利用噬菌體多肽庫篩選卵巢癌細胞特異性結合肽

王樂丹 李文桔 胡越

【摘要】目的：利用噬菌體7肽庫進行體外快速差減篩選（biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands，BRASIL），從而獲得卵巢癌細胞株HO-8910細胞表面特異性結合肽。方法：以中國倉鼠卵巢細胞株CHO為吸附細胞，卵巢癌細胞株HO-8910為靶細胞，利用噬菌體展示技術聯(lián)合差減篩選策略，經(jīng)過連續(xù)5輪生物淘洗，隨機挑選13個噬菌體單克隆進行DNA測序，利用噬菌體競爭結合實驗、ELISA實驗、細胞免疫染色、細胞免疫熒光、合成多肽的競爭抑制實驗鑒定陽性噬菌體的親和性及特異性。結果：篩選出的噬菌體NPMIRRQ與卵巢癌細胞株HO-8910有較高的親和性及特異性。結論：陽性噬菌體表面展示的多肽NPMIRRQ可能為卵巢癌的早期診斷和轉移復發(fā)監(jiān)測提供新思路。

【關鍵詞】卵巢癌；噬菌體展示技術；噬菌體多肽庫；體外快速差減篩選技術；多肽

【中圖分類號】R737【文獻標志碼】A

卵巢癌位于婦科惡性腫瘤死亡之首＼[1＼]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年卵巢癌的發(fā)病率達12.7/100000＼[2＼]。目前，臨床上主要通過血清CA-125水平和婦科超聲檢查來診斷卵巢癌。然而，CA-125在多種惡性腫瘤和良性疾病中亦有升高＼[3＼]，其作為卵巢癌診斷指標在靈敏度和特異度方面均存在顯著局限，而超聲檢查也只能起輔助診斷的作用。因缺乏可靠的診斷指標，目前高達75%的卵巢癌患者在確診時已經(jīng)為晚期或已發(fā)生轉移＼[4＼]，其五年生存率更是不足30%＼[5＼]。如何盡早診斷卵巢癌提高患者的生存率成為專家學者們研究的重點問題。

噬菌體展示技術目前被認為是篩選腫瘤細胞表面特異性結合肽的強有力、高通量的一種生物學技術，最先是在1985年Smith等＼[6＼]首先創(chuàng)立并在Science雜志上發(fā)表，其將噬菌體隨機肽庫與靶標吸附，洗去非親和性或低親和性的噬菌體，用宿主菌洗脫結合的噬菌體，進行擴增，經(jīng)過3～5輪的循環(huán)，高度富集與靶分子特異結合的噬菌體，然后進行序列測定，獲取其相應的功能、結構等信息。本文以中國倉鼠卵巢細胞株CHO為吸附細胞，以卵巢癌細胞株HO-8910為靶細胞，差減篩選卵巢癌細胞株HO-8910細胞表面分子結合肽，并鑒定其親和性及特異性，從而獲得卵巢癌細胞特異性結合肽，展示利用噬菌體進行卵巢癌診斷的技術?，F(xiàn)匯報如下。

1材料與方法

1.1研究材料

1.1.1肽庫及試劑選用美國New England Biolabs公司的噬菌體隨機肽庫（Ph.D-7TM phage Display Peptide library），文庫滴度、隨機多樣性分別為2×1013 pfu/mL、1.28×109。受菌體為E.coli ER2738，-96gⅢ sequencing primer（5-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3）。選用earthox公司的抗M13單抗（GE Healthcare）、HRP-抗M13單抗（GE Healthcare）以及FITC標記的兔抗鼠IgG。

1.1.2細胞來源選自上海拜力生物科技有限公司的卵巢癌細胞株HO-8910，上海中科院的宮頸癌細胞株Hela、胰腺癌細胞株PANC-1以及上海瑞鹿生物科技有限公司的中國倉鼠卵巢細胞株CHO。

