劉冬菊，姚　宇

(廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510360)

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姜黃素對人宮頸癌Caski細胞裸鼠移植瘤MIF和VEGF-C表達的影響

劉冬菊，姚宇

(廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510360)

[摘要]目的探討姜黃素對人宮頸癌Caski細胞裸鼠移植瘤巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、血管內皮生長因子(VEGF)VEGF-C表達的影響，以探討其抗腫瘤機制。方法建立裸鼠人宮頸癌Caski細胞移植瘤動物模型，成瘤后動物模型隨機分為5組，每組7只：陰性對照組、順鉑組(3 mg·kg-1·d-1)和3個姜黃素組(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1)。實驗結束后處死各組裸鼠，剝取瘤體并稱重，同時尋找淋巴轉移灶。應用RT-PCR和免疫組化法檢測瘤組織中MIF、VEGF-C mRNA及蛋白的表達。結果1)RT-PCR結果顯示3個姜黃素組(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1)及順鉑組瘤組織中MIF、VEGF-C mRNA的相對表達量較陰性對照組顯著減少(P<0.05)；MIF mRNA在姜黃素50 mg·kg-1·d-1組的表達與姜黃素100 mg·kg-1·d-1組、姜黃素200 mg·kg-1·d-1組的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與順鉑組表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF-C mRNA在姜黃素50 mg·kg-1·d-1組的表達與姜黃素100 mg·kg-1·d-1組、姜黃素200 mg·kg-1·d-1組及順鉑組表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2)免疫組化統(tǒng)計結果顯示：3個姜黃素組(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1)及順鉑組瘤組織中VEGF-C、MIF蛋白表達明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論姜黃素可能是通過降低人宮頸癌Caski細胞裸鼠移植瘤中MIF、VEGF-C的表達發(fā)揮抗宮頸癌淋巴轉移作用。

[關鍵詞]宮頸癌；姜黃素；移植瘤；淋巴轉移；巨噬細胞移動抑制因子；血管內皮生長因子

宮頸癌在女性常見的惡性腫瘤居第3位，而發(fā)展中國家宮頸癌發(fā)病率占全球總數(shù)的85%[1]，宮頸癌易發(fā)生淋巴轉移，是導致患者死亡的重要因素。當前抗腫瘤藥物長期使用時大都有明顯的毒副反應，比如免疫力低下、出血、胃腸穿孔等，導致宮頸癌綜合治療效果不理想。近年來從中藥中提取有效成分替代傳統(tǒng)化療藥物的研究成為熱點。本實驗研究對象姜黃素為橙黃色結晶粉末，味稍苦，是從姜科及天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種酚類色素。大量的細胞實驗和動物實驗均證明姜黃素有確切的抗腫瘤活性，其抗腫瘤作用機制主要是誘導腫瘤細胞凋亡，阻斷腫瘤細胞的生長的信號傳導通路，抑制腫瘤血管生成及調節(jié)腫瘤細胞黏附分子的表達[2]。本實驗運用RT-PCR及免疫組化法檢測巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)、血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)-C在人宮頸癌Caski細胞裸鼠移植瘤組織中的表達，進而研究姜黃素對移植瘤組織的可能作用機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株人宮頸癌Caski細胞購自廣州龍龍生物科技有限公司。

1.1.2動物SPF級雌性(BALB/c)裸小鼠(4周齡，體質量12～14 g)購自中山大學實驗動物中心。各項操作均于SPF級實驗動物嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行(室溫21～25 ℃，相對濕度60%～70%)。動物合格證號：SCXK(粵)2011-0029；醫(yī)學實驗動物使用許可證編號:SYXK(粵)2012-0081。

1.1.3主要試劑姜黃素購自美國sigma公司；注射用鹽酸順鉑購自齊魯制藥有限公司;BD Matrigel購自廣州龍龍生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司;兔抗人MIF多克隆抗體、兔抗人VEGF-C多克隆抗體及S-P免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。反轉錄試劑盒RR047A、RT-PCR引物(MIF、VEGF-C、GAPDH)；RT-PCR試劑盒RR820A購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人宮頸癌Caski細胞復蘇后于RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，放入恒溫密閉孵箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取處于對數(shù)生長期的Caski細胞，用質量分數(shù) 0.25% 胰蛋白酶消化，無血清培養(yǎng)液離心洗滌2次，并調整細胞濃度為2×106·mL-1。

