陳柳菁，李娟，孟姝

(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，成都610041)

乳鐵蛋白調(diào)控炎癥反應(yīng)中NF-κB表達(dá)的分子機(jī)制研究進(jìn)展

陳柳菁，李娟，孟姝

(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，成都610041)

乳鐵蛋白是一種天然的免疫調(diào)節(jié)蛋白，而NF-κB在細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等過程中具有重要作用。乳鐵蛋白與NF-κB在結(jié)構(gòu)與功能上密切相關(guān)，其在炎癥反應(yīng)中對NF-κB具有重要的調(diào)控作用；在機(jī)體的不同疾病狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的不同階段，不同物種的乳鐵蛋白呈現(xiàn)出不同的效應(yīng)。

乳鐵蛋白；核轉(zhuǎn)錄因子kappa B；炎癥

乳鐵蛋白是在多個種族之間具有高度同源性的多功能糖基化蛋白[1]，具有抗微生物、激活免疫細(xì)胞、抑制炎性因子、抑制嗜酸性粒細(xì)胞增殖、清除自由基、抑制癌細(xì)胞生長等功能[2, 3]。NF-κB是一種重要的快反應(yīng)核轉(zhuǎn)錄因子[4]，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；NF-κB信號通路又是與炎癥級聯(lián)反應(yīng)關(guān)系最為密切的信號通路，以NF-κB為節(jié)點(diǎn)，多條信號通路相互溝通交聯(lián)?；?qū)用嫔希殍F蛋白DNA上具有兩個位點(diǎn)，可能通過與NF-κB基因二聚轉(zhuǎn)錄因子REL同源區(qū)(RHDs)靶點(diǎn)結(jié)合而實(shí)施對NF-κB的調(diào)控[5, 6]；分子層面上，乳鐵蛋白的碳水化合物鏈[7]和N端肽段[8]是調(diào)控NF-κB表達(dá)的重要結(jié)構(gòu)。乳鐵蛋白對炎癥反應(yīng)的干預(yù)與其對NF-κB的調(diào)控作用密不可分。本研究對炎癥反應(yīng)中乳鐵蛋白調(diào)控NF-κB表達(dá)的分子機(jī)制研究進(jìn)展綜述如下。

1 乳鐵蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與NF-κB的聯(lián)系

1.1 乳鐵蛋白調(diào)控NF-κB有關(guān)的基因位點(diǎn) 當(dāng)G-菌侵入機(jī)體時，乳鐵蛋白通過與G-菌的脂多糖(LPS)相互作用調(diào)控NF-κB的表達(dá)。Pauciullo等[6]發(fā)現(xiàn)，山羊乳鐵蛋白啟動子區(qū)包含了3個可能與LPS結(jié)合相關(guān)的元件，其中2個是與調(diào)控NF-κB表達(dá)有關(guān)的位點(diǎn)，即-960/-949和-852/-838。這兩個位點(diǎn)所屬區(qū)域在人、牛、豬、鼠、駱駝等物種中均具有高度保守性，說明其在乳鐵蛋白對NF-κB基因?qū)用娴恼{(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵作用。Gilmore等[5]則認(rèn)為，乳鐵蛋白基因啟動子和增強(qiáng)子區(qū)的κB位點(diǎn)(50-GGGRNNYYCC-30，N為任意核苷酸)能與NF-κB基因二聚轉(zhuǎn)錄因子REL同源區(qū)(RHDs)結(jié)合，從而實(shí)施對NF-κB的調(diào)控。

