韓志偉戎瑞洲孔鵬洲程彩霞張燕燕董金垚李曙晶郭建昇

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MUC15和PI3K/Akt表達與胃癌臨床病理特征及預后的相關(guān)性研究

韓志偉①戎瑞洲①孔鵬洲②②程彩霞④張燕燕①董金垚①李曙晶①郭建昇①

摘要目的：探討MUC15和PI3K/Akt的表達與胃癌臨床病理特征和預后的關(guān)系。方法：采用組織芯片和免疫組織化學法檢測144例胃癌組織及對應癌旁組織中MUC15、Akt的表達。結(jié)果：MUC15在胃癌中陽性表達率為79.8%，高于癌旁組織中的陽性表達率22.2%（P<0.01）；Akt在胃癌中陽性表達率為80.6%，高于癌旁組織的陽性表達率16.7%（P<0.01）。MUC15和Akt表達均與胃癌分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)（P<0.05）；且胃癌組織中MUC15表達和Akt表達呈正相關(guān)（P=0.001）。單因素生存分析顯示，MUC15和Akt高表達均與生存時間呈負相關(guān)（P<0.05）。Cox多元回歸分析提示，MUC15和Akt同時陽性的胃癌患者預后更差（HR=3.115，P<0.05）。結(jié)論：MUC15可能通過PI3K/Akt細胞信號轉(zhuǎn)導通路參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移，MUC15結(jié)合Akt是胃癌預后強有力的預測因子。

關(guān)鍵詞胃癌免疫組織化學MUC15 PI3K/Akt預后

Expression of MUC15 and PI3K/Akt in gastric carcinoma and its association with clinicopathological characteristics and prognosis

Zhiwei HAN1, Ruizhou RONG1, Pengzhou KONG2,3, Caixia CHENG4, Yanyan ZHANG1, Jinyao DONG1, Shujing LI1, Jiansheng GUO1
Correspondence to: Jiansheng GUO; E-mail: jianshengguo@sina.com
1Department of General Surgery, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;2Translational Medicine Research Center, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;3Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;4Department of Pathology, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

Abstract Objective: To analyze the expression of MUC15 and PI3K/Akt in gastric carcinoma and its association with clinicopathological characteristics and prognosis.Methods: The expression of MUC15 and Akt was detected in 144 cases of gastric carcinoma tissues and corresponding para-carcinoma tissues by tissue microarray and immunohistochemistry.Results: The positive expression rate of MUC15 in gastric carcinoma was 79.8%, higher than that of para-carcinoma tissues（22.2%, P<0.01）.The positive expression rate of Akt protein in gastric carcinoma was 80.6%, higher than that of para-carcinoma tissues（16.7%, P<0.01）.The expression of MUC15 and Akt was statistically associated with the grades of differentiation, invasion depth, lymphatic metastasis, TNM stage of tumor tissues（P< 0.05）, and the positive correlation between the two protein expression that appear in the gastric tumor tissue（P=0.001）.Univariate survival analysis showed that the over-expression of either MUC15 or Akt was inversely correlated with the survival time（P<0.05 and P<0.01, respectively）.Cox multiple regression analysis indicated that patients with over-expression of both MUC15 and Akt had the worst prognoses（HR=3.115, P<0.05）.Conclusion: MUC15 may be involved in the occurrence, development, invasion, and metastasis of gastric cancer through the PI3K/Akt cell signaling pathway, and the expression of MUC15 combined with Akt is a powerful predictor for the prognosis of gastric cancer.

