石慶新　呂小萍　於青峰　楊陽(yáng)

[摘要] 目的 探討鹽酸小檗堿和亞胺培南聯(lián)合作用對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CPA）體外抗菌活性的影響。方法 實(shí)驗(yàn)采用肉湯稀釋法測(cè)定鹽酸小檗堿和亞胺培南耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌最小抑菌濃度（MIC）；采用棋盤稀釋法測(cè)定鹽酸小檗堿聯(lián)合亞胺培南對(duì)CPA的MIC，并計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（FIC）。 結(jié)果 鹽酸小檗堿和亞胺培南對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌MIC的算術(shù)均數(shù)分為268.80 μg/mL和8.93 μg/mL。用亞胺培南與鹽酸小檗堿聯(lián)合作用后，鹽酸小檗堿與亞胺培南MIC的算術(shù)均數(shù)分別降至8.16 μg/mL和4.50 μg/mL。兩種藥物聯(lián)合使用對(duì)6.7%的60株CPA有協(xié)同的抗菌作用，對(duì)88.3%CPA呈現(xiàn)相加作用，對(duì)5.0%CPA呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用，無(wú)拮抗作用。 結(jié)論 鹽酸小檗堿和亞胺培南聯(lián)合作用可以增加兩者對(duì)CPA抗菌作用的敏感性。

[關(guān)鍵詞] 鹽酸小檗堿；銅綠假單胞菌；協(xié)同作用；碳青霉烯酶；亞胺培南

[中圖分類號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）01-0114-04

銅綠假單胞菌是常見的條件致病菌，也是醫(yī)院院內(nèi)感染的重要致病菌[1]，常引起呼吸道感染、敗血癥、傷口感染、尿路感染等，近年來(lái)其分離率和耐藥率都不斷的呈上升趨勢(shì)[2]。根據(jù)2013年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉稀類的耐藥率達(dá)到25%以上，且出現(xiàn)了廣泛耐藥菌株[3]。銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物耐藥形勢(shì)非常嚴(yán)峻，給臨床治療帶來(lái)了難題。

鹽酸小渠堿是中藥黃連提取物，也是一種生物堿，《中國(guó)藥典》記載黃連和鹽酸小檗堿具有抗菌消炎等藥理作用[4]。有關(guān)鹽酸小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌作用研究很少。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)鹽酸小檗堿和亞胺培南的體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)兩種藥物的聯(lián)合用藥的抗菌效果。為臨床治療耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌“超級(jí)細(xì)菌” 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 在2014年1月1日～2015年12月31日期間，從臺(tái)州恩澤醫(yī)院和臺(tái)州路橋醫(yī)院住院患者中各分離40株和60株CPA（剔除重復(fù)分離菌株）。100株臨床菌株通過(guò)法國(guó)梅里埃VITEK2-CompactT檢測(cè)，然后通過(guò)Hodge實(shí)驗(yàn)[5]確認(rèn)篩選出耐碳?xì)涿赶╊愩~綠假單胞菌60株。質(zhì)控菌株27853購(gòu)于中國(guó)衛(wèi)生部臨檢中心。

1.1.2 抗菌藥物 鹽酸小檗堿分析標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)為160528，純度98%，規(guī)格1 g/支；亞胺培南批號(hào)為160421，純度98%，規(guī)格5 g/支，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 實(shí)驗(yàn)前將所有保存菌種經(jīng)復(fù)融、轉(zhuǎn)種、分離培養(yǎng)，在同一平板上取性狀相似1～2個(gè)菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基內(nèi)10～12 h。再用 RPMI1640液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)菌LB培養(yǎng)液使其密度為2～6×108 CFU/L 菌懸液備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)再將備用菌懸液用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到100倍，最終密度為2～6×106 CFU/L接種菌懸液。

1.2.2 藥物濃度的配制 先用無(wú)菌蒸餾水把鹽酸小檗堿和亞胺培南干粉堿分別配成2048 μg/mL和256 μg/mL的原液。NCCLS抗生素藥敏微量稀釋原理：鹽酸小檗堿起始濃度為2048 μg/ml，第1孔的濃度為2048 μg/mL，然后再用RPMI1640液稀釋對(duì)藥物進(jìn)行倍比稀釋，稀釋到第10管孔濃度為2 μg/mL，得到的鹽酸小檗堿的濃度范圍在2～1024 μg/mL之間。亞胺培南起始濃度為256 μg/mL，用同樣的方法稀釋最終得到亞胺培南的濃度范圍在0.125～128 μg/mL之間。

