羥乙基淀粉對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后無(wú)復(fù)流的影響*

黃崇安，　何麗娜，　孫嘉利,　應(yīng)安娜，　葉永挺，　蔡　琪，　袁琳波，　花春艷

(溫州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035)

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羥乙基淀粉對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后無(wú)復(fù)流的影響*

黃崇安，何麗娜，孫嘉利,應(yīng)安娜，葉永挺，蔡琪，袁琳波△，花春艷△

(溫州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，浙江 溫州 325035)

[摘要]目的： 探討羥乙基淀粉(HES 130/0.4)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注中無(wú)復(fù)流現(xiàn)象的影響及機(jī)制。方法:36只SD大鼠隨機(jī)分為缺血-再灌注組(IR組)，生理鹽水組(NS-IR組)，羥乙基淀粉組(HES-IR組)和假手術(shù)組(sham組)。NS-IR 和HES-IR 組在缺血30 min時(shí)分別靜注生理鹽水和HES 130/0.4，再灌注180 min 后以Evans blue、Thilflavin S和TTC染色測(cè)定心肌梗死面積與無(wú)復(fù)流范圍，同時(shí)檢測(cè)心肌肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)含量和髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性。培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Con組)，缺氧-復(fù)氧組(H/R組)，生理鹽水組(NS-H/R組)和羥乙基淀粉組(HES-H/R組)，以缺氧復(fù)氧法模擬急性缺血再灌注，測(cè)定游離鈣離子濃度、細(xì)胞活力和凋亡率。結(jié)果：HES-IR 組大鼠心肌梗死面積、無(wú)復(fù)流范圍、心肌酶CK-MB、cTnI和MPO與IR 組相比均減少(P<0.05)。HES-H/R組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡率較H/R組亦明顯減少(P<0.05)，而細(xì)胞活力增高(P<0.05)。結(jié)論：HES 130/0.4能改善心肌缺血-再灌注后的無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，其機(jī)制不僅涉及對(duì)中性粒細(xì)胞激活、浸潤(rùn)的抑制，還與減輕內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]羥乙基淀粉； 心肌再灌注損傷； 無(wú)復(fù)流； 髓過(guò)氧化物酶； 鈣離子

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)時(shí)冠脈再通的首選方法，能夠早期恢復(fù)心肌灌注。但經(jīng)PCI使冠脈再通后, 約有 30%～50%的患者仍可發(fā)生心肌組織再灌注不足或無(wú)灌注[1]，即無(wú)復(fù)流現(xiàn)象(no-reflow phenomenon)。此現(xiàn)象嚴(yán)重影響AMI的預(yù)后，可使患者住院病死率增加5～10倍，還是多種重要心臟事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，因此無(wú)復(fù)流的防治已成為AMI治療的關(guān)鍵。然而由于其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，往往同時(shí)涉及缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷、內(nèi)皮和組織水腫、多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)浸潤(rùn)和微循環(huán)栓塞等多種過(guò)程，許多現(xiàn)有藥物的療效并不十分確定。

羥乙基淀粉(hydroxyethylstarch，HES)是臨床最常用的血漿代用品之一，能夠迅速穩(wěn)定滲透壓，封堵毛細(xì)血管漏，擴(kuò)充血容量。近年來(lái)許多研究表明，HES還可通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞激活和黏附[2-3]的抗炎作用減輕腦和心肌的缺血-再灌注損傷。但HES能否以此影響AMI再灌注時(shí)無(wú)復(fù)流的發(fā)生尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用大鼠模型，以病理學(xué)染色方法和心肌酶活性檢測(cè)評(píng)價(jià)了HES對(duì)心臟缺血再灌注后無(wú)復(fù)流的影響，并根據(jù)髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性及進(jìn)一步測(cè)得心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化，對(duì)HES的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

材料和方法

1動(dòng)物

36只SD大鼠由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體重(240±20)g, 雌雄不拘，按體重從大到小排序，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組9只。

