胡春偉(鄭州市第一人民醫(yī)院藥劑科，鄭州　450001)

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高效液相色譜法同時(shí)測定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及代謝產(chǎn)物含量

胡春偉*(鄭州市第一人民醫(yī)院藥劑科，鄭州450001)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.01.018

摘要目的: 建立高效液相色譜法測定大鼠肝微粒體中咪達(dá)唑侖及1-OH咪達(dá)唑侖的含量。 方法：色譜柱為COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34)，流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為220 nm。結(jié)果：咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖線性范圍分別是1.0～64.0 μm(r=0.999 2)和0.125～8.0 μm(r=0.999 4)，呈良好的線性關(guān)系。咪達(dá)唑侖的批內(nèi)、批間精密度為3.7%～11.2%和4.2%～13.1%，提取回收率為(91.46±9.03)%～(94.54±7.62)%；1-OH咪達(dá)唑侖的批內(nèi)、批間精密度為5.9%～10.4%和7.7%～12.3%，提取回收率為(92.27±8.11)%～(95.16±5.72)%。咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖在室溫保存8 h、反復(fù)凍融3次和-20 ℃保存1周含量穩(wěn)定，與新鮮樣品比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：本法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可同時(shí)測定大鼠肝微粒體中咪達(dá)唑侖及1-OH咪達(dá)唑侖的濃度。

關(guān)鍵詞咪達(dá)唑侖； 1-OH咪達(dá)唑侖； 高效液相色譜法

Simultaneous Determination of Content of Midazolam and Its Metabolite in Liver Microsome by HPLC

HU Chunwei(Dept.of Pharmacy, the First People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450001, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a HPLC method for content determination of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome. METHODS: The column was COSMOSIL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)with the mobile phase of methanol-acetonitrile-water (V∶V∶V=55∶11∶34) at flow rate of 1.0 ml/min. The temperature was 25 ℃, and the detection wavelength was at 220 nm. RESULTS: The liner range of midazolam and 1-OH midazolam were respectively 1.0～64.0 μm(r=0.999 2) and 0.125～8.0 μm(r=0.999 4). The RSD range of intra-precision and inter-precision of midazolam were respectively 3.7%～11.2% and 4.2%～13.1%, and the average extraction recoveries were (91.46±9.03)%～(94.54±7.62)%, meanwhile, the RSD range of intra-precision and inter-precision of 1-OH midazolam were respectively 5.9%～10.4% and 7.7%～12.3%, and the average extraction recoveries were (92.27±8.11)%～(95.16±5.72)%. The tests for the stability showed that there is no significantly difference between midazolam and 1-OH midazolam during the storage at room temperature for 8 hours, Freeze-thaw cycles for 3 times and stored at -20 ℃ for 1 week(P>0.05). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate and repeatable, and can be used for the simultaneous concentration determination of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome.

KEYWORDSMidazolam; 1-OH midazolam; HPLC

咪達(dá)唑侖為短效苯二氮卓類藥物，在臨床上廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)麻醉、鎮(zhèn)靜和控制癲癇持續(xù)狀態(tài)[1]。CPY3A是肝藥酶家族中含量最為豐富的一個(gè)亞家族，咪達(dá)唑侖是美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)推薦進(jìn)行CYP3A體外、體內(nèi)研究的探針?biāo)幬颷4-6]。咪達(dá)唑侖在體內(nèi)主要代謝為1-OH咪達(dá)唑侖，并且其代謝速度可以反映出CYP3A的活性。文獻(xiàn)報(bào)道測定咪達(dá)唑侖的方法包括高效液相-紫外檢測法(HPLC-UV)、液-質(zhì)聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GS-MS)等[7-10]。盡管質(zhì)譜檢測器具有靈敏度較高、所需樣品體積小等優(yōu)點(diǎn)，但是由于其使用及維護(hù)價(jià)格較為昂貴，導(dǎo)致其在臨床和實(shí)驗(yàn)室研究過程中應(yīng)用受到局限。目前報(bào)道的檢測咪達(dá)唑侖HPLC-UV中，大多數(shù)存在靈敏度低、保留時(shí)間長和使用流動(dòng)相價(jià)格較貴等缺點(diǎn)。為此，本試驗(yàn)建立了同時(shí)檢測肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物1-OH咪達(dá)唑侖濃度的HPLC-UV檢測法，為CYP3A代謝藥物研究提供了一種快速簡便、準(zhǔn)確可靠的方法。

