分子生物學(xué)方法在鑒定雙歧桿菌中的應(yīng)用

田亮，盧勉飛，蔡芷荷，吳清平，李艷嫦，李興

（1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東廣州510663）

分子生物學(xué)方法在鑒定雙歧桿菌中的應(yīng)用

田亮1，盧勉飛1，蔡芷荷1，吳清平2，*，李艷嫦1，李興1

（1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州510663；2.廣東省微生物研究所，廣東廣州510663）

依靠傳統(tǒng)生理生化、菌落表觀形態(tài)等鑒定雙歧桿菌，很難區(qū)分生化相近的菌株，例如雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌或者動(dòng)物雙歧桿菌和乳酸雙歧桿菌，這給食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和衛(wèi)生監(jiān)督帶來(lái)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)方法的成熟，大量分子生物學(xué)方法成為了鑒定雙歧桿菌種屬高效的鑒定方法，這些分子生物學(xué)方法包括16SrRNA基因序列、小分子保守序列hsp60、多重PCR、核糖體DNA序列擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析（ARDRA）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）以及能夠?qū)悠分须p歧桿菌進(jìn)行鑒別和定量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。本文對(duì)分子生物學(xué)方法在鑒定雙歧桿菌的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

雙歧桿菌；hsp60；鑒定；序列

有研究表明，在不同年齡段人群的腸道中，分布有不同種屬雙歧桿菌。嬰幼兒時(shí)期，正常菌群中雙歧桿菌主要是兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriabifidum），長(zhǎng)雙歧桿菌（B.longum），嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）和短雙歧桿菌（B.breve）［1］。在成人時(shí)期，雙歧桿菌的組成演變?yōu)榍啻弘p歧桿菌（B.adolescentis），長(zhǎng)雙歧桿菌（B.longum），兩歧雙歧桿菌（B.bifidum），鏈狀雙歧桿菌（B.catenulatum）以及星狀雙歧桿菌（B.pseudocatenulatum）［2］。雙歧桿菌作為益生菌，可以改善人體的多種生理功能，提高機(jī)體的免疫能力以及調(diào)節(jié)人體正常菌群［3］。因此，市場(chǎng)上的益生菌產(chǎn)品越來(lái)越多，質(zhì)量參差不齊，對(duì)這些益生菌產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)需要快速、高效的鑒定方法。

雙歧桿菌的鑒定主要是通過(guò)菌落形態(tài)、糖類發(fā)酵反應(yīng)以及測(cè)定酶活等進(jìn)行。但是這些經(jīng)典的傳統(tǒng)鑒定方法耗時(shí)，費(fèi)力，不能區(qū)分種屬關(guān)系親近的種，尤其是益生菌產(chǎn)品中含有嬰兒雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌或者動(dòng)物雙歧桿菌和乳雙歧桿菌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟應(yīng)用，分子生物學(xué)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)：鑒定快速，結(jié)果準(zhǔn)確等［4］。本文對(duì)這些分子生物學(xué)方法進(jìn)行了綜述。

1多重PCR（MultiplexPCR）方法在鑒定雙歧桿菌種的應(yīng)用

普通PCR一般只有1對(duì)引物進(jìn)行核酸序列的擴(kuò)增，而多重PCR采用了多對(duì)引物進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增，可以同時(shí)鑒定多個(gè)細(xì)菌的種屬關(guān)系以及多個(gè)基因型等。

進(jìn)行多重PCR操作要注意一下幾點(diǎn)：第一，所有引物的退火溫度在同一個(gè)范圍內(nèi)；第二，引物之間不能產(chǎn)生交叉反應(yīng)；第三，不同大小的PCR產(chǎn)物片段可以區(qū)分細(xì)菌的種屬關(guān)系；第四，多重PCR需要的Taq酶的量比普通的PCR需要的酶量大。

多重PCR的引物一般是基于16S rRNA、23S rRNA的內(nèi)部保守間隔序列［5］。Dong等設(shè)計(jì)了5對(duì)雙歧桿菌種水平的特異性引物，這5對(duì)引物分別是兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的16SrRNA基因序列特異性不同結(jié)合位點(diǎn)的序列。研究結(jié)果表明，這5對(duì)引物能夠從種水平上區(qū)分人腸道的兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌［6］。Bonjoch等基于16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)了齒雙歧桿菌（B.dentium）和青春雙歧桿菌特異性鑒定引物。Bonjoch等首先利用lm26和lm3引物鑒定雙歧桿菌屬，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物利用種特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，從22份人源生活污水分別檢出青春雙歧桿菌和齒雙歧桿菌的鑒定率為100%和77.2%。該研究指出多重PCR方法的檢測(cè)限為10 cfu/mL［7］。