1.2 乳鐵蛋白調(diào)控NF-κB相關(guān)的結(jié)構(gòu) 乳鐵蛋白是一種糖蛋白，糖基共價結(jié)合在Asn-XThr/Ser(X為任意氨基酸)的天冬酰胺殘基上，形成2～4條N-連接型碳水化合物鏈。該碳水化合物鏈經(jīng)分離、純化后可促進(jìn)鼠成纖維細(xì)胞NF-κB RelA:p50的活化；同時，在THP-1細(xì)胞系的實(shí)驗中也表明，當(dāng)人乳鐵蛋白的碳水化合物鏈被水解成寡肽甚至氨基酸時是無法誘導(dǎo)NF-κB活化的[9]。上述研究表明，碳水化合物鏈在人乳鐵蛋白誘導(dǎo)NF-κB活化方面不可或缺[7]。乳鐵蛋白多肽鏈N端肽段也為乳鐵蛋白功能的發(fā)揮提供了基礎(chǔ)。Ando等[7]研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白可以削弱THP-1細(xì)胞株中LPS誘導(dǎo)NF-κB活化的能力，與乳鐵蛋白上能與LPS結(jié)合的某一多肽段相關(guān)。Xin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，豬乳鐵蛋白N端肽段LFP-20能抑制IKK-β的磷酸化，使IκB-α和NF-κB(p65)的磷酸化減少，從而抑制NF-κB(p65)的活化。

2 乳鐵蛋白對炎癥反應(yīng)中NF-κB表達(dá)的調(diào)控作用

靜息狀態(tài)下，NF-κB與抑制單位IκB的中心區(qū)結(jié)合，以NF-κB-IκB復(fù)合體的無活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。盡管許多因素都能活化NF-κB，但所有通路都擁有一個核心調(diào)控子，即IKK復(fù)合物。IKK復(fù)合物由2個催化亞單位(IKKα、IKKβ)及1個調(diào)控亞單位IKKγ(NF-κB的基本調(diào)節(jié)子，也稱為NEMO)組成[10]，IKKβ的活化能使IκBα磷酸化，隨后被K48(或K63)多聚泛素化和蛋白酶降解，使NF-κB脫離IκB的束縛而進(jìn)入細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合，啟動下游靶基因的表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]。也有報道顯示，NF-κB的活化依賴于自身第536位氨基酸Ser536的磷酸化，與IκBα無關(guān)[12]。乳鐵蛋白既參與固有免疫，又參與適應(yīng)性免疫，不僅可幫助宿主抵抗微生物入侵，也使宿主免于遭受炎癥的破壞性效應(yīng)。但是在機(jī)體不同的疾病狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的不同階段，不同物種的乳鐵蛋白表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，即乳鐵蛋白既有抗炎作用，又有促炎作用。乳鐵蛋白對NF-κB的調(diào)控大多數(shù)情況下表現(xiàn)為抑制，但也可表現(xiàn)為促進(jìn)。

2.1 下調(diào)NF-κB表達(dá) 研究表明，在2.5%硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，牛乳鐵蛋白能減少NF-κB的表達(dá)，緩解小鼠炎癥表現(xiàn)[13]。van der Does等[14]研究表明，hLF1-11(由人乳鐵蛋白N端頭11個氨基酸組成)能降低單核細(xì)胞中NF-κB(p65)的表達(dá)。此外，乳鐵蛋白能減少2型糖尿病小鼠模型中LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1表達(dá)[15]，其機(jī)制與競爭性結(jié)合相關(guān)細(xì)胞因子啟動子區(qū) NF-κB位點(diǎn)有關(guān)[16]。研究表明，在人K562和Caco-2細(xì)胞核中的ICAM-1啟動子區(qū)域，LF作用位點(diǎn)和NF-κB作用位點(diǎn)存在一定交叉[17]。外源性乳鐵蛋白(LF)可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，競爭性結(jié)合ICAM-1啟動子上與NF-κB位點(diǎn)重疊的LF位點(diǎn)，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1等炎性因子的生成[18]。乳鐵蛋白下調(diào)NF-κB的作用主要通過MyD88途徑和TRAF6途徑實(shí)現(xiàn)。

