汪　燕,　羅水忠,　蔡　靜,　鐘昔陽,　姜紹通,　鄭　志

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥　230009; 2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽 合肥　230009)

?

茂原鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

汪燕1,2,羅水忠1,2,蔡靜1,2,鐘昔陽1,2,姜紹通1,2,鄭志1,2

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥230009; 2.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室,安徽 合肥230009)

摘要:文章考察了不同培養(yǎng)基成分對茂原鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的影響,以酶活和生物量為測定指標(biāo),采用單因素試驗和正交試驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基最適成分及其質(zhì)量濃度，以期為未來菌株擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵中試化提供參考。試驗結(jié)果表明,優(yōu)化后的培養(yǎng)基為:葡萄糖40 g/L,蛋白胨40 g/L,硝酸銨1 g/L,酵母膏2 g/L,硫酸鎂2 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L。該條件下酶活可達(dá)(1.30±0.07) U/mL,生物量為(9.69±0.23) g/L。

關(guān)鍵詞:茂原鏈霉菌;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶;發(fā)酵培養(yǎng)基;正交試驗

0引言

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase,EC.2.3.2.13,TG酶),又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,可以催化蛋白質(zhì)賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-酰胺基結(jié)合,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)(或多肽分子)之間發(fā)生共價交聯(lián),形成相應(yīng)的聚合產(chǎn)物[1]。

TG酶有著“21世紀(jì)超級黏合劑”的美稱,在食品加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。它可以改善肉制品的質(zhì)構(gòu),提高原料的利用率[2-3];增加乳制品的凝膠強(qiáng)度,減少脂肪含量[4-5];生產(chǎn)可食性薄膜,利于食品的包裝和貯藏[6-7]等。這些優(yōu)越的特性使得TG酶成為近年來研究的熱點,同時獲得高產(chǎn)量高酶活的TG酶也成為研究的關(guān)鍵。目前,研究主要集中于誘變育種篩選高效產(chǎn)酶菌株[8-9]、菌株發(fā)酵條件優(yōu)化[10-11]、發(fā)酵酶液分離純化[12-13]和通過基因工程技術(shù)對現(xiàn)有的微生物進(jìn)行基因改造[14-15]等。

微生物發(fā)酵法是工業(yè)上生產(chǎn)TG酶的主要方法,微生物代謝產(chǎn)酶的能力,除受菌株自身特性影響外,還受發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度[16]、搖床轉(zhuǎn)速等諸多客觀因素的影響[17]。文獻(xiàn)[18-19]報道對鏈霉菌HS-1進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化,酶活分別提高了16.04%和16.40%,因此,優(yōu)化菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件對產(chǎn)物質(zhì)量濃度、產(chǎn)量和產(chǎn)率具有重要的意義。本文通過單因素試驗和正交試驗對茂原鏈霉菌產(chǎn)TG酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化,為TG酶的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

茂原鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)為合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院選育。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面保存培養(yǎng)基:可溶性淀粉 20 g/L,KNO31 g/L,MgSO4·7H2O、K2HPO4·H2O、NaCl均為0.5 g/L,FeSO4·H2O 0.01 g/L,瓊脂20 g/L,pH值為7.2～7.4。

液體種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉和蛋白胨各為20 g/L,酵母膏、MgSO4、K2HPO4均為2 g/L,pH值為7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉和蛋白胨各為30 g/L,酵母膏、NH4(SO4)2、MgSO4、K2HPO4均為2 g/L,pH值為7.0。

1.1.3主要試劑

N-α-CBZ-Gln-Gly和L-谷氨酸-γ-單羥肟酸，美國Sigma公司;還原型谷胱甘肽，北京索萊寶科技有限公司;其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)方法

液體種子的培養(yǎng)方法為:用接種環(huán)挑取少許生長良好的菌種置于新鮮斜面培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。經(jīng)活化后的菌種再接入種子培養(yǎng)基中,30 ℃,170 r/min,培養(yǎng)48 h。

搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)方法為：初始pH值為7.0,250 mL三角瓶裝液量25 mL,接種量10% (體積分?jǐn)?shù)),30 ℃、170 r/min培養(yǎng)72 h。

1.2.2培養(yǎng)基優(yōu)化試驗設(shè)計

分別考察發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳源及其質(zhì)量濃度(可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘油)、不同有機(jī)氮源及其質(zhì)量濃度(胰蛋白胨、魚粉蛋白凍、酪蛋白、蛋白胨、玉米漿)、不同無機(jī)氮源及其質(zhì)量濃度(硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉)對茂原鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)TG酶的影響。根據(jù)單因素試驗確定的培養(yǎng)基成分及其質(zhì)量濃度范圍,設(shè)計三因素三水平正交試驗。試驗因素水平見表1所列。