1材料

1.1儀器

島津LC-2010A高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；SPA-10AVP UV/VIS檢測器；LC-Solution工作站；Biofuge Stratos型低溫高速離心機(jī)(Heraeus，德國)；XW-80A型旋渦混合器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠)；BP121S電子分析天平(Sartorious，德國)。

1.2藥品與試劑

咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：20141008)；1-OH咪達(dá)唑侖(cerilliant analylical reference standards，批號：FN-31309-01)；甲醇、乙腈(色譜純)；天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；水為純化水；其他試劑均為國產(chǎn)。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由河南省中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：0008906。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

COSMOSIL C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相∶甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34)；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：220 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備：在具塞塑料離心管中加入磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)，咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液，肝微粒體蛋白重懸液(0.25 mg/L),使之成為200 μl體系。渦旋均勻后，加入乙腈終止反應(yīng)，渦旋2 min，15 000 g冷凍離心10 min，取上清液20 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2.2.2方法學(xué)考察：(1)專屬性:將空白肝微粒體、一定濃度的咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液和一定濃度的1-OH咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液，按照“2.2”項(xiàng)下處理方法，進(jìn)樣，記錄色譜圖。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:在具塞離心管中分別依次精密加入咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液和1-OH咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液適量，氮?dú)獯蹈桑偌尤肓姿猁}緩沖液，體系同“2.2”，渦旋混合均勻后，配成含咪達(dá)唑侖1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μm和1-OH咪達(dá)唑侖0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μm的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的樣品體系，按照“2.2”項(xiàng)下處理方法，對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積(A)。以樣品中待測物質(zhì)的濃度C為橫坐標(biāo)，以樣品峰面積A為縱坐標(biāo)做線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3精密度試驗(yàn)

在具塞離心管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，分別配制成咪達(dá)唑侖的終濃度為2.0、16.0、64.0 μm，1-OH咪達(dá)唑侖的終濃度為0.25、2.0、8.0 μm的待測樣品各5份，按照“2.2”項(xiàng)下處理方法，對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積(A)。測得體系中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的精密度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的濃度。1 d內(nèi)對高、中、低濃度樣品分析5次，得到批內(nèi)精密度，連續(xù)3 d測定3個(gè)分析批，得到批間精密度。

2.4回收率試驗(yàn)

在具塞離心管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，分別配制成咪達(dá)唑侖的終濃度為2.0、16.0、64.0 μm，1-OH咪達(dá)唑侖的終濃度為0.25、2.0、8.0 μm的待測樣品各5份，按照“2.2”項(xiàng)下處理方法，對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積(A)，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察樣品的回收率。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

在具塞離心管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，分別配制成咪達(dá)唑侖的終濃度為2.0、16.0、64.0 μm，1-OH咪達(dá)唑侖的終濃度為0.25、2.0、8.0 μm的待測樣品各5份，分別置室溫8 h、反復(fù)凍融3次和-20 ℃保存7 d條件下，按照“2.2”項(xiàng)下處理方法，對樣品進(jìn)行處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積(A)，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察樣品的穩(wěn)定性。

2.6專屬性試驗(yàn)

在選定“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，1-OH咪達(dá)唑侖和咪達(dá)唑侖峰型尖銳，分離完全，大鼠肝微粒體中無內(nèi)源性物質(zhì)和雜質(zhì)干擾。咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的保留時(shí)間分別為9.6 min 和7.1 min，見圖1。

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線

取空白肝微粒體重懸液配制成含咪達(dá)唑侖1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μm和含有1-OH咪達(dá)唑侖0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μm的系列濃度樣品和的系列濃度樣品，按照“2.2”項(xiàng)下處理并測定，原始數(shù)據(jù)見表1~2。以峰面積A對肝微粒體中相應(yīng)的咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖濃度做線性回歸，咪達(dá)唑侖在1.0～64.0 μm之間線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=0.0137X-0.077 (r=0.999 2)，1-OH咪達(dá)唑侖在0.125～8.0 μm之間線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=0.0135X+0.0339(r=0.999 4)。

