張跡 袁巧云

（淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室 江蘇淮安 223300）

綠色熒光蛋白在微生物發(fā)酵工程實驗教學(xué)中的應(yīng)用

張跡 袁巧云

（淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室 江蘇淮安 223300）

在微生物發(fā)酵工程實驗教學(xué)過程中，將綠色熒光蛋白基因gfp構(gòu)建到大腸桿菌表達系統(tǒng)中，并以綠色熒光蛋白GFP為目標產(chǎn)品，進行微生物發(fā)酵及下游工程的蛋白純化實驗教學(xué)，取得了較好的教學(xué)效果。

綠色熒光蛋白 發(fā)酵 蛋白純化 實驗教學(xué)

引言

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一類存在于海洋腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白［1］。綠色熒光蛋白對生物體無毒無害，不需要任何外源性底物和輔助因子，分子量小，方便構(gòu)建載體，在多種生物體中均可穩(wěn)定表達并易于觀察和檢測［2，3］。其作為一種新型標記物，在生命科學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域的研究中被廣泛應(yīng)用［4］。此外，由于其具有直觀和易于檢測等優(yōu)勢，在生物學(xué)相關(guān)專業(yè)實驗教學(xué)中也得到了較好的應(yīng)用［5，6］。

微生物發(fā)酵及其產(chǎn)品蛋白分離純化是生物工程專業(yè)本科實驗教學(xué)中重要的實驗項目之一。通過該實驗教學(xué)，向同學(xué)們介紹和展示了微生物發(fā)酵及其下游工程較為完整的原理和操作流程。為了讓同學(xué)們能夠直觀地看到目標蛋白在微生物發(fā)酵及其下游分離純化過程中的去向，幫助其深刻理解和掌握微生物發(fā)酵及其下游工程的原理和操作步驟，我們以綠色熒光蛋白GFP為目標產(chǎn)品蛋白開展了該實驗的教學(xué)工作，取得了較為理想的教學(xué)效果。

1　實驗原理

大腸桿菌表達系統(tǒng)是非常成熟且常用的原核表達系統(tǒng)，pET系列表達載體是大腸桿菌表達系統(tǒng)中常用的表達載體，該載體上的乳糖操縱子原件可以通過誘導(dǎo)物IPTG對其下游目的基因進行誘導(dǎo)表達，實現(xiàn)在發(fā)酵過程中菌株生長階段細胞長得好，表達階段產(chǎn)品蛋白產(chǎn)量高的目的。

表達的產(chǎn)物蛋白上含有6*組氨酸標簽時，該標簽在低鹽環(huán)境下可以和鎳特異性結(jié)合，在高鹽環(huán)境下該特異性結(jié)合被解除，含該標簽的蛋白會被洗脫下來。因此6*組氨酸標簽可用于重組蛋白的親和層析純化。在重組表達載體構(gòu)建時，刪除了目的基因的終止密碼子，表達載體外源基因多克隆位點下游緊接著6個組氨酸的密碼子，所以實現(xiàn)了目的基因和6*His標簽的重組表達，表達的目標蛋白上含有一個6*組氨酸標簽可用于鎳柱的親和層析純化。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一類存在于海洋腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。綠色熒光蛋白對生物體無毒無害，不需要任何外源性底物和輔助因子。過量表達GFP蛋白的菌株細胞離心后再普通日光下即可看到明顯的綠色熒光，GFP在蛋白溶液中在普通日光下也可看到明顯的綠色熒光。在GFP表達和純化過程中能夠清晰直觀地看到其是否正確表達及其在每個純化步驟中的去向。

2　實驗材料和試劑

2.1菌株和質(zhì)粒

E.coli BL21（DE3）：大腸桿菌BL21（DE3）菌株基因組上整合了識別噬菌體T7啟動子的RNA聚合酶基因，可以識別pET系列表達載體上的T7啟動子，實現(xiàn)其下游目的基因的誘導(dǎo)表達，為本微生物發(fā)酵實驗中的表達宿主菌株。該菌株為本教研室保存。

pET29a-gfp：重組表達載體pET29a-gfp為本教研室在之前的實驗教學(xué)過程中構(gòu)建［6］，用于表達含6*His標簽的重組蛋白GFP，保存在E.coli DH5α菌株中。

2.2培養(yǎng)基和試劑

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，去離子水1000 mL（固體加1.5%的瓊脂），121℃，30min高壓蒸汽滅菌備用。

卡那霉素：配制50mg/ml母液，過濾除菌分裝，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

IPTG溶液（0.8 mol/L）：將1 g IPTG溶于4 mL水中，定溶到5 mL，過濾除菌分裝，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

