馮子懿

（鄭州市第一中學 河南鄭州 45000）

TNF-α誘導人類成纖維細胞DNA損傷及衰老的機制研究

馮子懿

（鄭州市第一中學 河南鄭州 45000）

目的：本文主要通過實驗探討TNF-α誘導人類成纖維細胞DNA損傷及衰老的相關機制。方法：本次研究在某院小兒外科手術過程中選取部分正常皮膚組織，處理之后，對其成纖維細胞采取TNF-α進行誘導，觀察比較經(jīng)過TNF-α短時間和長時間處理后，成纖維細胞的SA-β-gal以及DNA發(fā)生的變化。結果：經(jīng)過TNF-α3天內(nèi)的短時間處理，成纖維細胞的SA-β-gal以及DNA變化不明顯，處理時間延長到6天以后，成纖維細胞的SA-β-gal以及DNA變化明顯，具有統(tǒng)計學意義。結論：本次研究結果表明，成纖維細胞經(jīng)過TNF-α6天以上的時間處理后，SA-β-gal陽性細胞數(shù)量明顯增多，γ-H2AX陽性細胞比例數(shù)明顯增多，γ-H2AX蛋白的水平在明顯升高。說明TNF-α作為一種特殊的炎癥因子，具有促進細胞增殖和腫瘤壞死、誘導細胞凋亡等作用。

TNF-α 成纖維細胞 DNA損傷 衰老

引起細胞衰老有很多因素，如：癌基因誘導、DNA損傷、端?？s短、炎癥因子等，從客觀方面看，細胞衰老可以分為早衰和復制衰老兩種類型，在TNF-α推動作用下產(chǎn)生的衰老則屬于早衰類型。本文主要通過實驗探討TNF-α誘導人類成纖維細胞DNA損傷及衰老的相關機制，結果比較滿意，現(xiàn)報告如下。

1.試驗材料

1.1 細胞系

本次研究從醫(yī)院部分患者的正常皮膚組織中選取成纖維細胞，進行原代培養(yǎng)，并從細胞庫中獲取正常人的成骨肉瘤細胞系。

1.2 實驗材料

P3 8促分裂原活化蛋白激酶抑制劑，用二甲基亞砜配制成10mM的濃儲，分裝后，在零下20攝氏度環(huán)境下避光保存；TNF-α，用無菌生理鹽水配制成0.1毫克的濃儲，分裝后，在零下80攝氏度環(huán)境下保存［1］。

細胞培養(yǎng)所需試劑：二甲基亞砜、乙二胺四乙酸、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基等［2］。

Western blotting所需試劑和耗材：Western一抗稀釋液、Western一抗二抗去除液、Western細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Western熒光檢測ECL發(fā)光液、Prestrained protein ladder、蛋白酶抑制劑、Tween-20、醫(yī)用X光膠片、定影液粉末、顯影液、PVDF膜、甘氨酸、Tris、甲醇、SDS、鹽酸胍等［3］。

1.3 實驗方法

選取部分兒科手術患者，爭取其家屬同意之后，在小兒患者手術過程中獲取皮膚組織，使用含有一定劑量青霉素的生理鹽水進行5次左右的清洗，只留取有用的真皮層，取出皮膚的表皮組織和皮下的脂肪組織。將真皮層剪碎，加入一定劑量的膠原酶I，將二氧化碳培養(yǎng)箱溫度調整到37攝氏度，進行大約6小時的消化。然后加入一定劑量的1xDMEM培養(yǎng)基中和，保證培養(yǎng)基均勻之后，進行過濾和離心，排出上清。使用1xDMEM培養(yǎng)基沉淀，并放入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，等到細胞貼壁之后換液，細胞長滿之后進行傳代。細胞傳代之后，按序進行細胞凍存、細胞復蘇、細胞計數(shù)等，在對細胞進行藥物處理［4］。

2.結果

2.1 成纖維細胞經(jīng)過TNF-α長時間處理后誘發(fā)其衰老

臨床研究表明，TNF-α會促進內(nèi)皮和上皮細胞的衰老，但是不確定TNF-α是否會對成纖維細胞的衰老起到促進和推動作用。本次研究使用10納克的TNF-α對成纖維細胞進行處理，檢測SA-βgal染色并計數(shù)。臨床檢測SA-β-gal的操作比較容易，并且檢測結果的可信度較高，所以是目前我國檢測衰老和老化細胞最常用的生物學指標之一。本次研究結果表明，成纖維細胞經(jīng)過TNF-α24小時、3天短時間的處理之后，SA-β-gal陽性細胞數(shù)目沒有明顯增多的跡象，但是當處理時間延長到6天以后，SA-β-gal陽性細胞數(shù)目明顯增多，升高到5.98%±0.69%，處理9天之后，SA-β-gal陽性細胞數(shù)目增加到14.93%±2.64%，所以SA-β-gal處理3天以內(nèi)、6天、9天的陽性細胞數(shù)目增加情況具有明顯的差異，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義，TNF-α要想引起成纖維細胞發(fā)生衰老，必須要經(jīng)過長時間的處理。

