郭麗梅,杜　娟,廖　鷹,李　揚,王光熙,劉　巖

(北京大學醫(yī)學部病理學系，北京 100091)

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Hedgehog信號通路轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達

郭麗梅,杜娟,廖鷹,李揚,王光熙,劉巖

(北京大學醫(yī)學部病理學系，北京 100091)

[摘要]目的探討Hedgehog信號通路轉(zhuǎn)錄因子腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1(Gli1)蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及作用。方法免疫組化法檢測Gli1蛋白在147例手術(shù)切除結(jié)直腸癌組織中的表達；Western blotting法檢測Gli1蛋白在19例結(jié)直腸癌新鮮組織和2個結(jié)腸癌細胞系中的表達；同時用共聚焦激光顯微鏡觀察Gli1轉(zhuǎn)錄水平的抑制劑GANT61對8例直腸癌組織中直接分離的腫瘤細胞的影響。結(jié)果147例結(jié)直腸癌根治切除標本中，Gli1蛋白在78.2%(115/147)的結(jié)直腸癌組織中表達升高，陽性信號表達在腫瘤細胞的細胞核和細胞漿。Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達與結(jié)直腸癌浸潤前緣腫瘤細胞團數(shù)目、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)。在5例Gli1蛋白陽性的結(jié)直腸癌組織中，間質(zhì)細胞，包括腫瘤相關(guān)纖維母細胞和內(nèi)皮細胞內(nèi)高表達Gli1蛋白。Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織和2個結(jié)腸癌細胞系中的表達也升高。對結(jié)直腸癌組織中直接分離出的腫瘤細胞，培養(yǎng)以后加入GANT61，可以明顯抑制腫瘤細胞內(nèi)Gli1蛋白的表達，而對腫瘤相關(guān)纖維母細胞沒有顯著影響。結(jié)論Gli1蛋白的活化可能增強腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而促進結(jié)直腸癌的進展；GANT61可能為進展期結(jié)直腸癌的治療提供新的契機。

[關(guān)鍵詞]Hedgehog信號通路；腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1；結(jié)直腸癌；免疫組織化學

結(jié)直腸癌是胃腸道常見惡性腫瘤，近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬于中晚期。城市患者發(fā)病高峰在50歲左右，中位發(fā)病年齡比歐美提前約10 a[1-2]。有關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)病機制的研究[3-6]表明，多種信號通路與基因的異常變化參與了腫瘤的發(fā)生和進展。其中，Hedgehog信號通路近來被廣泛報道，該通路功能的異?；罨梢源龠M結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展，已受到越來越多的關(guān)注[5-9]。

Hedgehog信號通路因調(diào)節(jié)果蠅成體剛毛的形成而得名，眾多研究發(fā)現(xiàn)該通路除了在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中起重要的形態(tài)形成因子作用以外，與人類腫瘤的發(fā)生和演進也緊密相關(guān)。Hedgehog信號通路的異常激活可以導致多種腫瘤發(fā)生和進展，如基底細胞癌、髓母細胞瘤、肺小細胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、胃腸道惡性腫瘤、淋巴瘤等[10-20]。Hedgehog信號通路主要由3部分組成：Hedgehog信號肽(Shh、Ihh、Dhh)、跨膜受體(Ptch)、細胞內(nèi)傳導分子(Smo)、下游轉(zhuǎn)錄因子(Gli)。經(jīng)典途徑中，Hedgehog信號通路的激活是通過配體Hedgehog與跨膜受體Ptch結(jié)合，進而解除Ptch對另一跨膜蛋白Smo的抑制作用，Smo然后通過激活轉(zhuǎn)錄因子Gli1和(或)Gli2，進而促進一系列下游靶基因轉(zhuǎn)錄，其中包括促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤血管生成等眾多基因的轉(zhuǎn)錄[10-11,21-23]。此外，有研究[24-26]發(fā)現(xiàn)Gli1可以不經(jīng)過Hedgehog配體引發(fā)的級聯(lián)反應、而由PI3K/AKT、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、K-ras等直接活化。以上發(fā)現(xiàn)提示，無論經(jīng)典途徑或非經(jīng)典途徑，Gli1的活化對腫瘤發(fā)生和發(fā)展都非常重要。本研究旨在通過觀察Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織和細胞中的表達狀況，確立其在腫瘤演進過程中的作用，并初步探討針對Gli1的小分子化合物GANT61對腫瘤細胞的影響。