2小分子基因保守序列在鑒定雙歧桿菌中的應(yīng)用

隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)了更多的保守基因序列尤其是編碼蛋白質(zhì)的基因序列用于對(duì)未知微生物的鑒定。Stenico等指出利用小分子基因保守序列對(duì)雙歧桿菌屬進(jìn)行分類鑒定，鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性甚至比依靠16S rRNA基因序列鑒定的準(zhǔn)確性高，該研究組將小分子擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合，建立了利用小分子鑒定雙歧桿菌的新方法［8］。在鑒定雙歧桿菌屬時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)編碼蛋白質(zhì)的基因序列：ldh（L-lactate deshydrogenase gene）、recA、hsp60、丙酮酸激酶基因（Pyruvate kinase gene，pk）存在高度保守區(qū)域，根據(jù)這些高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行序列擴(kuò)增并測(cè)序，通過(guò)基因序列比對(duì)對(duì)未知雙歧桿菌進(jìn)行鑒定［9］。研究人員研究了用recA和ldh鑒定已經(jīng)添加在商業(yè)化產(chǎn)品中的人源雙歧桿菌：兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、短雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌和從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離的雙歧桿菌，研究發(fā)現(xiàn)在分析ldh基因的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌DSM 10140和動(dòng)物雙歧桿菌ATCC27536的ldh基因具有很高的相似性，但是ldh基因在乳雙歧桿菌DSM 10140和動(dòng)物雙歧桿菌ATCC25527T之間保持了一定差異［10］。Vaugien等指出丙酮酸激酶基因能夠鑒定區(qū)分嬰兒雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌，也能夠區(qū)分動(dòng)物雙歧桿菌和乳酸雙歧桿菌［11］。Jian等研究指出了hsp60基因序列能夠鑒定人源所有雙歧桿菌屬［8］，鏈狀雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌（B. pseudocatenulatum）之間hsp60基因序列的相似性為93%，長(zhǎng)雙歧桿菌，嬰兒雙歧桿菌和豬雙歧桿菌（B.suis）之間hsp60基因序列的相似性為98%，動(dòng)物雙歧桿菌和乳酸雙歧桿菌hsp60基因序列的相似性為98%。因此，由于hsp60的高度保守性和特異性，hsp60基因在構(gòu)建雙歧桿菌分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)方面比16S rRNA基因序列構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)更具有優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，利用克隆擴(kuò)增小分子特異性序列進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建分子進(jìn)化發(fā)育樹(shù)鑒定人源雙歧桿菌是比利用16S rRNA基因序列更具有優(yōu)勢(shì)。

3ARDRA技術(shù)在鑒定雙歧桿菌中的應(yīng)用

ARDRA（Amplified ribosomal DNA restriction analysis）技術(shù)也稱之為核糖體DNA序列擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析，該技術(shù)是新一代對(duì)未知微生物進(jìn)行鑒定的技術(shù)，主要是利用rDNA序列的保守性，對(duì)rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，酶切，依據(jù)得到的酶切圖譜對(duì)種屬的多樣性分析。該技術(shù)的具體步驟是細(xì)菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，并提取DNA序列，利用PCR技術(shù)對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行局部或者整個(gè)片段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切圖譜［11］。不同種屬的細(xì)菌有不同的酶切圖譜，每個(gè)種屬細(xì)菌的酶切圖譜都有特異性。因此，利用多種限制性內(nèi)切酶的圖譜可以鑒定種屬關(guān)系更近的種［12］。Roy and Sirois為了鑒定動(dòng)物雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和青春雙歧桿菌，擴(kuò)增了16S rRNA基因的部分片段，大小為914 bp，然后利用限制性內(nèi)切酶：BamHI，Sau3AI和TaqI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，分析酶切圖譜。該研究指出，長(zhǎng)雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌除了限制性內(nèi)切酶Sau3A1酶切圖譜有不同，其它酶切圖譜基本一致。Ventura擴(kuò)增了16S rRNA基因序列之后，用BamHI和Sau3AI酶切，酶切圖譜也證實(shí)了Roy and Sirois的研究。Ventura研究指出，鏈狀雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌也可以用BamHI and Sau3AI酶切圖譜進(jìn)行鑒定。Venema and Maathuis擴(kuò)增了目前已知的人源性的14種雙歧桿菌以及動(dòng)物雙歧桿菌和乳雙歧桿菌的16S rRNA基因序列片段，片段大小為511 bp到525 bp不等，擴(kuò)增產(chǎn)物利用6個(gè)限制性內(nèi)切酶：TaqI，Sau3AI，RsaI，AluI，Sau96I和NciI對(duì)擴(kuò)增的16S rRNA基因序列片段進(jìn)行酶切，每種雙歧桿菌的酶切圖譜都呈現(xiàn)了種屬特異性［13］。因此，ARDRA技術(shù)是鑒定人源性雙歧桿菌方法中一種較為可靠的方法。