鎳柱（1ml）：商品Ni-IDA1ml填充到微量層析柱中。

酶純化緩沖液：

結(jié)合緩沖液：20mM Na3PO3，500mM NaCl，20mM imidazole，pH7.8。

洗滌緩沖液：20mM Na3PO3，500mM NaCl，50mM imidazole，pH6.0。

我們知道，人的牙齒和舌頭的感覺非常精細，是容不下半點“沙子”的，它們之所以能夠協(xié)調(diào)，在口腔內(nèi)重復(fù)進行著機械性活動，是因為它們有著自己運行的軌道，維持著口腔功能的正常運轉(zhuǎn)。一旦口腔內(nèi)出現(xiàn)任何異常，就可能會破壞口腔內(nèi)的平衡，可能會發(fā)生咬傷。

洗脫緩沖液：20mM Na3PO3，500mM NaCl，200mM imidazole，pH6.0。

上述試劑中蛋白胨和酵母粉購自O(shè)XID，卡那霉素和IPTG購自上海生工，鎳柱填料Ni-IDA購自徐州溥博生物科技有限公司公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

3　實驗方案

3.1GFP重組表達菌株構(gòu)建及搖瓶發(fā)酵

參照文獻［7］提取質(zhì)粒pET29a-gfp，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株感受態(tài)細胞，涂布含50mg/L卡那霉素LB平板，37℃過夜培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子接種入含有終濃度為50mg/L卡那霉素的100ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液濃度OD600≈1。加入終濃度1mg/L的IPTG繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～3小時。收集發(fā)酵液于4℃，6000g，5min離心收集菌體備用。

3.2重組蛋白GFP親和層析純化

用結(jié)合緩沖液洗滌回收的重組表達菌株細胞兩次，30ml結(jié)合緩沖液重懸菌體，在冰水保護下超聲波破碎細胞懸液，4℃，12000g，10min離心，轉(zhuǎn)移上清至干凈的容器中。加3倍鎳柱體積的結(jié)合緩沖液流經(jīng)鎳柱。將含有可溶性重組蛋白的上清液加入到含Ni-IDA親和層析柱中，輕輕混勻后4℃靜置數(shù)分鐘，使目標重組蛋白與親和填料充分結(jié)合，打開控制閥流出樣品殘液。用4倍體積的洗滌緩沖液流經(jīng)柱體，洗滌未結(jié)合的雜蛋白。用適量的洗脫緩沖液流經(jīng)柱體，洗脫目標重組蛋白，用干凈的離心管接住洗脫溶液。鎳柱回收：過量的洗脫緩沖液過鎳柱，再用結(jié)合緩沖液平衡鎳柱，于4℃冰箱中保存。

4　實驗結(jié)果與分析

4.1GFP重組表達菌株的構(gòu)建

4.2重組蛋白GFP搖瓶發(fā)酵

將構(gòu)建好的GFP重組表達菌株接種入100ml液體LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50mg/L的卡那霉素，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)。待搖瓶中發(fā)酵液濃度OD600≈1時，加入終濃度1mg/L的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～3小時，誘導(dǎo)GFP表達。發(fā)酵液經(jīng)離心后看到菌體細胞沉淀呈現(xiàn)綠色，表明在該搖瓶發(fā)酵過程中，宿主菌株細胞生長狀況良好，且綠色熒光蛋白GFP亦在IPTG的誘導(dǎo)下實現(xiàn)了正確的功能表達。

4.3重組蛋白GFP的親和層析純化

發(fā)酵液離心后，棄去上清液。用結(jié)合緩沖液洗滌菌體沉淀兩次，然后將菌體沉淀重懸于30ml結(jié)合緩沖中，并在冰水混合物的保護下進行超聲波破碎。發(fā)酵液經(jīng)超聲破碎后呈現(xiàn)澄清透明的綠色溶液，表明目標蛋白GFP已從菌體細胞中釋放了出來并溶解在緩沖溶液中。混合液經(jīng)4℃，12000g，10min離心去除菌體細胞殘片后得到干凈澄清的含有目標蛋白GFP的混合溶液。

將含有可溶性目標蛋白GFP的混合溶液加入平衡過的鎳柱，輕輕混勻，靜置數(shù)分鐘，此時鎳柱呈亮綠色，而之前綠色的混合溶液則變成了無色溶液，可見目標蛋白GFP已經(jīng)結(jié)合到鎳柱上了。打開控制閥流出樣品殘液，并用4倍柱體積的洗滌緩沖液流經(jīng)柱體，洗滌未結(jié)合的雜蛋白，在此過程中流下來溶液始終呈現(xiàn)無色。最后用適量的洗脫緩沖液流經(jīng)柱體，并用干凈的離心管接住滴下來的綠色溶液，此時鎳柱上的綠色也逐漸的褪去，表明GFP已經(jīng)被洗脫了下來并得到了純化的目標重組蛋白GFP溶液。