Keywords:gastric carcinoma, immunohistochemistry, MUC15, PI3K/Akt, prognosis

在我國，胃癌發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第2位和第3位［1］，晚期胃癌患者5年生存率僅20%［2］。隨著胃癌分子生物學研究的深入，胃癌的分子靶向治療成為胃癌研究的重點與熱點［3］。粘蛋白（mucin，MUC）家族成員MUC15可通過改變細胞間黏附、調(diào)控信號通路等途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到極為重要的作用［4-5］。研究表明MUC15可調(diào)控PI3K/Akt信號通路的失活，抑制肝癌細胞遷移及侵襲的能力［6］。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的失調(diào)在細胞凋亡、細胞侵襲與轉(zhuǎn)移、細胞周期調(diào)節(jié)、腫瘤血管形成以及化療耐藥中發(fā)揮了重要的作用，是腫瘤靶向治療的熱點［7-8］。但是MUC15在胃癌中的表達和作用及其與PI3K/Akt在胃癌中的相關(guān)性研究鮮見報道。本研究利用組織芯片和免疫組織化學技術(shù)檢測MUC15和PI3K/Akt在胃癌組織、癌旁組織的表達，分析MUC15 和PI3K/Akt信號通路表達與胃癌臨床病理特征及胃癌患者術(shù)后預后的相關(guān)性，為發(fā)現(xiàn)新的胃癌預后指標和靶向治療位點提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象選取山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院2010 年1月至2013年12月臨床資料完整的胃癌術(shù)后石蠟標本作為研究對象，其中胃癌組織144例，對應癌旁組織144例（經(jīng)HE染色證實均無癌細胞），所有病例經(jīng)病理確診均為腺癌。其中男性111例，女性33例；年齡28～81歲，中位年齡54.5歲；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期94例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移107例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。所有病例術(shù)前均未進行放化療等治療。

1.1.2主要試劑兔抗人MUC15抗體（上海Abcam公司），兔抗人Akt抗體（武漢博士德生物工程有限公司），抗體封閉用正常山羊血清（北京索萊寶科技有限公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠/兔二抗（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2免疫組織化學

1.2.1組織芯片制備組織芯片蠟塊制備儀制備10× 6孔的組織芯片受體蠟塊，各孔間距為1 mm、內(nèi)徑為2.2 mm。調(diào)取石蠟標本對應HE染色玻片，選取病變典型部位并在供體石蠟標本上做好相應標記，打孔套針穿取直徑為2.2 mm的蠟塊組織芯放入受體蠟塊孔內(nèi)，每個受體蠟塊左上角留2個空白孔用于定位。對制成的芯片蠟塊常規(guī)4 μm厚連續(xù)切片，敷貼在3-氨丙基-3-甲氧基硅烷處理的載玻片上，恒溫箱70℃過夜。

1.2.2免疫組織化學染色以PBS作陰性對照。標本經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS漂洗3遍，檸檬酸鹽修復液高壓修復，山羊血清37℃封閉20 min，滴加一抗（MUC15抗體濃度1:200，Akt抗體濃度1:100）4℃過夜，PBS漂洗3遍，加入HRP標記羊抗鼠/兔二抗，37℃孵育15 min，PBS漂洗3遍，DAB顯色液顯色，蘇木素復染3 min，鹽酸乙醇分化，脫水后封片保存。

1.2.3結(jié)果判斷標準每張切片高倍鏡下隨機選取5個視野，觀察并記錄細胞染色強度：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。記錄陽性細胞占腫瘤實質(zhì)細胞的百分比：陽性細胞數(shù)占腫瘤實質(zhì)細胞≤25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；> 75%為4分。陽性細胞比例與細胞染色強度計分的乘積為每例標本的最終積分。<3分為陰性（-），≥3分為陽性（+）。所有切片染色結(jié)果均由兩名病理醫(yī)師獨立評分。

1.3隨訪

采用以再次復診、電話聯(lián)系等方式進行，隨訪起始日期設為手術(shù)之日，患者死亡為隨訪終點，隨訪截止日期為2015年10月1日。隨訪時間21～70個月，中位隨訪時間45個月，共失訪50例，隨訪率65.3%。