1.2方法

1.2.1差減篩選制作DMEM無血清培養(yǎng)液，內含1%BSA，將HO-8910與CHO細胞重懸于其中，至細胞數(shù)為1×107/mL時取CHO細胞100μL，其中10μL加至肽庫中，調節(jié)溫度4℃，旋轉孵育2h，30 rpm/min。孵育后加入200 μL環(huán)己烷、鄰苯二甲酸二丁酯分離液中，兩者體積比例為1∶9，10000 g、4℃離心10min；吸出水相里未結合的噬菌體肽庫與100 μL HO-8910細胞于4℃共同孵育3 h；無菌手術刀片切下EP管的底部，取出有機相內沉淀物，其為能與HO-8910細胞結合的噬菌體，轉移沉淀物至新的EP管中；另加入大腸桿菌ER2738 200μL，在37℃下孵育30min，對與HO-8910細胞結合的噬菌體進行復蘇。對淘洗后的噬菌體進行測滴度、擴增、純化，進入下一輪差減篩選。將每一輪淘洗及擴增的噬菌體數(shù)記錄下來，計算回收率（淘洗前后噬菌體滴度的比值）。

1.2.2DNA測序第五輪淘洗噬菌體的平板中隨機選取13個藍斑，擴增后提取DNA進行DNA序列分析，得出多肽序列。

1.2.3競爭結合實驗將所得7種噬菌體進行擴增和純化，測量其滴度，對照組為M13K07噬菌體。將7種噬菌體分別于M13K07噬菌體1：1混合，滴度為5×109 pfu，混合后置于100μL HO-8910細胞懸液中孵育2h，孵育溫度及條件與上述懸液配置相同。2h后將其離心、復蘇并測量滴度。由于M13K07噬菌體無lac-Z基因，在LB/IPTG/X-gal平板上呈白斑，而其余7種噬菌體呈藍斑。記錄白斑、藍斑數(shù)目，計算7種噬菌體與HO-8910細胞的相對結合率（藍斑與白斑的比值）。

1.2.4ELISA實驗將HO-8910、PANC-1以及Hela接種于96孔板上，計數(shù)為104/孔，溫度調節(jié)為37℃，過夜培養(yǎng)，使用滅菌PBS進行洗滌后，在無血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)1h，使用4%多聚甲醛進行20min固定，將加入5 mg/mL BSA的PBS作為封閉液封閉培養(yǎng)2h。以PBS、M13K07噬菌體為對照組，分別在接種板上加入7種噬菌體克隆1010 pfu/孔），溫度為37℃，孵育2h。孵育前均加入封閉液稀釋，預先孵育30min排除非特異性結合。加入以1∶6000稀釋于封閉液中的HRP-抗M13抗體（200 μL/孔）孵育1h，每孔加入200 μL TMB顯色液并孵育1h，設置微板閱讀器410nm。

1.2.5細胞免疫染色分別將細胞HO-8910、Hela、PANC-1接種于細胞爬片上，每孔104/0.5 mL培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜；4%多聚甲醛室溫固定15 min；封閉液 （含5 mg/mL BSA的PBS）室溫封閉20 min；吸去封閉劑，分別加入噬菌體NPMIRRQ和噬菌體M13K07，37℃孵育2 h（1010 pfu/孔），PBS作為陰性對照；加入1∶100稀釋的HRP-抗M13抗體，37℃孵育2 h；取下細胞爬片置于載玻片上，加入新鮮配制的DAB顯色液，室溫下反應2～3 min，在顯微鏡下監(jiān)測DAB顯色情況；再用蘇木素輕度復染細胞核0.5～1 min；脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察陽性著色為棕色顆粒。

1.2.6細胞免疫熒光如“細胞免疫染色”中所述制作細胞爬片，固定，封閉，加入1∶100稀釋的抗M13抗體，37℃孵育2 h；加入1∶300稀釋的FITC標記的兔抗鼠IgG，37℃ 孵育0.5 h（避光）；加入DAPI（1：5000）常溫孵育5 min（避光）；立即在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7合成多肽的競爭抑制實驗收集HO-8910細懸液，調整細胞數(shù)為1×107/mL；分別將HO-8910細胞與不同濃度的多肽NPMIRRQ或對照肽4℃孵育0.5 h，再與109 pfu噬菌體NPMIRRQ于4℃孵育2 h（旋轉，30 rpm/min）；后離心、復蘇、測滴度。實驗共分為7組，多肽濃度分別是：0 μmol/L、0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L和500 μmol/L，以多肽濃度是0 μmol/L時的噬菌體滴度為100%，計算不同濃度多肽時噬菌體滴度的相對比值。多肽NPMIRRQ和對照肽均由上海生工公司合成。