2.1.1 MyD88途徑 生理情況下，TLR4被激活后，MyD88可在橋接配體TIRAP的介導(dǎo)下與TLR4結(jié)合；也能借助雙方蛋白結(jié)構(gòu)中的死亡域、激酶與IRAK4結(jié)合。IRAK4相關(guān)受體隨后使IRAK1磷酸化，磷酸化的IRAK1則能與E3泛素化連接酶TRAF6形成復(fù)合物[19]，在包含UBC13和UEV1A的E2復(fù)合物的輔助下，引起由K63介導(dǎo)的TRAF6多聚泛素化，并通過TAB2和TAB3泛素結(jié)合蛋白招募TAK1[20]。TAK1是一種IKK激酶，能磷酸化IKKβ活化鏈中關(guān)鍵性的絲氨酸，從而使IKKβ活化，隨后磷酸化，并經(jīng)歷IκBα K48基團(tuán)多聚泛素化的過程，最終導(dǎo)致IκBα降解，激活NF-κB[21]。Xin等[8]研究表明，LPS能上調(diào)豬肺泡巨噬細(xì)胞MyD88表達(dá)，而豬乳鐵蛋白活性肽段(LFP-20)則抑制MyD88表達(dá)。采用siRNA技術(shù)干擾巨噬細(xì)胞中MyD88的表達(dá)后，LFP-20則無法抑制IKK-β的磷酸化，也不能下調(diào)NF-κB的表達(dá)。因此推測LFP-20是通過下調(diào)活化的巨噬細(xì)胞中與MyD88相互作用的信號分子而影響MyD88表達(dá)，如抑制MyD88上游分子TLR4等。LFP-20能抑制豬肺泡巨噬細(xì)胞中LPS所誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)，主要是通過削弱LFP-20對LPS的細(xì)胞外結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的[8]，但LFP-20能否抑制LPS與TLR4的結(jié)合活性目前尚無研究證實(shí)。此外，LFP-20也能通過MyD88抑制MAPK信號通路間接實(shí)現(xiàn)對NF-κB的調(diào)節(jié)，并影響炎癥反應(yīng)中的相關(guān)細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄[22]。

2.1.2 TRAF6途徑 Toshihiro等[18]研究表明，牛乳鐵蛋白可下調(diào)LPS介導(dǎo)的NF-κB表達(dá)，其作用靶點(diǎn)不在MyD88，而在MyD88甚至IRAK1的下游；這些下游信號通過特異性結(jié)合TLR4受體的結(jié)構(gòu)域來阻斷TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并抑制IRAKI的降解；而當(dāng)選擇性抑制IKKβ時，則不能抑制IRAKI的降解。因此，IRAK1的降解需要IRAK1激酶的作用和自動磷酸化作用，說明牛乳鐵蛋白的調(diào)控靶點(diǎn)位于IRAK1的下游。研究表明，牛乳鐵蛋白是通過干擾TNF受體相關(guān)因子(TRAF6)的多聚泛素化來影響NF-κB活化的，且具有時間依賴性；LPS能明顯引起小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞ST2細(xì)胞株TRAF6 Lys-63相關(guān)的泛素化，而預(yù)先用牛乳鐵蛋白處理過的LPS則沒有這種作用，TRAF6-TAK1復(fù)合物的形成也受到抑制，無法使IKK激活[23]。分析原因，可能是牛乳鐵蛋白直接與ST2細(xì)胞株中的內(nèi)源性TRAF6結(jié)合，從而阻斷NF-κB的活化。但Oh等[24]研究表明，乳鐵蛋白可通過上調(diào)TRAF6而促進(jìn)NF-κB的表達(dá)；其機(jī)制可能是乳鐵蛋白通過與TRAF6的環(huán)指或鋅指區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而招募IKK復(fù)合物，最終使NF-κB(p65)磷酸化活性增強(qiáng)。

