合培養(yǎng)在96 h后， 0.25%胰酶消化。消化后的細(xì)胞經(jīng)PBS 清洗2次， 加入FITC標(biāo)記annexin Ⅴ和PI溶液， 輕輕混均。室溫避光放置15 min， 用流式細(xì)胞儀檢查DNA含量。所得結(jié)果用細(xì)胞周期分析軟件（Cell FIT， Becton Dickinson）分析。

1. 7 免疫熒光檢查 將CD8+ T用DAPI染核后與SGC-7901細(xì)胞共接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中， 96 h后取出蓋玻片， PBS洗2次。4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞過夜。3%小牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min， 加入ERα抗體（PE標(biāo)記） 4℃過夜。PBST漂洗3次， 沖洗5 min/次。加入二抗室溫避光孵育1 h， PBST漂洗3次， 沖洗5 min/次后， 再用蒸餾水漂洗1次。滴加封片劑一滴， 封片， 熒光顯微鏡檢查。

2 結(jié)果

2. 1 CD8+ T細(xì)胞檢測 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢查， 培養(yǎng)得到的CD8+ T陽性率為91.3%。

2. 2 混合培養(yǎng)96 h后細(xì)胞周期檢查 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢查， 混合培養(yǎng)96 h后大部分細(xì)胞滯留在G1期。

2. 3 混合培養(yǎng)96 h后SGC-7901細(xì)胞ERα抗體表達(dá)情況 CD8+ T細(xì)胞用DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色， ERα在熒光顯微鏡下呈綠色， 在SGC-7901細(xì)胞膜上表達(dá)。混合培養(yǎng)96 h后， 可見CD8+ T細(xì)胞與SGC-7901細(xì)胞粘附。混合培養(yǎng)組與對(duì)照組相比， SGC-7901細(xì)胞膜上表達(dá)ERα數(shù)明顯降低。見圖1。

圖1 混合培養(yǎng)96 h后SGC-7901細(xì)胞ERα抗體表達(dá)情況

注：A圖， CD8+ T組96 h貼壁增殖情況；B圖， SGC-7901細(xì)胞96 h ERα抗體表達(dá)；C圖， 混合培養(yǎng)96 h后SGC-7901細(xì)胞ERα抗體表達(dá)情況

3 討論

現(xiàn)代腫瘤免疫生物學(xué)的飛躍發(fā)展， 使惡性腫瘤的免疫治療成為目前的研究熱點(diǎn)， 它將成為繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種腫瘤治療模式。本研究通過CD8+ T細(xì)胞與SGC-7901細(xì)胞混合培養(yǎng)， 證實(shí)CD8+ T細(xì)胞對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用；并降低SGC-7901細(xì)胞的特異性受體ERα的表達(dá)。因此， 本研究結(jié)果為腫瘤的生物靶向治療提供了理論依據(jù)。

雌激素調(diào)節(jié)生長、分化和功能多樣化的目標(biāo)組織內(nèi)外的生殖系統(tǒng)[2]。雌激素的生物功能大部分是對(duì)通過靶細(xì)胞的雌激素受體ERα和ERβ， 調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。盡管胃不是稱為性激素的直接目標(biāo)器官， 流行病學(xué)和動(dòng)物研究表明胃癌可能對(duì)雌激素敏感。胃癌的男女發(fā)病比率約為2∶1。因此， 有研究認(rèn)為雌激素可能對(duì)胃癌有保護(hù)作用。ERα和ERβ均在胃癌表達(dá)[3， 4]。ERα在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較多， 大多認(rèn)為胃癌中ERα的表達(dá)較ERβ多， 表達(dá)范圍廣泛， 且與胃癌的分化及轉(zhuǎn)移相關(guān)[5， 6]。部分ER陽性的胃癌患者根治切除后對(duì)內(nèi)分泌治療反應(yīng)良好均說明胃癌的ER與乳腺癌中的ER 一樣具備代謝活性。因此， 對(duì)雌激素及其受體的相關(guān)研究可能影響胃癌的進(jìn)展和治療。迄今為止， 有關(guān)胃癌ER與預(yù)后的關(guān)系尚未清楚。

CD8+ T 細(xì)胞又稱作T抑制細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞， 通過穿孔素/顆粒酶途徑和Fas/FasL途徑能夠高效、特異性地殺傷靶細(xì)胞， 而不損害正常組織。細(xì)胞毒性CD8 T細(xì)胞高表達(dá)的胃癌通常預(yù)后好于低表達(dá)的胃癌患者， 表明過繼免疫在腫瘤免疫監(jiān)視系統(tǒng)的關(guān)鍵作用[7]。本研究結(jié)果還顯示 CD8+ T細(xì)胞抑制胃癌細(xì)胞增殖。CD8+ T具有特異性直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用， 分化越差的腫瘤往往惡性程度越高， 越容易產(chǎn)生免疫耐受， 導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞表達(dá)降低。本研究觀察CD8+ T細(xì)胞對(duì)胃腺癌細(xì)胞ERα的表達(dá)， 結(jié)果顯示， CD8+ T可以降低胃腺癌細(xì)胞ERα的表達(dá)。

綜上所述， CD8+ T細(xì)胞抑制胃癌細(xì)胞增殖的同時(shí)降低ERα的表達(dá)， 為深入研究胃癌細(xì)胞的生物治療及靶向治療奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期：2015-11-09]