1.4統(tǒng)計學方法

運用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，單因素生存分析采用Kaplan-Meier生存分析并進行Log-rank檢驗，多因素生存分析用Cox回歸分析法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組織、對應癌旁組織中MUC15和PI3k/Akt的表達

2.1.1MUC15蛋白的表達MUC15蛋白在胃癌組織（圖1A）、癌旁組織（圖1B）中均有不同程度的表達，表達信號為棕黃色，定位于細胞質(zhì)。胃癌組織和癌旁組織MUC15蛋白陽性表達率分別為79.8%（115/144）、22.2%（32/144），表達率的差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=95.72，P<0.001）。胃癌組織中MUC15的表達水平明顯高于其對應癌旁組織中MUC15的表達。

2.1.2Akt蛋白的表達Akt蛋白在胃癌（圖1C）、癌旁組織（圖1D）中均有不同程度的表達，表達信號為棕黃色，定位于細胞質(zhì)。胃癌組織和癌旁組織Akt蛋白陽性表達率分別為80.6%（116/144）、16.7%（24/144），胃癌組織中Akt的表達水平明顯高于其對應癌旁組織中Akt的表達，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2= 117.65，P<0.001）。

2.2胃癌組織中MUC15和Akt的表達與胃癌患者臨床特征的關(guān)系

胃癌組織中MUC15的表達在不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、微血管浸潤、神經(jīng)侵犯中的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。胃癌組織中Akt的表達在不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度、腫瘤大小中的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在年齡、性別、腫瘤部位、微血管浸潤、神經(jīng)侵犯中的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表1）。

2.3胃癌組織中MUC15和Akt表達的相關(guān)性

115例MUC15陽性的胃癌組織中Akt表達陽性99例（86.1%），Akt表達陰性16例（13.9%）；29例MUC15陰性胃癌中Akt表達陽性17例（58.6%），Akt表達陰性12例（41.4%）。經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)分析（r=0.278，P= 0.001），MUC15和Akt蛋白表達的相關(guān)性具有統(tǒng)計學意義，二者表達呈正相關(guān)（表2）。

圖1　MUC15和Akt蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達（S-P×200）Figure 1 Expression of MUC15 and Akt in gastric carcinoma tissue and paired adjacent tissues was detected with immunohistochemistry（S-P×200）

表1　胃癌組織中MUC15和Akt的表達與胃癌患者臨床特征的關(guān)系Table 1 Association between the expression of MUC15 or Akt in gastric carcinoma tissue and clinicopathological variables of gastric cancer patients

表2　胃癌組織中MUC15和Akt表達的相關(guān)性Table 2 Correlation between the expression of MUC15 and Akt in gastric carcinoma tissue

2.4胃癌中組織MUC15和Akt的表達與患者預后的關(guān)系

2.4.1單因素分析MUC15和Akt的表達與預后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，隨訪94例胃癌手術(shù)患者的中位生存期為41（20～62）個月。94例胃癌組織中，MUC15陽性表達76例，陰性18例，MUC15陽性組中位生存期為28個月，MUC15陰性組中位生存期>52個月，Log-rank檢驗MUC15陰性組總體生存率大于陽性組（χ2=4.206，P=0.040，圖2A）。Akt陽性表達72例，陰性表達22例，Akt陽性組中位生存期為25個月，陰性組中位生存期>52個月，Logrank檢驗Akt陰性組生總體生存率大于陽性組（χ2= 6.045，P=0.014，圖2B）。

2.4.2胃癌組織中MUC15和Akt結(jié)合表達與預后的關(guān)系將隨訪94例病例分為MUC15（+）Akt（+）、MUC15 （+）Akt（-）、MUC15（-）Akt（+）、MUC15（-）Akt（-）4組，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示MUC15（+）Akt（+）組中位生存期23個月，MUC15（-）Akt（-）組47個月（圖2C），Log-rank檢驗4組的總體生存率有顯著性差異（χ2= 10.762，P=0.013，表3，圖2C）。4個組分別進行成對檢測，MUC15（+）Akt（+）組的總生存率顯著低于MUC15（-）Akt（-）組（χ2=5.435，P=0.020），而其他各組成對檢測總體生存率無顯著性差異（P>0.05，表4）。