2.2 成纖維細胞經(jīng)過TNF-α長時間的處理會導致成纖維細胞的DNA損傷

目前，已經(jīng)確定DNA損傷也會導致細胞衰老，原因是DNA損傷之后，會激活p16INK4a/pRb通路和p53/p21Cipl通路。本次研究為了證明TNF-α不僅會促進成纖維細胞的衰老，還會導致其DNA造成損傷。成纖維細胞經(jīng)過TNF-α處理之后，其γ-H2AX的具體表達情況就可以證明該成纖維細胞的DNA是否發(fā)生損傷。成纖維細胞DNA一旦發(fā)生雙鏈斷裂，其H2AX第139位絲氨酸就會發(fā)生磷酸化反應，從而形成一種γ-H2AX物質。這種物質會迅速傳導出DNA被損傷的信號，從而使下游信號通路被激活，引發(fā)生物級聯(lián)發(fā)硬。免疫熒光實驗結果表明，使用10納克的TNF-α處理成纖維細胞24小時之后，幾乎檢測不到γ-H2AX的表達，說明經(jīng)過10納克TNF-α短時間的處理，并不會對成纖維細胞的DNA造成明顯的損傷。當TNF-α處理時間延長到6小時以后，就可以很明顯的找到γ-H2AX陽性信號，并且計數(shù)結果表明γ-H2AX陽性細胞的數(shù)量越來越多，已經(jīng)增加到9.78%±1.17%。使用Western blotting檢測γ-H2AX蛋白水平的表達時，可以清楚的發(fā)現(xiàn)，使用TNF-α短時間的處理成纖維細胞，其γ-H2AX水平?jīng)]有明顯的變化，但是延長處理時間之后，就可以發(fā)現(xiàn)γ-H2AX蛋白水平在持續(xù)升高，與此同時，還可以發(fā)現(xiàn)這種γ-H2AX蛋白水平的升高具有一定的依賴性。這個發(fā)現(xiàn)表面，TNF-α長時間的處理成纖維細胞之后，成纖維細胞的DNA也會發(fā)生損傷，成纖維細胞的DNA損傷時間和SA-β-gal陽性細胞數(shù)目明顯增加時間基本相同，所以也可以認為成纖維細胞在TNF-α作用下發(fā)生的衰老也與其DNA損傷有一定的關系。

2.3 p38/MAPK抑制劑有助于延緩TNF-α誘導成纖維細胞衰老

成纖維細胞經(jīng)過TNF-α處理之后，其p38/MAPK就會被激活。本次研究使用SB203580對成纖維細胞進行處理，證明激活p38/ MAPK也會對TNF-α促進成纖維細胞衰老產(chǎn)生一定的作用。p38/ MAPK抑制劑就是SB203580，這種抑制劑不是直接對p38/MAPK本身的磷酸化反應進行抑制，而是通過對p38/MAPK下游靶蛋白的磷酸化反應進行選擇性抑制，從而阻斷p38/MAPK通路信號的傳導。本次研究使用濃度為10uM的SB203580對成纖維細胞進行一個半小時的預處理，然后觀察在不同的TNF-α處理時間，SA-β-gal陽性染色的實際情況。研究結果表明，成纖維細胞經(jīng)過SB203580預處理之后，相對而言，TNF-α誘導成纖維細胞衰老情況有所減弱，尤其是在處理時間延長到6天以后，SA-β-gal陽性細胞數(shù)目已經(jīng)降低到1.95%±0.86%，而沒有SB203580抑制劑作用下，SA-β-gal陽性細胞數(shù)目為5.98%±0.60%。將處理時間延長到9天以后，SA-β-gal陽性細胞數(shù)目已經(jīng)降低到6.89%±1.1%，而沒有SB203580抑制劑作用下，SA-β-gal陽性細胞數(shù)目為13.93%±1.6%，差異具有統(tǒng)計學意義。

3.討論

細胞一旦發(fā)生開始衰老，就不會再恢復到衰老前的狀態(tài)，細胞衰老之后，隨意代謝功能基本正常，但是隨著衰老時間的延長，細胞的增值能力也會越來越弱，最后死亡［5］。引起細胞衰老有很多因素，如：癌基因誘導、DNA損傷、端?？s短、炎癥因子等，其中，炎癥因子是調節(jié)細胞生理活性方面起著非常重要的作用，隨著炎癥微環(huán)境研究范圍的擴大，炎癥因子也稱為目前備受關注的研究熱點，而本次研究的TNF-α就是一種重要的炎癥細胞因子。本次研究結果表明，TNF-α誘導成纖維細胞衰老的同時，也會誘導其DNA損傷，但是需要較長的時間，并且兩者在時間上基本吻合，說明TNF-α誘導成纖維細胞衰老可能和成纖維細胞的DNA損傷有一定的關系［6］。由于本次研究時間較短，所以沒有對成纖維細胞中ROS水平的變化進行細致的研究，所以不清楚TNF-α導致成纖維細胞DNA損傷的原因是否是由ROS所引起，還需要進一步的實驗驗證。

［1］田莉，王獻華，馬小兵，趙靜.TNF-α介導的NF-κB信號通路在肺纖維化中的作用［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011，02：361-363+365.

［2］李侃，李建華，曹冬妮，蘇筠霞，劉天喜，王榮珍. 促紅細胞生成素對TNF-α誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響［J］. 重慶醫(yī)科大學學報，2011，11：1325-1329.

［3］沈雁，嚴世蕓. 強心飲對腫瘤壞死因子α誘導的大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原合成以及激活蛋白1 mRNA表達的影響［J］. 中西醫(yī)結合學報，2008，09：946-951.

［4］姚鵬，詹軼群，許望翔，李長燕，楊曉明，胡大榮. 放線菌素D/TNF-α誘導大鼠肝干細胞凋亡及HGF的拮抗作用［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2003，05：33-37.

［5］于晨輝，杜仲燕，高佳，王偉茜，竇曉兵. 4-HNE通過抑制TNF-α介導的NF-κB活化誘導酒精性肝損傷［J］.中國病理生理雜志，2013，06：1046-1052.

［6］劉海鷗，沈愛國，錢佶，秦婧，陳夢玲，程純. LPS和TNF-α對血管內(nèi)皮細胞SSeCKS的表達影響［J］.中國免疫學雜志，2007，07：580-585+589.

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1674-2060（2016）01-0011-02