2.2 上調(diào)NF-κB表達(dá) 雖然大多數(shù)研究顯示乳鐵蛋白具有優(yōu)良的抗炎特性，能抑制NF-κB的表達(dá)，但也有研究報道，乳鐵蛋白可上調(diào)NF-κB的表達(dá)[7]。Ando等[7]研究表明，人乳鐵蛋白在25～500 μg/mL(遠(yuǎn)低于生理濃度)時，可以不依賴于LPS或其經(jīng)典的活化因子(如TNF或IL-1)，便能激活THP-1細(xì)胞株NF-κB的表達(dá)，與前述乳鐵蛋白可下調(diào)NF-κB表達(dá)的結(jié)論不符。Ando等[7]認(rèn)為，乳鐵蛋白糖基化后與CD14形成LF-CD14復(fù)合物，一方面的確能干擾CD14-LPS復(fù)合物的形成，從而減弱LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)NF-κB的表達(dá)；另一方面又能通過碳水化合物鏈激活TLR4，通過MyD88依賴和非依賴途徑活化NF-κB。由MyD88介導(dǎo)的LF對NF-κB的活化過程，與生理調(diào)節(jié)過程相似；而在MyD88非依賴途徑中，LF可通過TRIF來活化NF-κB。當(dāng)TLR4激活TRIF后，TRIF可通過N端的TRAF6結(jié)合相關(guān)基序直接與TRAF6結(jié)合，其C端包含Rip同源基序，可與RIP1結(jié)合[25]。與MyD88依賴途徑類似，TRAF6可活化TAK1，RIP1可通過多聚泛素化與TRAF6、TAK1形成復(fù)合物，導(dǎo)致NF-κB的活化[26]。但實(shí)際上，在TLR4介導(dǎo)LF對NF-κB的調(diào)節(jié)過程中，是先通過MyD88依賴途徑，再通過TRIF途徑而實(shí)現(xiàn)的[7]。

關(guān)于何種情況下乳鐵蛋白上調(diào)和下調(diào)NF-κB表達(dá)的作用更為突出，可能與乳鐵蛋白的濃度有關(guān)。研究表明，低濃度牛乳鐵蛋白(0.1～1 g/L)能阻斷NF-κB活化，進(jìn)而減少IL-8分泌，顯示出抗炎效應(yīng)；而高濃度乳鐵蛋白(10 g/L)則表現(xiàn)出促炎效應(yīng)，上調(diào)NF-κB的表達(dá)[27]。有研究采用0.1、1、10 g/L的牛乳鐵蛋白分別處理豬腸上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛乳鐵蛋白濃度為0.1 g/L時，NF-κB的表達(dá)基本不變；濃度為1～10 g/L時才會導(dǎo)致NF-κB活化，且10 g/L牛乳鐵蛋白的激活速度要快于1 g/L[28, 29]。由此說明，乳鐵蛋白上調(diào)或下調(diào)NF-κB的表達(dá)是具有濃度依賴效應(yīng)的。此外，乳鐵蛋白上調(diào)和下調(diào)NF-κB表達(dá)的作用也可能與其亞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞特性及生理狀況有關(guān)。乳鐵蛋白具有不同的亞結(jié)構(gòu)，如碳水化合物鏈[7]和N端肽段[8]，可能對NF-κB的表達(dá)具有不同的調(diào)節(jié)效應(yīng)。而不同類型的細(xì)胞，因其生物學(xué)特性和生理情況不同，對乳鐵蛋白的作用也呈現(xiàn)出不同的反應(yīng)。關(guān)于不同生理情況下何種亞結(jié)構(gòu)對NF-κB表達(dá)的調(diào)節(jié)占主導(dǎo)地位，亟待研究。

綜上所述，乳鐵蛋白和NF-κB在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)。以NF-κB為節(jié)點(diǎn)，多種不同的信號通路相互溝通交聯(lián)，不同物種、不同濃度的乳鐵蛋白作用于不同的細(xì)胞，可通過不同的通路上調(diào)或下調(diào)NF-κB表達(dá)。關(guān)于乳鐵蛋白對NF-κB的促進(jìn)和抑制作用分別在何種情況下占主導(dǎo)地位以及深層次的調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(201510610114)；四川省科技支撐計劃生物骨材料開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究項目(2014SZ0019)。

孟姝(E-mail： dreamingsue@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.037

R341

A

1002-266X(2016)48-0106-04

2016-06-04)