2實驗結果

2.1差減篩選

本文用CHO、HO-8910作為吸附細胞及靶細胞，對7種噬菌體進行差減篩選，計算每輪回收率?？梢娀厥章实谝惠啚?.5×10-6，到第5輪時增加到2.3×10-4。見表1。

2.7合成多肽的競爭抑制實驗

競爭抑制實驗顯示：多肽NPMIRRQ能抑制噬菌體NPMIRRQ與卵巢癌細胞株HO-8910的結合，呈劑量效應關系，而含相同氨基酸但不同組成順序的對照肽PMIRRQN則不能抑制噬菌體NPMIRRQ與卵巢癌細胞株HO-8910的結合。見圖4、圖5。

3討論

本文展示了噬菌體技術的過程及結果，其優(yōu)勢在于表型與基因型的結合可在不知道靶分子結構的前提下，通過對陽性噬菌體克隆基因的序列檢測，推斷出外源多肽氨基酸的結構序列＼[7＼]。近幾年，一些通過噬菌體肽庫篩選技術得到的組織特異性多肽分子以其較好的靶向性、較低的免疫原性、較小的毒副作用以及便于化學修飾，具有較好的藥代動力學及組織內分布特性等特征，引起了眾多腫瘤學家的關注＼[8＼]。這些多肽分子可與多種類型的標記物分子如同位素、熒光素及量子點等偶聯(lián)，開發(fā)為特異性多肽分子探針，用于多種腫瘤的早期診斷與大范圍篩查＼[8-10＼]。

近些年，以腫瘤細胞為靶標，應用噬菌體展示技術在體外已成功篩選到能與不同腫瘤細胞如結腸癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、神經(jīng)母細胞瘤、鼻咽癌等細胞表面特異性結合的多肽＼[11＼]，但對于卵巢癌的應用研究較少，王世宣等＼[12＼]做過相關報道，使用多肽庫進行淘洗篩選后得到能與A2780卵巢癌細胞株結合的YYGLAEVDAGGS短肽。國外學者Zhang等＼[13＼]也經(jīng)過實驗得到能與SK-OV-3卵巢癌細胞株結合的SVSVGMKPSPRP（ZP1）短肽，其認為此短肽可作為靶向診斷和治療卵巢癌的配體肽段。但這些研究都還只是初步鑒定多肽的親和性，缺乏特異性方面的研究。

由于腫瘤細胞表面的生物活性分子非常復雜，導致噬菌體與細胞的非特異性結合較高，常常使以腫瘤細胞為靶標的篩選效果不是很理想，同時在反復洗滌過程中高親和力噬菌體的流失、背景值高等問題也給噬菌體的生物淘洗帶來困難。2001年Giordano等＼[14＼]在噬菌體展示技術的基礎上創(chuàng)立了體外快速差減篩選技術（BRASIL），他通過差減篩選以降低非特異性結合，以經(jīng)有機相單次離心技術來代替反復洗滌過程，減少高親和力噬菌體的流失，從而為噬菌體展示技術篩選細胞表面分子結合肽提供更加優(yōu)異的方法。

本文以中國倉鼠卵巢細胞株CHO為吸附細胞，卵巢癌細胞株HO-8910為靶細胞， 經(jīng)過5輪生物淘洗，回收率從2.5×10-6增加至2.3×10-4，第五輪相對于第一輪回收率增加92倍之多，此結果為陽性噬菌體富集而造成。提示陽性噬菌體得到有效的富集。而后從第五輪淘洗后的噬菌體平板中隨機挑選13個噬菌體克隆進行DNA測序，從而推斷出外源多肽氨基酸的結構序列。本文結果顯示，13個噬菌體包含7種多肽序列，其中噬菌體NPMIRRQ得到富集。由于腫瘤細胞表面存在復雜多樣的生物活性分子，而噬菌體肽庫的隨機多樣性為1.28×109，理論上篩選出噬菌體克隆也可能出現(xiàn)多樣性，但本研究采用體外快速差減篩選技術，并優(yōu)化篩選條件，如采用封閉液除去細胞表面非特異性結合，以CHO為吸附細胞，除去部分能與CHO細胞表面結合的噬菌體，而后再與卵巢癌細胞株HO-8910共同孵育，提高篩選的陽性率，因此可以解釋以HO-8910細胞為靶標只篩選到1個高親和性的陽性噬菌體NPMIRRQ＼[15，16＼]。