4變性梯度凝膠電泳技術(shù)在鑒定雙歧桿菌方面的應(yīng)用

20世紀(jì)80年代，Lerman等發(fā)明了變性梯度凝膠電泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），主要是用于研究DNA序列序列片段中堿基發(fā)生變異，由于該技術(shù)靈敏度高，多用于研究DNA序列片段的點(diǎn)突變［14］。該技術(shù)多用于遺傳病、癌癥等的篩查以及微生物分子生態(tài)學(xué)研究。變性梯度凝膠的基本分離原理是在聚丙烯酰胺凝膠中加入了尿素、甲酰胺等變性劑梯度，根據(jù)不同的DNA序列片段的熔解溫度不同實(shí)現(xiàn)DNA序列片段的分離。最先解鏈的DNA序列片段在凝膠電泳中遷移速率會(huì)變慢。當(dāng)變形劑的濃度升高時(shí)，其它解鏈區(qū)DNA序列雙鏈開(kāi)始解鏈。不同的DNA序列雙鏈由于其堿基序列不同，其解鏈性質(zhì)也不一樣，在凝膠電泳時(shí)其遷移速率也不一樣。

Satokari等在2001年基于雙歧桿菌的16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)了種屬特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE，成功的對(duì)人糞便中雙歧桿菌的群落特征進(jìn)行了研究［15］。Requena等對(duì)16SrDNA序列的V2-V3區(qū)域進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，成功的區(qū)分了動(dòng)物雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、假鏈狀雙歧桿菌和短雙歧桿菌［16］。PCR-DGGE技術(shù)利用特異性引物進(jìn)行PCR序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE和測(cè)序，這種方法能夠快速的鑒定和篩選益生菌商品中益生菌的菌落構(gòu)成。

5PFGE技術(shù)在鑒定雙歧桿菌種的應(yīng)用

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis）主要是用來(lái)分離大分子DNA序列片段的。普通的瓊脂糖凝膠電泳只能對(duì)小分子DNA序列片段進(jìn)行分離，對(duì)于大于10 kb的DNA序列片段由于其遷移速率基本一致，不能區(qū)分大分子量的DNA序列條帶。在脈沖場(chǎng)電泳中，電場(chǎng)不斷在兩個(gè)不同的方向上改變，帶負(fù)電荷的DNA序列片段向負(fù)極遷移。較小分子量DNA序列片段在電場(chǎng)改變時(shí)很容易產(chǎn)生方向的改變，而較大分量的DNA序列方向轉(zhuǎn)換較慢，其泳動(dòng)速率也逐漸變慢，因此，不同分子量的DNA序列分子可以分開(kāi)。

在鑒定雙歧桿菌的應(yīng)用中，脈沖場(chǎng)凝膠電泳重復(fù)性好，能夠很好的將雙歧桿菌各個(gè)種屬區(qū)分［17］。脈沖場(chǎng)凝膠電泳和其它的分子生物學(xué)方法相比，脈沖場(chǎng)凝膠電泳花費(fèi)時(shí)間，另外需要提取完整的基因組DNA序列。從含有益生菌的食品中分離雙歧桿菌并提取了基因組DNA序列，用限制性內(nèi)切酶Xbal和Spel進(jìn)行消化進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，最后分析脈沖場(chǎng)凝膠圖譜。在益生菌中樣品中含有兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌等多種雙歧桿菌，利用PFGE的方法可以提高鑒定正確率［18］。

6實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用和發(fā)展

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是鑒定或者定量檢測(cè)微生物的高效快速的方法，而且其靈敏度比普通的PCR要高，每次PCR循環(huán)完成之后，熒光劑就對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的量進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用內(nèi)參或者外參為對(duì)照，對(duì)PCR過(guò)程或者擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)數(shù)學(xué)模型，確定PCR初始模板量。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中經(jīng)常使用的熒光物質(zhì)為熒光定量染料SYBR Green和熒光探針Taqman。

在熒光染料檢測(cè)循環(huán)過(guò)程中，DNA序列片段經(jīng)歷熱變性，在退火的過(guò)程中，在DNA序列聚合酶的作用下引物開(kāi)始進(jìn)行延伸，SYBR Green此時(shí)結(jié)合在DNA序列雙鏈之間，受激發(fā)后產(chǎn)生熒光。Monique Haarman利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)喂食益生元嬰兒的糞便進(jìn)行雙歧桿菌生物群落構(gòu)成研究并進(jìn)行了定量分析［19-20］。

