林雁嘉 黃楚韓 林雯 林明恩 鄭道城 蔡林河

【摘要】目的：探討腫瘤壞死因子TNF-α-308、TNF-α-238位點基因多態(tài)性與梅毒發(fā)病的關(guān)系。方法：采用等位基因特異引物聚合酶鏈反應(yīng)（AS-PCR）分析顯性梅毒組（A組）共93例；潛伏梅毒組（B組） 共55例以及正常對照組（C組）41例 TNF-α-308、TNF-α-238位點基因多態(tài)性。結(jié)果：三組TNF-α-308位點等位基因、基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。三組TNF-α-238位點等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；TNF-α-238位點基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：人梅毒患者中TNF-α-308 A和238A的存在過度表達(dá)，且TNF-α-308、238位點基因多態(tài)性與梅毒的發(fā)病及病程進(jìn)展可能有關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】梅毒；腫瘤壞死因子-α；多態(tài)性；單核苷酸

【中圖分類號】R759.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

機體感染了梅毒螺旋體后，其臨床癥狀表現(xiàn)多樣化、程度輕重不一；可以表現(xiàn)為顯發(fā)梅毒，也可為潛伏梅毒；不同患者對治療的反應(yīng)性和敏感性不同，其臨床療效也相差甚遠(yuǎn)。這提示我們梅毒螺旋體本身可能存在基因與決定遺傳易感性中起到關(guān)鍵作用＼[1，2＼]，可能與機體發(fā)生免疫應(yīng)答的強度相關(guān)，可決定梅毒感染的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸等方面。

目前，國內(nèi)外關(guān)于人類梅毒遺傳易感性方面的研究尚未見深入報道。我們通過借鑒其他諸如乙型肝炎病毒、HIV及結(jié)核等感染性疾病的遺傳易感性的研究，擬選用梅毒免疫發(fā)病中與抗原識別攝取相關(guān)的Thl反應(yīng)性細(xì)胞因子TNF-α作為研究的目的基因，通過對其基因SNP位點的分析，探討其與梅毒易感性的關(guān)系，為今后的臨床診治提供新的理論和實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1病例分組

病例148例為我院確診為早期梅毒（梅毒血清學(xué)檢查RPR、TPPA陽性，病程<2年）患者。其中男91例， 女57例； 平均年齡（31.5 ±6.4）歲； 有典型的臨床癥狀及體征（出現(xiàn)硬下瘡、扁平濕疵、掌拓紅斑等皮疹）的患者為顯性梅毒組（A組）共93例；未出現(xiàn)典型臨床癥狀和體征的患者為潛伏梅毒組（B組） 共55例。正常對照均為同期健康獻(xiàn)血者，經(jīng)獻(xiàn)血前常規(guī)體檢排除乙肝、HIV感染（C組）。

1.2方法與步驟

1.2.1主要試劑和儀器96孔PCR儀（Roche公司，美國，型號LightCycler 96）；血液基因組提取純化試劑盒（Promega，型號MD1360，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（UVP，型號Biodoc-IT 220美國）。

1.2.2基因組DNA的提取和純化采用含有乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K）的抗凝管抽取各組受測者的空腹外周靜脈血3mL，應(yīng)用基因組提取純化試劑盒提取基因組DNA。采用12000r/min轉(zhuǎn)速室溫離心15min，提取血樣的基因組DNA，并保存于-20℃冰箱以備檢測使用。

1.2.3分析TNF-α-238和308位點的基因多態(tài)性于美國國立生物技術(shù)信息中心官方網(wǎng)站上查詢并獲得人類TNF-α基因的全序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計各個序列引物，引物委托上海生工有限公司合成。采用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度。多態(tài)性（PCR-RFLP）分析，并完成擴增。TNF-α-308 G/A 擴增引物序列為：上游引物： 5- AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT -3，下游引物序列：5 - TCCTCCCTGCTCCGATTCCG -3，產(chǎn)物大小156 bp；TNF-α-238 G/A擴增引物序列：上游引物：5-ATCTGGGGAACGGTAGTG-3 ，下游引物序列：5-AGAAGACCCCTCGGAACC-3，產(chǎn)物大小164 bp。

擴增反應(yīng)體系總體積為25μL，包含有PCR Master Mix 12.5μL，cDNA模板2μL，上下游引物各1μL。擴增反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2 min，然后94°C變性1 min，64°C退火1min，72°C延伸1min；循環(huán)進(jìn)行35次，末次再于72°C延伸5min，4°C冷卻終止反應(yīng)；產(chǎn)物取出后加入限制性內(nèi)切酶MspI5U，于-20°C冰箱保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增的產(chǎn)物，并鑒定目的基因的等位基因及基因型，電腦軟件凝膠成像進(jìn)行分析圖像。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件分析。兩組資料比較：計量資料采用獨立樣本t檢驗或計數(shù)資料的χ2檢驗；多組計量資料比較采用方差分析，用Hard-Weinberg遺傳平衡法分析檢驗樣本的群體分布是否符合遺傳規(guī)律。檢驗水準(zhǔn)為a<0.05。

2結(jié)果

2.1血清DNA片段瓊脂電泳分離鑒定結(jié)果

電泳可見單一清晰條帶，表明所提取的DNA無降解。見圖1。

2.2TNF-α-238等位基因基因型的鑒定

PCR產(chǎn)物出現(xiàn)了近206bp的條帶，為野生型純合子GG基因型；出現(xiàn)280bp的條帶，為野生型純合子AA基因型；出現(xiàn)206與280bp的兩條條帶，為突變型雜合子GA基因型。見圖2。圖2TNF-α-238等位基因基因型的鑒定