1.2.3 鹽酸小檗堿和亞胺培南單獨(dú)藥敏試驗(yàn) 根據(jù)NCCLS微量倍比稀釋原理在96孔的V型檢測(cè)板加入藥敏原液并稀釋至第10孔為最低檢測(cè)濃度的2倍，然后再第1孔至第11孔加入50 μL稀釋好的菌懸液，使最終每孔菌液濃度為l×105 CFU/mL，第11孔為不加細(xì)菌的對(duì)照孔，第12孔為空白對(duì)照孔。然后混勻加蓋置37℃孵育箱，18～24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 鹽酸小檗堿交叉聯(lián)合抗真菌藥物藥敏試驗(yàn) 采用棋盤微量稀釋法檢測(cè)藥物的聯(lián)合作用，采用9個(gè)稀釋度，藥物最高濃度為其MIC的4倍，依次倍比稀釋為1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256倍濃度，兩種藥物稀釋分別在96孔培養(yǎng)板上按橫和縱兩列進(jìn)行聯(lián)合[7]。接種菌量為1×105 CFU/mL，銅綠假單胞菌分別于37℃孵育18～24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。用部分抑菌濃度指數(shù)（FIC）作為評(píng)價(jià)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)效果。

1.2.5 FIC的計(jì)算及判定標(biāo)準(zhǔn)[6] FIC=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用結(jié)果判斷：①FIC指數(shù)≤0.5判定甲乙兩藥為協(xié)同作用；②0.52判定甲乙兩藥為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 單藥作用

鹽酸小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌MIC范圍為256～512 μg/mL，MIC幾何均值為265.02 μg/mL；亞胺培南對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌MIC范圍為8～32 μg/mL MIC幾何均值為8.57 μg/mL。

2.2 聯(lián)合用藥

兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)，鹽酸小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌MIC減至為2～32 μg/mL；亞胺培南對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌MIC減至為2～16 μg/mL見表1。兩種藥物對(duì)6.7%的耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌有協(xié)同的抗菌作用，88.3%耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌呈現(xiàn)相加作用，對(duì)5.0%耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用，無(wú)拮抗作用，見表1。

2.3 亞胺培南與鹽酸小檗堿單獨(dú)使用和聯(lián)合使用情況下MIC比較

亞胺培南單獨(dú)使用和其與鹽酸小檗堿聯(lián)合使用時(shí)MIC值的比較采用t檢驗(yàn)，兩者存在顯著性差異（t=15.11，P=0.00<0.01）。同樣鹽酸小檗堿單獨(dú)使用和其與亞胺培南聯(lián)合使用時(shí)的MIC值比較，存在顯著性差異（t=36.18，P=0.00<0.01）。見表2。

3 討論

銅綠假單胞菌是革蘭陰性非發(fā)酵菌，存在正常人的皮膚、腸道和呼吸道等部位。隨著抗生素不合理使用及廣泛使用，銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物耐藥率也不斷上升，對(duì)多種耐藥甚至幾乎全部抗生素耐藥，這給治療銅綠假單胞菌所致感染帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，使其成為所謂的“超級(jí)細(xì)菌”[8]。本課題從中西藥聯(lián)合使用的角度探索治療耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌方法。