熒光探針的特異性要比熒光定量染料的特異性高，而且熒光探針可以進(jìn)行多重反應(yīng)。熒光探針的特異性受到GC含量，溶解溫度和探針長(zhǎng)度的影響。Taqman探針類實(shí)時(shí)熒光定量PCR在設(shè)計(jì)探針時(shí)，在探針的3’端標(biāo)記了熒光淬滅基團(tuán)，在探針的5’端標(biāo)記了熒光基團(tuán)。由于完整的探針帶有熒光淬滅基團(tuán)，因此，探針沒(méi)有熒光，當(dāng)3’端淬滅基團(tuán)被內(nèi)切酶消化后，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)分離，在激光的激發(fā)下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光。探針的DNA序列序列是與目的片段的DNA序列序列互補(bǔ)，然后由于Taq酶具有5’-3’外切酶的作用，探針段裂，激光激發(fā)產(chǎn)生熒光。Yang等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增了人體分離的雙歧桿菌的耐酸性相關(guān)的RNA序列，保證了序列的精準(zhǔn)度，研究發(fā)現(xiàn)耐酸性雙歧桿菌可以通過(guò)基因修飾等策略提高菌株的耐酸性［21］。

隨著定量PCR技術(shù)的發(fā)展，不段發(fā)現(xiàn)新的熒光物質(zhì)：分子信標(biāo)探針和Scorpions引物。分子信標(biāo)是DNA序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，一端帶有熒光基團(tuán)，另外一端帶有熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)單鏈DNA序列為發(fā)卡結(jié)構(gòu)時(shí)，兩種基團(tuán)距離較近，產(chǎn)生熒光信號(hào)能量共振轉(zhuǎn)移。當(dāng)達(dá)到熔解溫度時(shí)，DNA序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)消失，熒光信號(hào)能量共振轉(zhuǎn)移隨著消失，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。分子信標(biāo)方法的靈敏度比探針型的高，目前主要用于臨床檢驗(yàn)基因的點(diǎn)突變、胚胎性別等。

Scorpions引物是既含有引物，又結(jié)合了熒光探針。在正常情況下，熒光探針形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離較近不能產(chǎn)生熒光，而在變性階段，發(fā)卡結(jié)構(gòu)消失，在聚合酶的作用下，與模板結(jié)合后進(jìn)行延伸，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度比上述的熒光物質(zhì)都高，因此，具有良好的應(yīng)用前景。

7展望

由于雙歧桿菌的益生作用，長(zhǎng)雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短型雙歧桿菌等已經(jīng)應(yīng)用在大量的產(chǎn)品：酸奶、奶粉、冰激凌以及臨床上治療嬰幼兒消化不良的藥物中。對(duì)這些產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)，需要快速、高效的鑒定方法，分子生物學(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)這些檢測(cè)的要求。

目前大規(guī)模應(yīng)用的分子生物學(xué)方法都是基于16S rRNA基因保守序列對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行鑒定，這些方法的靈敏度和特異性比較高，然而不能對(duì)樣品或者益生菌產(chǎn)品中的雙歧桿菌定量檢測(cè)［22］。PFGE方法是基于基因組經(jīng)過(guò)限制性酶切之后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)不同種屬雙歧桿菌的電泳圖譜不同對(duì)未知雙歧桿菌進(jìn)行鑒定，但是這種鑒定方法的特異性較差，利用PFGE方法區(qū)分鑒定嬰兒雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌具有一定的難度。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR既能夠?qū)σ嫔a(chǎn)品或者樣品中含有的雙歧桿菌種屬鑒定，又能定量檢測(cè)雙歧桿菌［23-24］，在未來(lái)鑒定和篩選雙歧桿菌的方面能夠發(fā)揮更大的作用。

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Application of Molecular Biology Methods in Identification of Bifidobacterium

TIAN Liang1，LU Mian-fei1，CAI Zhi-he1，WU Qing-ping2，*，LI Yan-chang1，LI Xing1
（1.Guangdong Huankai Microbial Sci.&Tech.Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，Guangdong，China；2.Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

It is difficult to identify similar bifidobacteria of biochemical characteristics based on physiological and biochemical property，phenotypic patterns，such as distinction between Bifidobacterium longum and Bifidobacterium infantis or Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium lactisis.There are a lot of molecular methods to identify Bifidobacterium sp.including 16SrRNA，hsp60，multiplex PCR，amplified ribosomal DNA restriction analysis（ARDRA），denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE），and pulsed-field gel elec trophoresis（PFGE）.Real-time PCR or Q-PCR which will be soon an interesting tool for the detection，identification and quantification of Bifidobacteria spp.In this review，molecular methods for the detection，identification and quantification of Bifidobacteria sp.are outlined.

Bifidobacteria；hsp60；detection；sequence

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.049

2016-01-20

廣東省科技項(xiàng)目（2012A070500033）

田亮（1984—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

吳清平（1962—），男，研究員，博士，研究方向：食品微生物。