表1　正交試驗因素水平　g/L

1.2.3測定方法

(1) TG酶活的測定。按Grossowicz比色法[20]測定酶活:反應(yīng)液A由0.2 mol/L Tris-HCl(pH=6.0)、0.1 mol/L鹽酸羥胺、0.01 mol/L還原型谷胱甘肽和0.03 mol/L N-α-CBZ-Gln-Gly組成,終止液B由3 mol/L鹽酸、12% 三氯乙酸、5% 六水三氯化鐵(溶解于0.1 mol/L鹽酸中)3種試劑等體積混合而成。樣品測定時,取200 μL酶液加入1 mL試劑A于37 ℃反應(yīng)10 min后,加入1 mL試劑B終止反應(yīng),4 ℃、7 000 r/min離心10 min后在525 nm處比色。對照組為200 μL樣品先加試劑終止液B后于37 ℃反應(yīng)10 min,再加試劑A,其他操作相同。1單位TG酶活性定義為:37 ℃條件下反應(yīng),每1 min生成1 μmol 的單羥肟酸所需的酶量，單位為U/mL。

(2) 菌體生物量(DCW)的測定。事先稱好過濾用的定量濾紙,將發(fā)酵液過濾后,用蒸餾水洗滌菌體3次,105 ℃干燥至恒質(zhì)量。在干燥器中降至室溫后稱質(zhì)量,菌體生物量為2次濾紙質(zhì)量差,單位為g/L。

1.3數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1碳源種類對發(fā)酵的影響

不同碳源種類對發(fā)酵的影響如圖1所示。

碳源在微生物生長和代謝過程中有著舉足輕重的作用,是提供細(xì)胞生命活動所需能量和合成產(chǎn)物的碳架[21]。由圖1可知,不同碳源條件下培養(yǎng)茂原鏈霉菌產(chǎn)TG酶,其酶活和菌體生長差別較大。葡萄糖作為碳源時,酶活和生物量均為最大,分別為(0.86±0.01)U/mL和(8.11±0.11) g/L。因此,選擇適宜的碳源為葡萄糖。

圖1　不同碳源種類對發(fā)酵的影響

2.2碳源添加量對發(fā)酵的影響

不同葡萄糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響如圖2所示。

圖2　不同葡萄糖質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響

由圖2可知,TG酶活和生物量隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為40 g/L時酶活達(dá)到最大，為(0.91±0.03)U/mL,此時生物量為(8.72±0.46)g/L。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 g/L時,酶活急劇下降而生物量也幾乎沒有增加,說明過多的碳源并不利于菌株產(chǎn)酶和生長,也可能是TG酶的合成受碳源分解代謝物阻遏效應(yīng)的影響[22]。因此,選擇葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L。

2.3有機(jī)氮源種類對發(fā)酵的影響

不同有機(jī)氮源種類對發(fā)酵的影響如圖3所示。

氮源是微生物生長和發(fā)酵的重要營養(yǎng)來源,微生物利用它在細(xì)胞內(nèi)合成氨基酸和堿基,進(jìn)而合成蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞成分以及含氮的代謝產(chǎn)物[23]。同時,氮源也是合成TG酶的主要底物。由圖3可知,產(chǎn)酶最適有機(jī)氮源為蛋白胨,該條件下,酶活可達(dá)(0.96±0.04)U/mL,此時生物量為(10.25±0.20)g/L;其次是玉米漿,為(0.86±0.04)U/mL和(8.93±0.28)g/L。而酪蛋白幾乎不能起到促進(jìn)產(chǎn)酶的作用,酶活僅為(0.15±0.05)U/mL,生物量為(8.45±0.23)g/L。因此,選擇蛋白胨為有機(jī)氮源。

圖3　不同有機(jī)氮源種類對發(fā)酵的影響

2.4有機(jī)氮源添加量對發(fā)酵的影響

有機(jī)氮源添加量對發(fā)酵的影響如圖4所示。

圖4　不同蛋白胨質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響

由圖4可知,蛋白胨質(zhì)量濃度從 10 g/L增加到40 g/L時,酶活約增大了1倍。當(dāng)質(zhì)量濃度為40 g/L時酶活達(dá)到最大值,為(0.99±0.10)U/mL,生物量為(10.12±0.65)g/L。質(zhì)量濃度再增加到 50 g/L時,生長量與酶活均有明顯的下降。這可能是因為一方面氮源偏多,會使微生物細(xì)胞早期生長過于旺盛,導(dǎo)致菌體提前衰老自溶[24];另一方面是培養(yǎng)基中過量存在的蛋白胨類或游離氨基酸、小肽等在該酶的作用下共價交聯(lián)形成了聚合體,從而對菌體的物質(zhì)吸收利用和代謝生長產(chǎn)生有害作用,影響了酶的生產(chǎn)[18]。因此,選擇蛋白胨質(zhì)量濃度為40 g/L。