1材料與方法

1.1材料收集2009年至2013年在北京大學第三醫(yī)院進行的術(shù)前未經(jīng)過新輔助治療的結(jié)直腸癌患者147例，其中腫瘤限于黏膜下層內(nèi)者29例，浸潤至肌層或更深部腸壁者118例。從19例至少為肌層浸潤的病例獲得結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜組織，其中有8例腫瘤組織同時用于直接分離腫瘤細胞。

1.2試劑Gli1抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗、DAB試劑盒購自丹麥Dako公司；GANT61購自德國Merck公司；結(jié)腸癌細胞系(HCT116、DLD-1)購自美國ATCC細胞庫。

2結(jié)果

2.1Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中原位表達的觀察結(jié)果147例結(jié)直腸癌組織標本中，Gli1蛋白在78.2%(115/147)的結(jié)直腸癌組織中表達升高，陽性信號表達在腫瘤細胞的細胞核和細胞漿。在5例Gli1蛋白陽性的結(jié)直腸癌組織中，間質(zhì)細胞，包括腫瘤相關(guān)纖維母細胞和血管內(nèi)皮細胞的細胞核和細胞漿也表達有Gli1蛋白(圖1)。對結(jié)直腸癌根治標本冰凍切片中Gli1蛋白進行免疫熒光染色后共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的細胞漿和細胞核內(nèi)均有表達(圖2)。Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達結(jié)直腸癌浸潤前緣腫瘤細胞團數(shù)目、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，即Gli1蛋白的表達水平越高，腫瘤浸潤層次越深、浸潤前緣腫瘤細胞團數(shù)目越多、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率越高、TNM分期越高(表1)。

圖1　免疫組化顯示不同結(jié)直腸組織中Gli1蛋白的表達

A:正常直腸(×200)；B:進展期結(jié)腸腺癌(×100)；C:進展期直腸腺癌(×200)；D:進展期直腸腺癌中腫瘤間質(zhì)內(nèi)腫瘤相關(guān)纖維母細胞和脈管內(nèi)皮細胞(×200)

圖2　免疫熒光染色后共聚焦

2.2Western blotting法半定量分析Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織和結(jié)腸癌細胞系中的表達Western blotting結(jié)果顯示，在42.1%(8/19)的進展期結(jié)直腸癌組織中，Gli1蛋白的表達明顯升高(圖3)。在2個結(jié)腸癌細胞系中，Gli1蛋白在細胞核內(nèi)表達強于細胞漿(圖4)。

2.3GANT61對結(jié)直腸癌分離腫瘤細胞生長的影響加入針對Gli1轉(zhuǎn)錄水平的小分子化合物抑制劑GANT61，原位觀察GANT61對8例結(jié)直腸癌組織分離、培養(yǎng)的腫瘤細胞及腫瘤相關(guān)纖維母細胞的影響。發(fā)現(xiàn)加入DMSO的對照組中，腫瘤細胞的細胞漿與細胞核內(nèi)Gli1蛋白均有表達；加入GANT61之后，Gli1蛋白在細胞核內(nèi)的表達明顯減弱(圖5)。而對于纖維母細胞，加入DMSO或GANT61后,Gli1蛋白的陽性信號沒有明顯變化，在細胞漿和細胞核中仍均有表達(圖6)。