從結(jié)果來(lái)看，用微量稀釋法檢測(cè)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的MIC均值為8.93 μg/mL，此結(jié)果與儀器法檢測(cè)的MIC范圍是一致，其判斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)[9]。中藥提取物鹽酸小檗堿對(duì)耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌也具有抗菌作用，單獨(dú)使用時(shí)其MIC的濃度為268.80 μg/mL。這個(gè)濃度比Sun Y等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高?？赡苁且?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)組選擇的菌株耐藥性與他們實(shí)驗(yàn)組不同；他們實(shí)驗(yàn)的菌株是普通銅綠假單胞菌，而我們組選擇的菌株全都是耐碳青霉烯的銅綠假單胞菌。目前本文認(rèn)為銅綠假單胞菌耐碳?xì)涿赶╊悪C(jī)制有以下幾點(diǎn)：（1）產(chǎn)金屬酶，其可以水解碳?xì)涿赶╊惡退笑?內(nèi)酰胺類抗生素，并且不被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制[11]，通過(guò)染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因，主要在銅綠假單胞菌和其他非發(fā)酵菌之間傳播。其基因分型分為GIM型1、VIM、 SPM、IMP等，在我國(guó)臨床分離的耐藥菌株以VIM、IMP基因型為主[12，13]。（2）藥物作用靶位的改變：β-內(nèi)胺類抗菌藥物與細(xì)菌細(xì)胞膜上特定靶位相結(jié)合后，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖分子合成，導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡。在對(duì)臨床分離亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌株中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥性與青霉素結(jié)合蛋白的改變關(guān)系密切，與細(xì)胞膜通透性改變呈協(xié)同作用[14]。（3）外排系統(tǒng)耐藥是外膜蛋白形成了主動(dòng)外排系統(tǒng)，開口于外膜的復(fù)合物，可以直接使藥物泵出到細(xì)菌體外。當(dāng)其表達(dá)增高時(shí)導(dǎo)致耐藥，目前發(fā)現(xiàn)7種主動(dòng)外排系統(tǒng)，均屬于RND家族，Mexab-OprM是在銅綠假單胞菌中最先發(fā)現(xiàn)RND家族外排系統(tǒng)，其作用的底物廣泛，最有臨床意義的藥物外排系統(tǒng)[15]。（4）膜的通透性降低：銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜就有分子篩作用，阻止抗菌藥物進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。大多數(shù)抗菌藥物根據(jù)分子量的大小通過(guò)膜孔蛋白通道進(jìn)入到細(xì)胞。銅綠假單胞菌中與碳青霉碳青霉烯類藥物相關(guān)的膜孔蛋白少，OprD是目前研究發(fā)現(xiàn)引起碳青霉烯類抗生素耐藥膜孔蛋白。OprD膜孔蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一[11]。如果臨床分離到耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌，通常對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類、氨基糖苷類類等藥物呈現(xiàn)協(xié)同耐藥[16]，臨床醫(yī)生對(duì)此束手無(wú)策，到無(wú)藥可用的境地，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡率增高，就需要尋找新的治療藥物和新的治療方案。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明兩種藥物聯(lián)合使用的情況下，亞胺培南的藥物濃度平均降低原來(lái)的一半，鹽酸小檗堿的藥物濃度從268.80 μg/mL平均降到8.16 μg/mL，根據(jù)檢驗(yàn)的結(jié)果兩藥聯(lián)合使用與兩藥單獨(dú)使用存在顯著性差異，西藥亞胺培南和中藥鹽酸小檗堿聯(lián)合使用對(duì)95%的耐藥菌株具有較理想的抑菌效果；能夠增強(qiáng)彼此的抗菌能力。在譚黎明等[17]研究中說(shuō)明黃連提取物分別與氨芐西林和頭孢他啶聯(lián)合使用可以降低病人血液培養(yǎng)陽(yáng)性率；黃連提取物可以提高氨芐青霉素和頭孢菌素治療大鼠銅綠假單胞菌感染的療效。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相一致，鹽酸小渠堿與藥物合用可以提高藥物的療效，與單用抗生素組比較，差異有顯著性（P<0.01）。同樣在丁彩云等[18]的頭孢哌酮舒巴坦與小檗堿合用治療福氏志賀菌痢疾50例研究中也說(shuō)明這一觀點(diǎn)，頭孢哌酮舒巴坦與鹽酸小檗堿合用治療有效率為100%，顯著高于單用頭孢哌酮舒巴坦的70%。鹽酸小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌或者殺菌機(jī)制是通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性[19]，當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，抗菌藥物就比較容易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，抗菌效能增加，藥物MIC就會(huì)降低。碳青霉烯類藥物和鹽酸小檗堿合用時(shí)，其MIC也會(huì)降低，與本實(shí)驗(yàn)相符。

綜上，鹽酸小檗堿與亞胺培南聯(lián)合使用抑制銅綠假單胞菌的能力明顯高于單獨(dú)使用鹽酸小檗堿或亞胺培南藥物。為臨床治療耐碳青霉烯銅綠假單胞菌提供理論依據(jù)。鹽酸小檗堿除了增加細(xì)胞膜的通透性以外，可能存在其他的抗菌機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（收稿日期：2016-10-21）