2.5無機(jī)氮源種類對發(fā)酵的影響

無機(jī)氮源種類對發(fā)酵的影響如圖5所示。

無機(jī)氮源是速效氮源,可以被細(xì)胞吸收后直接利用,有利于菌株前期的生長，而較高的酶活是建立在菌株生長良好的基礎(chǔ)之上。由圖5可知,添加硝酸銨的培養(yǎng)基,酶活有顯著增加,效果優(yōu)于硝酸鈉和硫酸銨,說明硝酸銨能被菌株很好地利用。在該條件下,酶活可達(dá)(1.02±0.03)U/mL,此時生物量為(9.66±0.09)g/L。因此,選擇硝酸銨為適宜的無機(jī)氮源。

圖5　不同無機(jī)氮源種類對發(fā)酵的影響

2.6無機(jī)氮源添加量對發(fā)酵的影響

硝酸銨質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響如圖6所示。由圖6可知,隨著硝酸銨質(zhì)量濃度的增大,酶活反而呈下降的趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時,酶活最大,可達(dá)(1.06±0.06)U/mL,此時生物量為(10.44±0.06)g/L。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 g/L時,酶活僅為最大值的62%,生物量也有所下降。因此,選擇硝酸銨質(zhì)量濃度為1 g/L。

圖6　不同硝酸銨質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響

2.7培養(yǎng)基成分正交試驗

根據(jù)以上不同碳源和氮源單因素試驗結(jié)果和分析,選取葡萄糖、蛋白胨和硝酸銨進(jìn)行三因素三水平的正交試驗,并以酶活作為考察指標(biāo),獲得有利于茂原鏈霉菌產(chǎn)TG酶的發(fā)酵培養(yǎng)基。選取的因素水平和試驗結(jié)果見表2所列。方差分析結(jié)果見表3所列。

由表2和表3可知,各因素影響酶活的主次順序為B>A>C,即蛋白胨>葡萄糖>硝酸銨。根據(jù)極差分析得最佳組合條件為:A2B2C1。其中B因素高度顯著,A和C因素顯著。

直接分析較好的條件是第5組,即A2B2C3,由于計算分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果不一致,因此將2種組合同時進(jìn)行驗證,每組重復(fù)3次。驗證方案與結(jié)果見表4所列。

表2　正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表3　正交試驗方差分析表

注：F0.05(2,20)=3.49,F0.01(2,20)=5.85。

表4　正交驗證試驗方案與結(jié)果

根據(jù)試驗結(jié)果,組合A2B2C1優(yōu)于A2B2C3,因此選擇培養(yǎng)基的優(yōu)化組合為A2B2C1,即蛋白胨40 g/L,葡萄糖40 g/L,硝酸銨1 g/L。

3結(jié)束語

單因素試驗表明,葡萄糖是適宜的碳源,最佳質(zhì)量濃度為40 g/L,蛋白胨和硝酸銨是適宜的氮源,最佳質(zhì)量濃度分別為40 g/L和1 g/L。通過正交試驗數(shù)據(jù)可知,對茂原鏈霉菌產(chǎn)TG酶的影響主次順序為蛋白胨>葡萄糖>硝酸銨。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖40 g/L,蛋白胨40 g/L,硝酸銨1 g/L,酵母膏 2 g/L,硫酸鎂2 g/L,磷酸氫二鉀 2 g/L。最終酶活可達(dá)(1.30±0.07) U/mL,此時生物量為(9.69±0.23) g/L。

[參考文獻(xiàn)]

[1]趙新淮,徐紅華,姜毓君.食品蛋白質(zhì):結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能[M].北京: 科學(xué)出版社,2009:473.

[2]李寶臻,李海賓,劉爾卓,等.谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶及其對肉制品凝膠特性的影響[J].農(nóng)產(chǎn)品加工:學(xué)刊,2014 (1): 60-63.

[3]Yu X,Chen C G,Cai K Z,et al.Combined effect of blood plasma powder,agar,and microbial transglutaminase on physicochemical and textural properties of pork music gels[J].Food Science and Biotechnology,2012,21(4):941-950.

[4]張莉麗,韓雪,張?zhí)m威,等.茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在酸奶中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(12):210-212.