1.2.2裸鼠移植瘤模型的建立于SPF級動物實驗室中嚴格無菌操作，抽取混勻細胞懸液0.2 mL(含細胞數(shù)約2×106)接種于每只裸鼠的左側腋窩外側皮下。接種后每天觀察裸鼠接種部位有無破潰及出血，以皮下結節(jié)直徑達5 mm×5 mm為成瘤標準。

1.2.3實驗分組及干預方案待移植瘤達成瘤標準后，動物模型隨機分為5組，每組7只：陰性對照組、順鉑組(3 mg·kg-1·d-1)和3個姜黃素組(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1)，參考文獻[3]提出的姜黃素產(chǎn)生抑瘤作用的最小劑量為50 mg。順鉑組采用腹腔注射法隔3 d給藥，陰性對照組及3個姜黃素組采用灌胃針經(jīng)食道灌胃給藥法，隔2 d 1次，共給藥15 d。停藥1 d后頸椎脫臼法處死裸鼠，分離瘤體用于下一步實驗。

1.2.4RT-PCR檢測MIF、VEGF-C mRNA在移植瘤組織中的表達將剝離的新鮮腫瘤組織迅速置于液氮中冷凍保存。使用Trizol法提取各組移植瘤組織總RNA,每例提取2 μL，DNase I消化去除RNA中的DNA，經(jīng)測定OD值，OD260/OD280的比值1.8~2.0，同時擴增GAPDH作為參照，每個標本重復3遍，反轉錄合成cDNA。管家基因GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’下游引物： 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；MIF上游引物： 5’-GAACAACTCCACCTTCGCCTA-3’,下游引物5’-CCGTTTATTTCTCCCCACCA-3’；VEGF-C上游引物： 5’-CAATCAGTTTTGCCAATCACA-3’，下游引物：5’-CAGGTCTTGTTCGCTGCCT-3’。95 ℃預變性30 s開始循環(huán)94 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)50次后，72 ℃延伸8 min，觀察樣品溶解曲線鋒形是否單一，確認反應特異性，記錄每個樣品Cp值，用于mRNA相對表達量分析。

1.2.5免疫組化染色檢測MIF、VEGF-C蛋白在移植瘤組織中的表達將標本經(jīng)脫水、包埋、切片，防脫片處理后用MIF、VEGF-C抗體分別進行免疫組化染色。免疫組化S-P法步驟按試劑盒說明進行。陽性對照片由廣州金域醫(yī)學檢驗中心提供。每例標本采集100、200、400倍數(shù)的照片，用Image-Pro Plus計算累積光密度(IOD)。免疫組化法檢測MIF蛋白及VEGF-C蛋白陽性染色主要定位于細胞漿，以細胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性。每張切片在400倍鏡下隨機計數(shù)10個高倍視野，用Image-Pro Plus計算蛋白IOD。

2結果

2.1各組MIF、VEGF-C mRNA表達水平的變化RT-PCR結果顯示3個姜黃素組(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1)及順鉑組瘤組織MIF、VEGF-C mRNA的相對表達量較陰性對照組明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示姜黃素顯著下調了移植瘤組織的mRNA表達水平；MIF mRNA在姜黃素50 mg·kg-1·d-1組的表達與姜黃素100 mg·kg-1·d-1組、姜黃素200 mg·kg-1·d-1組的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與順鉑組表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF-C mRNA在姜黃素50 mg·kg-1·d-1組的表達與姜黃素100 mg·kg-1·d-1組、姜黃素200 mg·kg-1·d-1組及順鉑組表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組MIF、VEGF-C蛋白表達水平的變化免疫組化統(tǒng)計結果顯示：3個姜黃素組(50 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1)及順鉑組瘤組織中VEGF-C、MIF蛋白表達明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2及圖1、2。