3討論

Hedgehog基因作為一種重要的胚胎形態(tài)發(fā)育調(diào)控因子，最早被確認參與體內(nèi)多種器官和組織的發(fā)育成熟。出生后，Hedgehog蛋白僅少量表達于呼吸道、胃腸道等上皮內(nèi)的基底干細胞。Hedgehog通路成員基因的異常表達則會啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，引起細胞異常分裂增殖，從而導致腫瘤形成[6,10]。大量研究[5-6，21-26]證實Hedgehog信號通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和演進，可能的致癌途徑有3個：1)通過配體Shh蛋白表達：內(nèi)源性Shh過表達，并與受體Ptch結(jié)合，從而解除后者對下游因子Smo的抑制作用，促使全長的Gli1或Gli2進入核內(nèi)啟動靶基因；2)Ptch和(或)Smo發(fā)生突變：導致下游信號傳導調(diào)節(jié)失控，靶基因不斷激活；3)不經(jīng)由Hedgehog/Ptch/Smo的級聯(lián)傳導，而是由PI3K/AKT、TGF-β1、K-ras等直接激活Gli1或Gli2,促進下游靶基因活化。除調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展外，Hedgehog信號通路還參與炎癥修復、血管新生等過程[27-29]。

本研究納入的結(jié)直腸癌患者個體化根治組織標本中，Gli1蛋白在多數(shù)腫瘤實質(zhì)細胞及少數(shù)間質(zhì)細胞內(nèi)表達均增強。腫瘤細胞Gli1蛋白表達的陽性比例和陽性信號越高，腫瘤的浸潤和侵襲行為越強，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率越高，TNM分期越高。這些結(jié)果提示Gli1蛋白高表達的患者，其腫瘤的生物學行為可能更差，常規(guī)輔助治療效果可能不理想，預后差。

有關(guān)Hedgehog信號通路抑制劑的研究很多。其中，環(huán)巴胺，一種從百合科藜蘆屬植物中提取的異甾體類生物堿，通過與Smo結(jié)合而阻斷Hedgehog信號通路傳導的作用機制得到揭示。由環(huán)巴胺衍生的另一抑制劑Vismogib(GDC0449)目前正在臨床應用于轉(zhuǎn)移性基底細胞癌患者的治療。而針對Gli轉(zhuǎn)錄水平的抑制劑GANT61可能對抑制Hedgehog信號通路的功能更為重要[22-23,29-31]。本研究中，我們向直接分離、培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細胞與腫瘤相關(guān)纖維母細胞內(nèi)加入GANT61,發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細胞內(nèi)Gli1蛋白的細胞核內(nèi)表達有明顯抑制，部分腫瘤細胞核Gli1蛋白表達減弱，而對纖維母細胞沒有明顯影響。我們推測GANT61可能通過抑制Gli1入核或抑制Gli1與靶基因的結(jié)合，無法轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因，從而抑制細胞生長，促進細胞死亡。這提示GANT61有可能作為一個新的治療靶點，但其對腫瘤生長依賴的微環(huán)境的改善與抑制效果有限。

表1Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

項目n染色比例陽性陰性P染色程度評分P年齡/歲 ≤50282172.165±0.367 >501199425>0.052.133±0.500>0.05性別 男7657192.705±0.778 女715813>0.052.367±0.800>0.05腫瘤位置 右半結(jié)腸4732151.900±0.037 左半結(jié)腸19154>0.052.533±0.300>0.05 乙狀結(jié)腸262151.820±0.073 直腸554782.100±0.920組織學類型 管狀腺癌8668182.367±0.466 黏液腺癌39318>0.051.945±0.183>0.05 印戒細胞癌221662.515±0.300病理分化程度 高分化191362.867±0.766 中分化655114>0.052.367±0.621>0.05 低分化6351123.005±0.805浸潤前緣癌細胞數(shù) ≤52710170.420±0.074 >5~1054468<0.051.670±0.260<0.05 >10665972.896±0.167浸潤深度 黏膜下297222.800±0.365 肌層35278<0.052.225±0.036>0.05 漿膜下層494722.133±0.460 漿膜343223.024±0.537脈管瘤栓 有5242102.610±0.133 無957322>0.053.100±0.720>0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N05833251.300±0.200 N1~289827<0.053.000±0.533<0.05臨床分期 Ⅰ~Ⅱ期6736311.327±0.020 Ⅲ~Ⅳ期80791<0.053.055±0.133<0.05