5　討論

微生物發(fā)酵工程相關(guān)實驗是高校生物類專業(yè)尤其是生物工程專業(yè)本科實驗教學(xué)中重要的教學(xué)內(nèi)容之一。通常把發(fā)酵菌株構(gòu)建，然后進行搖瓶發(fā)酵及小型發(fā)酵罐發(fā)酵，再結(jié)合分離純化等微生物發(fā)酵下游工程，作為較完整的綜合性大實驗，來學(xué)習微生物發(fā)酵工程的基本操作技術(shù)和實驗原理。受課時及經(jīng)費等多種因素的限制，為達到較好的教學(xué)效果，就要求實驗過程要省時、高效且結(jié)果直觀。

綠色熒光蛋白GFP在大腸桿菌中大量表達，其發(fā)酵液離心后的菌體沉淀在普通的光照下就可激發(fā)出明顯的綠色。從本文的實驗結(jié)果可以看出GFP在大腸桿菌中的功能表達非常直觀，使其成為微生物發(fā)酵實驗教學(xué)過程中極好產(chǎn)品指示蛋白。因此在本實驗教學(xué)過程中采用GFP為發(fā)酵目標蛋白，過程和結(jié)果均非常直觀，無需進一步驗證，利于同學(xué)們理解和掌握。

由于課時及經(jīng)費有限，一般在實驗教學(xué)進行到用SDS-PAGE檢測到蛋白表達了就算成功，而無力購買抗體進行Western blot以確認所獲得蛋白是否正確，更不能確認所獲得的蛋白是否具有正確的生物活性，為實驗教學(xué)遺留下了疑問。將綠色熒光蛋白GFP重組表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21菌株中，構(gòu)建成GFP原核表達菌株并進行搖瓶發(fā)酵，其發(fā)酵液離心后的菌體沉淀在日光下可激發(fā)出明顯的綠色。無需SDS-PAGE檢測，以及Western blot和生物活性驗證。在發(fā)酵菌體超聲波破碎和目標蛋白親和層析純化過程中，GFP在不同的溶液中均能激發(fā)出明顯的綠色，能夠?qū)崟r指示目標蛋白在整個分離純化階段每一個步驟中的去向。在有限的教學(xué)時間內(nèi)即可讓同學(xué)們直觀地看到產(chǎn)品蛋白的發(fā)酵和分離純化過程，利于同學(xué)們理解和掌握微生物發(fā)酵及其下游分離純化工程的原理和操作流程。

本文所建立的GFP原核表達菌株的構(gòu)建，搖瓶發(fā)酵及其親和層析純化的教學(xué)方案，既進行了完整的微生物發(fā)酵及其下游分離純化工程的實驗操作，又避免了一些耗時且昂貴的檢測和驗證過程，還可以直觀地看到整個實驗過程和正確的實驗結(jié)果，利于同學(xué)們理解和掌握，不給實驗教學(xué)留下疑問。因此，本教學(xué)方案是高校本科生物類專業(yè)微生物發(fā)酵相關(guān)實驗課程的一個非常好的教學(xué)方案。

［1］吳沛橋，巴曉革，胡海，等.綠色熒光蛋白GFP的研究進展及應(yīng)用［J］.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2009，28（1）：83-86.

［2］汪恒英，周守標，常志州，等.綠色熒光蛋白（GFP）研究進展［J］.生物技術(shù)，2004，14（3）：70-73.

［3］吳瑞，張樹珍.綠色熒光蛋白及其在植物分子生物學(xué)中的應(yīng)用［J］.分子植物育種，2005，3（2）：240-244.

［4］朱昀，李朝煒.綠色熒光蛋白［J］.生物學(xué)教學(xué)，2010，35（6）：62.

［5］楊獻光，馬克學(xué).“綠色熒光蛋白（GFP）液壓轉(zhuǎn)基因”的實驗教學(xué)探索［J］.生物學(xué)通報，2011，46（6）：22-23.

［6］張跡，袁巧云.綠色熒光蛋白在生物類本科專業(yè)實驗教學(xué)中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)世界，2016，第4期.

［7］張跡，李智，張宇，袁巧云.一步法制備大腸桿菌BL21（DE3）菌株感受態(tài)細胞及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016.

G64

A

1674-2060（2016）05-0252-02

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（項目批準號：31300099）。

張跡（1982—），男，江蘇宿遷人， 博士，講師，主要從事微生物學(xué)及環(huán)境科學(xué)等相關(guān)課程和方向的教學(xué)和研究工作。