表1各組MIF、VEGF-C mRNA表達水平的變化

組別2-△△CTMIF/GAPDHVEGF-C/GAPDH陰性對照組——姜黃素50mg·kg-1·d-1組0.386±0.1261)0.478±0.0991)姜黃素100mg·kg-1·d-1組0.322±0.0941)0.312±0.0681)2)姜黃素200mg·kg-1·d-1組0.268±0.0541)0.178±0.0051)2)順鉑組0.149±0.0041)2)0.244±0.0411)2)F59.846101.542P<0.001<0.001

注：與陰性對照組比較，1)P<0.05；與姜黃素50 mg·kg-1·d-1組比較，2)P<0.05

表2各組MIF、VEGF-C蛋白IOD值

組別MIFVEGF-C陰性對照組5.33±0.773.46±0.11姜黃素50mg·kg-1·d-1組3.96±0.381)2.45±0.181)姜黃素100mg·kg-1·d-1組3.24±0.671)1.63±0.121)姜黃素200mg·kg-1·d-1組2.58±0.631)1.43±0.411)順鉑組2.04±0.511)2.41±0.771)

注：與陰性對照組比較，1)P<0.05

3討論

淋巴轉移是宮頸癌最重要的轉移方式之一，腫瘤細胞向間質浸潤侵入淋巴管形成瘤栓，隨淋巴液流至鄰近的淋巴結，并在淋巴管內擴散。淋巴管生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要步驟之一，VEGF-C是最早被確認的能在體內介導淋巴管生成的因子，具有促進血管內皮祖細胞移動、細胞增殖、遷移、生存和增加血管通透性的作用。Kodama等[4]的研究顯示VEGF-C通過自分泌和旁分泌方式刺激腫瘤細胞轉移，促進淋巴管新生，為宮頸癌細胞的轉移創(chuàng)造了便利條件，在早期宮頸癌的淋巴結轉移中發(fā)揮了重要作用。Saharinen等[5]研究發(fā)現(xiàn)動物移植瘤模型中VEGF-C能被大量分泌，促進微淋巴管新生，從而促進淋巴轉移。趙群等[6]的研究顯示VEGF-C及VEGF-D mRNA在宮頸癌內、癌周、前哨轉移淋巴結中的表達均顯著高于正常宮頸組織和非前哨無轉移淋巴結(P<0.05)，提示VEGF-C在早期宮頸癌的淋巴結轉移中起重要作用。本實驗中，RT-PCR及免疫組化染色結果均顯示各姜黃素組均下調了裸鼠移植瘤組織中VEGF-C的mRNA及蛋白表達量，隨著劑量增加，其表達逐漸降低，提示可能是通過抑制瘤組織中VEGF-C的表達，抑制了癌周淋巴結的轉移。

圖1　各組瘤組織中MIF蛋白的表達(S-P，×400)

圖2　各組瘤組織中VEGF-C蛋白的表達(S-P，×400)

在腫瘤微環(huán)境中,炎性細胞在腫瘤進展中發(fā)揮著重要作用。其中，腫瘤相關巨噬細胞浸潤取決于由腫瘤細胞和基質響應于腫瘤侵襲分泌的一種趨化因子[7]。巨噬細胞已被發(fā)現(xiàn)可能促進早期階段的抗腫瘤反應，刺激新血管形成和轉移的晚期疾病。MIF是一種由活化T細胞產(chǎn)生并能抑制離體巨噬細胞遷移和促進巨噬細胞的聚集的細胞因子，1966年由Bloom等[8]研究遲發(fā)性超敏反應時發(fā)現(xiàn)。MIF不僅是調節(jié)免疫和炎癥反應中關鍵的細胞因子，而且MIF通過調節(jié)免疫反應和通過促進相關的VEGF的血管生成增強腫瘤細胞轉移。Krockenberger等[9]研究發(fā)現(xiàn)MIF在浸潤性宮頸癌組織蛋白和mRNA水平上過度表達，提示MIF與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關。Li等[10]用過TMA和免疫組化檢測10例正常宮頸上皮組織、18宮頸上皮內瘤變(CIN Ⅱ、Ⅲ)和31宮頸鱗癌標本MIF和VEGF蛋白的表達，結果顯示MIF陽性表達率分別為0.0%、72.2%和93.5%，VEGF蛋白表達率分別為10.0%、44.4%和74.2%，MIF，VEGF的表達水平顯著高于CIN和正常組織，并且均與腫瘤分化有關?？傊?，MIF和VEGF-C具有協(xié)同效應，MIF可能是通過上調VEGF的表達,促進微淋巴管新生與淋巴轉移，從而促進腫瘤的浸潤和轉移。本實驗中，各姜黃素組均下調了裸鼠移植瘤組織中MIF的蛋白及mRNA表達量，并且隨著劑量增加，其表達逐漸低，其機制可能是通過下調MIF的表達，抑制了腫瘤組織中微淋巴管新生與淋巴轉移，進而下調VEGF的表達，通過協(xié)同作用進而抑制腫瘤的浸潤和轉移。