2.4.3胃癌生存預后的Cox多元回歸分析將與生存相關(guān)的各項指標均納入單因素生存分析，結(jié)果提示：腫瘤TNM分級（χ2=8.098，P=0.004）、腫瘤直徑（χ2= 12.049，P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=12.385，P<0.001）、浸潤深度（χ2=9.971，P=0.002）、分化程度（χ2=22.979， P<0.001）與患者生存期相關(guān)。將上述臨床病理因素和MUC15、Akt均納入Cox比例風險模型進行多因素分析，結(jié)果提示：浸潤深度（HR=2.267）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=3.311）、分化程度（HR=2.250）和Akt（HR= 2.031）均為生存預后的獨立危險因素，且MUC15和Akt均高表達的風險比（HR=3.115）較單一Akt高表達要高（圖3）。

表3　MUC15/Akt表達與胃癌患者生存期關(guān)系的總體Log-rank檢驗Table 3 Overall Log-rank test of the relationship between MUC15/Akt expression and overall survival（OS）in gastric cancer patients

圖2　胃癌組織中MUC15和Akt表達與患者總生存期的關(guān)系Figure 2 Relationship between the expression of MUC15 or Akt in gastric carcinoma tissue and OS of gastric cancer patients

表4　成對比較MUC15/Akt表達與胃癌患者生存期的關(guān)系Table 4 Comparative analysis of the relationship between the expression of MUC15/Akt and OS in gastric cancer patients with different combination statuses

?圖3　胃癌患者生存預后的Cox多元回歸分析Figure 3 Cox multivariate regression analysis of survival prognosis in gastric cancer patients

3　討論

胃癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時即為進展期，早期胃癌患者手術(shù)后5年生存率高達95%，進展期胃癌患者僅行擴大根治手術(shù)，54%的胃癌患者術(shù)后發(fā)生腫瘤復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，且由于化療的不良反應及耐藥往往使晚期胃癌患者生存期不足1年［2］。因此探究胃癌發(fā)生發(fā)展分子機制，鑒定胃癌早期診斷、預后和藥物靶點的新型分子標志物，對提高胃癌患者生存率具有重要意義。

MUC是一種相對分子質(zhì)量較高的糖蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)21種黏蛋白MUC家族成員，可分為膜結(jié)合型和分泌型兩個亞家族［9］。正常生理狀況下MUC起著潤滑、保護、屏障等作用，參與細胞黏附、信號轉(zhuǎn)導、細胞-細胞間的相互作用，異常表達的MUC參與調(diào)控腫瘤細胞的分化、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移以及化療藥物抵抗等過程［10-11］。有研究顯示，MUC1的高表達是胃癌預后不佳的指標之一［12］；腹腔沖洗液中MUC2表達水平越高提示胃癌伴腹腔轉(zhuǎn)移的患者預后越差［13］；胃癌細胞MUC5AC的表達水平較正常胃黏膜細胞低，其表達水平與胃癌的嚴重程度有關(guān)［14］。