為進一步對篩選所得的這7種噬菌體對細胞株HO-8910的親和性，本研究使用ELISA以及競爭性結合兩種實驗方法進行檢測。在競爭性結合實驗中，將M13K07作為對照組，研究陽性噬菌體與HO-8910細胞的結合率，優(yōu)點在于排除了噬菌體數(shù)目、數(shù)量等眾多影響因素。在之后的離心、復蘇、測量滴度等方面可重復研究，無明顯誤差。且由于M13K07噬菌體無lac-Z基因，在平板上呈白斑，而其余研究的噬菌體呈藍斑，故將白斑與藍斑的比值作為不同噬菌體與HO-8910細胞的相對結合率。研究結果發(fā)現(xiàn)，7種噬菌體與HO-8910結合率均高出對照組約3～40.3倍之間，其中展示Asn-Pro-Met-Ile-Arg-Arg-Gln（NPMIRRQ）肽的噬菌體與HO-8910的相對結合效率是對照噬菌體的40.3倍。在ELISA 實驗中，P/N（OD 隨機克隆/OD陰性對照克?。?2.1 時，就表示此克隆與細胞具有高親和力，在本實驗中，噬菌體NPMIRRQ的P/N>6，說明噬菌體NPMIRRQ與卵巢癌細胞株HO-8910有高親和力，而其余6種噬菌體的P/N<2，提示與卵巢癌細胞株HO-8910親和力不高。綜合噬菌體競爭結合實驗及ELISA實驗結果顯示，噬菌體NPMIRRQ與HO-8910細胞有較高的親和性。

隨后，我們利用細胞免疫染色、細胞免疫熒光、合成多肽的競爭抑制實驗鑒定噬菌體NPMIRRQ與卵巢癌細胞株HO-8910的特異性。細胞免疫染色和細胞免疫熒光實驗結果提示，噬菌體NPMIRRQ能特異性與HO-8910細胞表面結合，與其他腫瘤細胞（如Hela，PANC-1）不結合，而對照噬菌體M13K07則均不能與這三種腫瘤細胞表面結合。合成多肽的競爭抑制實驗結果提示，多肽NPMIRRQ能抑制噬菌體NPMIRRQ與HO-8910細胞的結合，且呈劑量效應關系，而含相同氨基酸但不同組成順序的對照肽PMIRRQN則不能抑制噬菌體NPMIRRQ與卵巢癌細胞株HO-8910的結合，進一步證實多肽NPMIRRQ對HO-8910細胞的特異性選擇。綜合細胞免疫染色、細胞免疫熒光、合成多肽的競爭抑制實驗等結果，通過不同腫瘤細胞與靶細胞HO-8910之間對比，證實噬菌體NPMIRRQ能選擇性與HO-8910細胞結合，同時可以推導出噬菌體NPMIRRQ能與HO-8910細胞結合是由展示在噬菌體表面的多肽NPMIRRQ介導的。

本研究采用噬菌體展示技術，使用差減篩選得到與HO-8910卵巢癌細胞株表面特異性結合的多肽NPMIRRQ，通過各種鑒定實驗驗證其親和性及特異性，均提示此多肽能特異性與細胞株HO-8910結合，其可能為卵巢癌的早期診斷、轉移復發(fā)監(jiān)測、治療提供新思路。

（致謝：本實驗得到了溫州醫(yī)科大學生物教學實驗中心、分子生物學實驗中心的大力協(xié)助，謹致謝忱）

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（收稿日期：2015-04-02）