圖3　Western Blotting結(jié)果示19例進展期直腸癌和正常直腸黏膜組織中Gli1蛋白表達水平

圖4　Western blotting結(jié)果示2個

圖5　共聚焦激光顯微鏡示結(jié)直腸癌分離

圖6　共聚焦激光顯微鏡示結(jié)直腸癌分離腫瘤相關(guān)

Gli1蛋白在多數(shù)進展期直腸癌組織中表達水平升高，提示其功能的持續(xù)活化。在結(jié)直腸癌發(fā)生和演進過程中，Hedgehog信號通路可能通過2種不同的激活方式起作用，即依賴于Shh配體以及不依賴于Shh激活的可能性。進一步的研究需要結(jié)合Gli1表達與其他促進結(jié)直腸癌發(fā)生和演進的分子途徑，觀察如Wnt/APC通路、PTEN等，關(guān)注與Hedgehog信號通路的相互作用。因此,Hedgehog已不是一條單一的信號通路，而更像是一個分子網(wǎng)絡，更多Gli1非配體依賴的活化途徑需要證實。例如Gli1的活化可能受K-ras基因突變的影響，有必要結(jié)合腫瘤細胞K-ras基因點突變檢測的相關(guān)性分析。由于本研究結(jié)果也進一步證實，Gli1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以針對Gli1蛋白的分析可以更好區(qū)分開Hedgehog信號通路活化與非活化組，活化組的患者其腫瘤惡性行為更兇，預后可能更差，應采用不同的治療方案。

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Expression of Hedgehog Signal Path Transcription Factor Gli1 in the Human Colorectal Carcinoma

Guo Limei,Du Juan,Liao Ying,Li Yang,Wang Guangxi,Liu Yan

(DepartmentofPathology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100091,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression and significance of Hedgehog signal path transcription factor glioma associated oncogene 1 (Gli1) in the human colorectal carcinoma.MethodsExpressions of Gli1 protein was detected and evaluated in the 147 cases of human colorectal carcinoma by immunohistochemistry.Western blotting was used to analyze Gli1 protein in the fresh colorectal carcinoma tissues and the two cell lines of colon carcinoma.Additionally,the carcinoma cells directly isolated from 8 cases of colorectal carcinoma tissues were added with GANT61,and were observed by confocal laser microscopy.ResultsGli1 protein was detected in the nucleus and cytoplasm of carcinoma cells in the 78.2% (115/147) of the 147 cases of human colorectal carcinoma.Statistically,the expression of Gli1 protein in the human colorectal carcinoma was significantly correlated with the tumor cell clusters of invasion edge,deepness of tumor invasion,lymph node metastasis,and TNM staging,respectively (P<0.05).In 5 cases of human colorectal carcinoma with positive expression of Gli1 protein,Gli1 protein was also detected in the tumor stroma cells,including cancer associated fibroblasts and endothelial cells.Gli1 protein high expression was confirmed by Western blotting in the carcinoma tissues and the two cell lines.In addition,GANT61 inhibited the expression of Gli1 protein in the carcinoma cells isolated from the CRC tissues significantly,but not for the carcinoma-associated fibroblasts.ConclusionOverexpression of Gli1 protein may involve in the progression of human colorectal carcinoma through increasing tumor invasion and metastasis; furthermore,GANT61 may be a new drug for the therapy of advanced CRC.

[Key words]Hedgehog signal path; glioma associated oncogene 1; colorectal carcinoma; immunohistochemistry

(收稿日期：2015-11-30)

[中圖分類號]R735.3；R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2016)01-0001-06

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.01.001

作者簡介：郭麗梅(1973-)，女，博士，副教授，主要從事消化系統(tǒng)腫瘤病理診斷及研究。E-mail: guolimei@bjmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目(編號：30700349)；國家自然科學基金主任專項基金資助項目(編號：30440012)；北京市科學技術(shù)委員會基金資助項目(編號：Z131100004013036)