姜黃素為橙黃色結晶粉末，通常認為其是姜黃中最有效的成分，具有明顯的抗腫瘤作用,是一種頗具前景的抗腫瘤藥物[11-13]。姜黃素對于不同類型的腫瘤具有調制血管生成、增殖、侵襲的作用。本研究應用姜黃素后，移植瘤裸鼠未出現(xiàn)明顯的毒副反應，通過檢測MIF和VEGF-C在人宮頸癌Caski細胞裸鼠移植瘤組織中的蛋白及mRNA的表達也發(fā)現(xiàn)姜黃素降低人宮頸癌Caski細胞裸鼠移植瘤中MIF、VEGF-C的表達，這可能是其發(fā)揮抗宮頸癌淋巴轉移作用的具體機制。

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Effects of Curcumin on the Expressions of MIF and VEGF-C in the Human Cervical Cancer Caski Cells Xenografts in Nude Mice

Liu Dongju,Yao Yu

(TheThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510360,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of curcumin on the expressions of macrophage migration inhibitory factor (MIF) and vascular endothelial growth factor (VEGF)-C in the human cervical cancer Caski cells xenografts in nude mice for clarifying their possible mechanism of anti tumor.MethodsNude mice were randomized into the negative control group,the cisplatin group (3 mg·kg-1·d-1) and the three curcumin groups (50 mg·kg-1·d-1,100 mg·kg-1·d-1,200 mg·kg-1·d-1) after establishing the human cervical cancer Caski cells xenografts.RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the mRNA and protein expressions of MIF and VEGF-C in the tumor tissues.Results1) The mRNA levels of MIF and VEGF-C in the tumor tissue of the cisplatin group and the three curcumin groups (50 mg·kg-1·d-1,100 mg·kg-1·d-1,200 mg·kg-1·d-1) were significantly lower than those of the negative control group (P<0.05); there were no statistical differences in the mRNA level of MIF in the tumor tissue between the 50 mg·kg-1·d-1curcumin group and the 100 mg·kg-1·d-1curcumin group or the 200 mg·kg-1·d-1curcumin group (P>0.05); there was statistical difference in the mRNA level of MIF in the tumor tissue between the 50 mg·kg-1·d-1curcumin group and the cisplatin group (P<0.05); there were statistical differences in the mRNA level of VEGF-C in the tumor tissue between the 50 mg·kg-1·d-1curcumin group and the 100 mg·kg-1·d-1curcumin group or the 200 mg·kg-1·d-1curcumin group or the cisplatin group (P<0.05); 2) The protein levels of MIF and VEGF-C in the tumor tissue of the cisplatin group and the three curcumin groups (50 mg·kg-1·d-1,100 mg·kg-1·d-1,200 mg·kg-1·d-1) were significantly lower than those of the negative control group (P<0.05).ConclusionCurcumin can prevent the lymphatic metastasis of cervical cancer by reducing MIF,VEGF-C expression of human cervical cancer Caski cells xenografts in nude mice.

[Key words]cervical cancer; curcumin; xenografts; lymphatic metastasis; macrophage migration inhibition factor; vascular endothelial cell growth factor

(收稿日期：2015-09-15)

[中圖分類號]R737.33；R730.23

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2016)01-0010-05

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2016.01.003

作者簡介：劉冬菊(1971-)，女，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事婦科腫瘤相關研究。E-mail:358001490@qq.com

基金項目：廣東省科技計劃項目(編號:2012B061700029)