表1　肝微粒體中系列濃度咪達(dá)唑侖與峰面積

表2　肝微粒體中系列濃度1-OH咪達(dá)唑侖與峰面積

2.8精密度試驗(yàn)結(jié)果

測得咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的低、中、高3個(gè)濃度的批內(nèi)、批間差結(jié)果見表3，結(jié)果顯示，二者批內(nèi)、批間RSD﹤15.0%。

2.9回收率試驗(yàn)結(jié)果

測得咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖的提取回收率結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，二者的低、中、高濃度的提取回收率，均符合生物樣品測定要求。

2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)

測得肝微粒體中1-OH咪達(dá)唑侖和咪達(dá)唑侖的低、中、高濃度室溫保存8 h、反復(fù)凍融3次、-20 ℃下保存1周的結(jié)果見表5。結(jié)果經(jīng)過配對t檢驗(yàn)顯示，上述處理組的樣品和新鮮配制的待測樣品比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合血漿中生物樣品穩(wěn)定性的測定要求。

(A) 空白肝微粒體 (B) 含咪達(dá)唑侖肝微粒體 (C) 含1-OH咪達(dá)唑侖肝微粒體(A) blank liver mircosome (B) liver mircosome with midazolam (C)liver mircosome with 1-OH midazolam圖1　大鼠肝微粒體中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖HPLC色譜圖Fig 1　HPLC chromatograms of midazolam and 1-OH midazolam in rat liver mircosome

樣品濃度/μm批內(nèi)精密度批間精密度x±sRSD/%x±sRSD/%咪達(dá)唑侖2.02.11±0.2211.22.03±0.2613.116.015.8±1.076.715.6±1.267.964.064.68±2.573.763.63±2.694.21-OH咪達(dá)唑侖0.250.26±0.0210.40.26±0.0211.12.01.94±0.178.91.93±0.2412.38.08.05±0.475.97.92±0.617.7

表4　肝微粒體中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖提取回收率結(jié)果

表5　肝微粒體中咪達(dá)唑侖和1-OH咪達(dá)唑侖穩(wěn)定性結(jié)果

3討論

咪達(dá)唑侖在體內(nèi)外的代謝速率可以作為大鼠和人體肝CYP3A活性的重要指標(biāo)之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，測定咪達(dá)唑侖的方法中，往往僅能檢測出咪達(dá)唑侖，而不能對其代謝產(chǎn)物1-OH咪達(dá)唑侖進(jìn)行定量[11-13]，本研究建立了一個(gè)在大鼠肝微粒體中同時(shí)檢測該2種物質(zhì)的方法。咪達(dá)唑侖在生物樣品中的提取多采用甲苯、氯仿、乙酸乙酯和乙醚萃取的方法，萃取法提取回收率低，并且所使用的甲苯、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑具有毒性，對人體危害較大；乙酸乙酯不易揮發(fā)，萃取操作時(shí)間較長。本研究采用在反應(yīng)體系中加入乙腈直接沉淀蛋白的方法，離心后直接進(jìn)樣，有機(jī)溶劑暴露時(shí)間短，不用萃取，操作簡便，色譜峰雜質(zhì)干擾少，回收率高。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，咪達(dá)唑侖的保留時(shí)間較長[13]，本文考察了甲醇、乙腈和水作為不同比例作為流動(dòng)相對分離測定的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇∶乙腈∶水(V∶V∶V=55∶11∶34)時(shí)，1-OH咪達(dá)唑侖和咪達(dá)唑侖保留時(shí)間短，分離度好。

本研究建立的方法可同時(shí)檢測大鼠肝微粒體中的咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物1-OH咪達(dá)唑侖的含量，其專屬性、線性范圍、精密度、回收率和穩(wěn)定性均符合生物樣品的分析要求，為研究大鼠和人體肝CYP3A的代謝提供了一個(gè)高效、簡便、快捷的方法。

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(收稿日期：2015-09-07)

中圖分類號R927.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1672-2124(2016)01-0042-04

*副主任藥師。研究方向：婦科臨床用藥指導(dǎo)。E-mail:Tofkj@126.com