MUC15基因定位于人染色體11p14.3，編碼一個具有334個氨基酸的跨膜蛋白［15］，其在腫瘤中的作用也得到越來越多的重視。研究顯示，MUC15在結(jié)腸癌［4］、甲狀腺癌［16］、食管鱗癌［17］、腦膠質(zhì)瘤［18］等多種腫瘤組織中高表達，提示其異常高表達可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但也有研究顯示過表達MUC15在滋養(yǎng)細胞腫瘤、肝細胞癌中起到了抑癌作用［5-6］。Oh等［19］對胃癌MUC15基因進行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和DNA直接測序研究發(fā)現(xiàn)，14.7%的高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）胃癌中存在MUC15基因移碼突變，并發(fā)現(xiàn)2種突變類型［c.60delA（p.Lys20Asnfsx12）、c.60dupA（p.Pro21Thrfsx47）］，分別導致MUC15蛋白鏈第20個和第21個后的氨基酸表達缺失，使MUC15胞質(zhì)域的C端缺失，可能抑制胃癌細胞增殖和侵襲。本研究顯示，胃癌組織中MUC15的表達水平高于其對應的癌旁非腫瘤組織，并且表達水平與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度相關(guān)，提示MUC15在胃癌組織中的表達增高可能促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其異常表達可能增強胃癌的惡性程度。

PI3K/Akt信號通路是目前各種腫瘤靶向治療研究的熱點［20］。研究顯示MUC15在肝細胞癌中和EGFR相互作用介導信號通路PI3K/Akt的失活，進而下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-7和上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP2抑制肝癌細胞遷移及侵襲的能力［8］。并且有研究顯示PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路可上調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達，降解細胞外基質(zhì)，促進癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移［21- 22］。在人類結(jié)腸癌細胞系中MUC15可活化p-ERK而增強結(jié)腸癌惡性潛能［4］，而直腸癌細胞中ERK-MAPK信號通路活化可誘導MMP-2、MMP-9的表達，促進細胞外基質(zhì)的降解，增加細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性［23］。而在人類滋養(yǎng)層細胞癌中MUC15可促進TIMP-1及TIMP-2的過度表達，從而抑制滋養(yǎng)層癌細胞的侵襲性［5］。本研究結(jié)果顯示胃癌中MUC15和Akt均高表達，均與胃癌侵襲性的臨床病理特征相關(guān)，并且MUC15和Akt蛋白表達之間呈正相關(guān)。結(jié)合本研究推測MUC15在胃癌中可能通過激活PI3K/Akt信號通路，增加胃癌細胞的侵襲性。MUC15在胃癌中與PI3K/Akt信號通路的相互作用機制，以及是否能進一步通過調(diào)控MMPs家族而增強胃癌細胞惡性潛能，還需要進一步研究。

本研究Kaplan-Meier曲線對94例隨訪患者的生存分析提示，MUC15、Akt陰性組生存期明顯高于陽性組，MUC15和Akt是影響胃癌患者術(shù)后生存的危險因素，可作為評估胃癌臨床進展和預后的重要參考指標；胃癌組織中MUC15和Akt結(jié)合的成對生存分析提示MUC15（+）Akt（+）組的總生存率顯著低于MUC15（-）Akt（-）組，但是其余的配對組無明顯差異，與上訴單因素生存分析結(jié)論相矛盾，可能由于配對組的樣本量小，存在偏倚誤差。Cox多元回歸分析顯示，MUC15和Akt共同高表達較單一Akt高表達能夠預測更具侵襲性的胃癌臨床病理特征及更差的預后。將MUC15水平和Akt水平結(jié)合，明顯較單獨MUC15或Akt一個因素可更好地預測患者的預后。

綜上所述，本研究表明MUC15和PI3k/Akt在胃癌組織中的高表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可作為評估胃癌臨床進展和預后的重要參考指標，MUC15結(jié)合Akt是有力的胃癌預后預測因子，MUC15也有可能成為胃癌靶向治療新的潛在靶點。但以上結(jié)果仍需要大樣本的臨床病例及功能學實驗進一步的驗證。

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（2015-11-06收稿）

（2016-01-11修回）

（編輯：邢穎）

韓志偉專業(yè)方向為胃腸腫瘤外科。

E-mail：hanzhiwei22@163.com

作者簡介

通信作者：郭建昇jianshengguo@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.02.211

作者單位：①山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院普通外科（太原市030001）；②山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心；③山西醫(yī)科大學細胞生理學教育部重點實驗室；④山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院病理科