2主要試劑

HES 130/0.4氯化鈉注射液購(gòu)自山東華魯制藥有限公司；Thilflavin S 購(gòu)自Bioluminor；Evans blue 購(gòu)自Abcam；TTC染液購(gòu)自南京建成生物公司；大鼠肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnI)、MPO試劑盒均購(gòu)自R&D；DMEM/F12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自 Gibco；胎牛血清購(gòu)自 HyClone；CCK-8 試劑購(gòu)自Dojindo；PI 溶液和Fluo-2/AM 購(gòu)自 Sigma。SPD-66A紫外檢測(cè)器購(gòu)自Shimadzu；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman Coulter。

3主要方法

3.1大鼠AMI再灌注模型的制備20%烏拉坦腹腔注射(每100g重0.6 mL)以麻醉大鼠，切開(kāi)氣管，連接呼吸機(jī)輔助呼吸。消毒鋪巾，打開(kāi)胸腔，縱行切開(kāi)心包膜，充分暴露心臟，于冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending，LAD)近段結(jié)扎。缺血90 min后切斷結(jié)扎線，根據(jù)局部心肌顏色變化證實(shí)再灌注，再灌注時(shí)間為120 min。缺血-再灌注組(IR組)不做其它處理。HES-缺血-再灌注組(HES-IR組)在缺血30 min時(shí)尾靜脈注射1 mL HES，生理鹽水-缺血-再灌注組(NS-IR組)用等劑量的生理鹽水替代。假手術(shù)組(sham組)不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，僅尾靜脈注射等量的生理鹽水。

3.2病理染色與心肌無(wú)復(fù)流程度、梗死程度的測(cè)定恢復(fù)灌注后，左心室經(jīng)導(dǎo)管注入6% Thioflavin S溶液(1 mg/kg)以標(biāo)記再灌注心肌。結(jié)扎原冠脈，再次經(jīng)導(dǎo)管注入左心室Evans blue溶液(1 mg/kg)，取出心臟，分離左心室，快速深低溫冷凍。冷凍心臟復(fù)溫解凍，沿房室溝平行切為8～10層。未被染成藍(lán)色的心肌屬于結(jié)扎冠脈供血范圍，其中在紫外燈下無(wú)熒光的心肌為無(wú)復(fù)流心肌，后者與前者的比例即為無(wú)復(fù)流的比例。將各層心肌行TTC染色，紅色陽(yáng)性區(qū)為非梗死心肌，灰白陰性區(qū)為梗死心肌。

3.3cTnI、MPO和CK-MB的檢測(cè)大鼠均于再灌注結(jié)束后取梗死及梗死周邊區(qū)心肌組織置于勻漿器內(nèi)，剪碎，制備勻漿。3 000 r/min離心15 min后，取上清液，用酶聯(lián)免疫試劑盒分別測(cè)定CK-MB、cTnI和MPO的含量。

3.4心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)的分離培養(yǎng)、鑒定與模型建立采用酶消化法分離大鼠CMECs，具體步驟參考文獻(xiàn)[4]。采用免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞中第Ⅷ因子相關(guān)抗原，對(duì)分離培養(yǎng)的CMECs進(jìn)行鑒定。CMECs 染色后細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。取穩(wěn)定生長(zhǎng)的第2～ 3 代細(xì)胞于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)3～ 4 d后，按照完全隨機(jī)化法分為: (1)正常對(duì)照(control,Con)組：正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加干預(yù)；(2)缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)組：CMECs置于培養(yǎng)箱內(nèi)缺血小室，通以95% N2+5% CO2混合氣體1.5 L/min，15 min 后調(diào)節(jié)流速至0.5 L/min，持續(xù)缺氧2 h，模擬缺血；取出細(xì)胞去上清液，加入空氣飽和含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧4 h，即缺氧2 h/復(fù)氧4 h，模擬在體心肌急性缺血再灌注；(3)HES-H/R組：復(fù)氧時(shí)加入1 mL HES；(4)NS-H/R組：復(fù)氧時(shí)加入等量生理鹽水。