2.3TNF-α-308等位基因基因型的鑒定

PCR產(chǎn)物出現(xiàn)了近135bp的條帶，為野生型純合子GG基因型；出現(xiàn)350bp的條帶，為野生型純合子AA基因型；出現(xiàn)135與350bp的兩條清晰條帶，為突變型雜合子GA基因型。見圖3。圖3TNF-α-238等位基因基因型的鑒定

2.4TNF-α-238、308等位基因及基因型的頻率

采用Hard-Weinberg遺傳平衡法分析檢驗TNF-α-238和308等位基因與基因型在兩組（顯性A組、潛伏梅毒B組）中的分布規(guī)律均符合遺傳平衡定律，樣本均來自平衡群體，具備較好的代表性（P<0.05）。

根據(jù)表1所示，A組、B組的TNF-α-238位點G/A位點基因型頻率相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P =0.037），與C組相比較也均有統(tǒng)計學(xué)意義；而A組、B組的TNF-α-238位點G/A等位基因頻率相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P =0.135）。A組、B組的TNF-α-308位點G/A位點基因型頻率和等位基因頻率相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為0.025，0.019），位點基因型頻率和等位基因頻率與C組相比較也均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、表2。

表1TNF-α-238G/A位點基因型頻率和等位基因頻率相比較組別例數(shù)基因型G/GG/AA/A等位基因GAA9381112*#17115B554951*#1037C413821774注：*與C組對照P<0.05；# A組與B組對照P<0.05

3討論

TNF-α基因位于6號染色體P21區(qū)域內(nèi)，目前研究證實TNF-α的基因多態(tài)性與很多疾病的發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)，諸如感染性疾病、自身免疫性疾病、血液病以及惡性腫瘤等。目前研究已知TNF-α啟動子區(qū)域有11個單核苷酸多態(tài)性區(qū)域（SNPs），TNF-α基因多態(tài)性的位點目前研究主要有-308、-238、-376、-244、-857、-1031以及-863等，其5端為高突變區(qū)；其中TNF-α-238和TNF-α-308兩個位點的研究最為深入和重要＼[3，4＼]。目前國內(nèi)外TNF-α基因多態(tài)性在梅毒方面的研究尚屬不多。研究表明，這兩個位點與機體對慢性病毒類感染的清除緩解有關(guān)＼[5，6＼]。

當(dāng)前研究結(jié)果表明，TNF-α的產(chǎn)生除了機體本身的自身免疫系統(tǒng)活化有關(guān)之外，還與TNF-α的基因啟動子區(qū)域的基因多態(tài)性而影響其轉(zhuǎn)錄特性并使得影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)水平有關(guān)。再者不同的基因型可以轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生擁有不同生物特性的蛋白，并可表現(xiàn)出不同的生物活性及疾病的易感性和嚴(yán)重程度。但TNF-α-238和308兩個位點的基因多態(tài)性是否導(dǎo)致了梅毒感染患者的遺傳易感特性以及在臨床上產(chǎn)生了不同的結(jié)局和嚴(yán)重程度，目前尚無明確定論＼[7，8＼]。

TNF-α是當(dāng)梅毒螺旋體進(jìn)入人體感染后刺激朗格罕氏細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌而成，具有調(diào)節(jié)炎癥免疫系統(tǒng)的作用，介導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫，增強抗原遞呈與表達(dá)，激活巨噬細(xì)胞和補體系統(tǒng)，在殺傷病原體中發(fā)揮重要作用＼[9，10＼]。目前研究顯示：梅毒感染的病程早期以細(xì)胞免疫為主，梅毒螺旋體主要引發(fā)宿主的細(xì)胞免疫，進(jìn)而殺傷清除體內(nèi)的病原體，并引起組織損害，表現(xiàn)為不同的臨床體征和癥狀＼[11-14＼]。

本研究對梅毒患者TNF-α-308、238兩個位點等位基因及基因型進(jìn)行鑒定，并與正常人群對照組進(jìn)行比較。我們的研究顯示，顯性梅毒組、潛伏性梅毒和對照組TNF-α-308位點基因型的分布頻率存在差異。我們的研究結(jié)果表明，兩組試驗組TNF-α-308 G/A、A/A基因型頻率明顯高于對照組的基因型頻率；兩組的TNF-α-308 A等位基因頻率也明顯高于對照組。顯性梅毒組TNF-α-308的A基因頻率和基因型均比、潛伏性梅毒的要高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而國內(nèi)劉春等＼[15＼]曾研究梅毒患者和正常人中TNF-α-308位點基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果認(rèn)為TNF-α-308位點基因多態(tài)性與梅毒的遺傳易感性無明顯關(guān)系。

本研究顯示，兩組試驗組TNF-α-238 G/A、A/A基因型頻率均明顯高于對照組，但其等基因頻率卻無統(tǒng)計學(xué)差異；可能與樣本量不足有關(guān)。

綜上所述，我們認(rèn)為TNF-α的基因多態(tài)性在機體梅毒感染的發(fā)生和病程發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與梅毒的細(xì)胞免疫系統(tǒng)激活和調(diào)節(jié)密切相關(guān)；TNF-α-308 A及238A等位基因可能是人類感染梅毒的遺傳易感因子，TNF-α的基因多態(tài)性與梅毒發(fā)病和病程進(jìn)展以及轉(zhuǎn)歸有一定的相關(guān)性。但研究結(jié)果仍需多中心大樣本試驗的進(jìn)一步驗證。

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（收稿日期：2015-07-24）