[5]Sanli T,Sezgin E,Deveci O,et al.Effect of using transglutaminase on physical,chemical and sensory properties of set-type yoghurt [J].Food Hydrocolloids,2011,25(6):1477-1481.

[6]吳進(jìn)菊,于博,豁銀強(qiáng),等.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性可食用膜的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2013,34(4): 114-117.

[7]滑艷穩(wěn),陳志周.谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對大豆蛋白/PVA復(fù)合薄膜性能的影響[J].包裝與食品機(jī)械,2014(2):19-23.

[8]楊慧林,包瑩玲,潘力.片段化全基因組體外誘變選育轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶高產(chǎn)菌株的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(1):34-37.

[9]劉穎,田沛霖,陳佳,等.產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶菌株的高通量篩選[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)報,2013,41(6): 167-172.

[11]Guerra-Rodríguez E,Vázquez M.Evaluation of a novel low-cost culture medium containing exclusively milk,potato and glycerol for microbial transglutaminase production bySreptomycesmobataensis[J].Chemical Engineering Research and Design,2014，92:784-791.

[12]郝偉,王璋,蔡慧農(nóng).微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶沉淀分離方法的研究[J].食品科學(xué),2006,27(10):331-334.

[13]Macedo J A,Lara D S,Sato H H.Purification and characterization of a new transglutaminase fromStreptomycessp.isolated in Brazilian soil[J].Journal of Food Biochemistry,2011,35(4):1361-1372.

[14]儀朝印,張東杰,王穎.茂原鏈霉菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因工程菌的構(gòu)建及表達(dá)[J].中國食品學(xué)報,2014,14(2):42-46.

[15]Du K,Liu Z M,Cui W J,et al.pH-dependent activation ofStreptomyceshygropicustransglutaminase mediated by intein[J].Applied and Environmental Microbiology,2014,80(2):723-729.

[16]Yan G L,Du G C,Li Y,et al.Enhancement of microbial transglutaminase production byStreptoverticilliummobaraense:application of a two-stage agitation speed control strategy[J].Process Biochemistry,2005,40(2):963-968.

[17]Zheng M Y,Du G C,Guo W F,et al.A temperature-shift strategy in batch microbial transglutaminase fermentation[J].Process Biochemistry,2001,36(6):525-530.

[18]楊雪霞,常忠義,曹丹玥,等.谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].東華大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,34(1):77-80.

[19]曹丹玥,高紅亮,常忠義,等.谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面分析優(yōu)化[J].華東師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007(2): 93-97.

[20]Grossowicz N,Wainfan E,Borek E,et al.The enzymatic formation of hydroxamic acids from glutamine and asparagine[J].Journal of Biological Chemistry,1950,187(1):111—125.

[21]黃亞杰,王子輝,趙彥偉,等.重組大腸桿菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國釀造,2012,31(4):21-24.

[22]常中義,江波,王璋.培養(yǎng)基組成對輪枝鏈霉菌合成谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的影響[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,2001,20(1):51-54.

[23]何國慶,賈英民,丁立孝.食品微生物學(xué)[M].第2版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2009:78-79.

[24]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京: 高等教育出版社,1997:111.

(責(zé)任編輯閆杏麗)

Optimization of medium components for the production of transglutaminase byStreptomycesmobaraensis

WANG Yan1,2,LUO Shui-zhong1,2,CAI Jing1,2,ZHONG Xi-yang1,2,JIANG Shao-tong1,2,ZHENG Zhi1,2

(1.School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2.Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, Hefei 230009, China)

Abstract:The transglutaminase(TG) produced by Streptomyces mobaraensis was investigated with different culture media. TG enzyme activity and DCW were taken as indexes to screen for the optimal components and concentrations of medium by using single factors and orthogonal experiments. The optimized medium was as follows: the mass concentration of glucose was 40 g/L, peptone 40 g/L, ammonium nitrate 1 g/L, yeast extract 2 g/L, MgSO4 2 g/L and K2HPO4 2 g/L. Under this experimental condition, TG activity and the biomass were up to (1.30±0.07)U/mL and (9.69±0.23)g/L, respectively. This study provides a reference for amplification cultivation and fermentation of bacterial strain in the future.

Key words:Streptomyces mobaraensis; transglutaminase(TG); fermentation medium; orthogonal experiment

中圖分類號:TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1003-5060(2016)02-0270-05

Doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2016.02.024

作者簡介：汪燕(1990-),女,安徽黃山人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;姜紹通(1954-),男,江蘇鹽城人,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師;

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2013AA102201);安徽省科技攻關(guān)計劃重大資助項目(1301031031)

收稿日期：2015-01-04；修回日期：2015-04-02

鄭志(1971-),男,安徽和縣人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,碩士生導(dǎo)師.