3.5激光共聚焦測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化將各組細(xì)胞樣品滴加Fura-2負(fù)載溶液，在37 ℃下避光負(fù)載20～30 min，制片。放置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，連續(xù)動(dòng)態(tài)掃描選定細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化。發(fā)射波長(zhǎng)為380 nm，采樣頻率為488 Hz, 激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，每隔10 s 掃描 1 次。將細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度變化圖像進(jìn)行分析處理，得相對(duì)熒光強(qiáng)度值的時(shí)間～效應(yīng)曲線，再轉(zhuǎn)換為時(shí)間～[Ca2+]i曲線。在相同的環(huán)境下，每實(shí)驗(yàn)組先后重復(fù)3次。Fura-2檢測(cè) [Ca2+]i的計(jì)算公式為 [Ca2+]i=Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)。

3.6CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力制備各組細(xì)胞懸液，將CDn、H/R、NS- H/R、HES-H/R 4組分別接種到96孔板中，每個(gè)樣本加3個(gè)孔，每孔100 μL細(xì)胞懸液，做3個(gè)重復(fù)，放入培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)。每孔加入10 μL CCK-8溶液，經(jīng)過(guò)1～4 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(A)值，從而測(cè)定細(xì)胞活力的變化。

3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率收集懸浮細(xì)胞于離心管中，600×g離心5 min。棄上清，加入生理鹽水，使細(xì)胞濃度為4×109/L，加入預(yù)冷的70% 乙醇固定，4 ℃保存1 h。用PBS離心，去除固定液，加1% RNase，37 ℃水浴30 min。用800 μL PI 染色液混勻，4 ℃避光30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以波長(zhǎng)488 nm 氬離子激發(fā)熒光，記錄紅色熒光，分析凋亡細(xì)胞百分率。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)之間的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，表1的計(jì)數(shù)資料用2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1HES對(duì)大鼠再灌注性心律失常的影響

IR組大鼠心肌ST段明顯抬高，而且合并缺血引起的心律失常;HES-IR組大鼠心肌再灌注性心律失常發(fā)生率顯著低于IR組，其持續(xù)時(shí)間較短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05);NS-H/R組較IR組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;Sham組未見(jiàn)再灌注心律失常發(fā)生。見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1.The rat ECG recorded during reperfusion in each group.

圖1各組大鼠心肌再灌注性心律失常的監(jiān)測(cè)

表1　各組大鼠心肌再灌注性心律失常的監(jiān)測(cè)

VT: ventricular tachyarrhythmia; VF: ventricular fibrillation; VEBs: ventricular ectopic beats; AVB: atrioventricular block.*P<0.05vsI/R group.

2各組梗死范圍及無(wú)復(fù)流范圍比較

病理染色結(jié)果顯示，IR組和NS-IR組的心肌均出現(xiàn)了明顯的梗死和無(wú)復(fù)流，提示無(wú)復(fù)流模型成功，其梗死范圍分別為(33.6±7.0)%和(33.3±7.5)%，無(wú)復(fù)流范圍分別為(16.0±2.0)%和(14.6±3.2)%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。HES-IR組心肌的梗死和無(wú)復(fù)流范圍為(18.0±3.6)%和(8.5±2.0)%，與IR組相比均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。見(jiàn)圖2～4。

Figure 2.The range of myocardial infarction and no-reflow phenomenon in each group. A:the Thioflavin S-negative staining regions represent no-reflow; B: the TTC-negative staining regions represent myocardial infarction.

圖2各組大鼠心肌梗死、無(wú)復(fù)流面積的評(píng)估

Figure 3.Comparison of the range of no-reflow in each group. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

圖3各組大鼠心肌無(wú)復(fù)流范圍比較

Figure 4.The range of myocardial infarction in each group. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIR group.

圖4各組大鼠心肌梗死范圍比較

3各組心肌酶含量的比較

酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，IR組心肌的CK-MB、cTnI和 MPO分別為(128.95±12.38)U/L、(65.54±4.32)U/L和(832.10±29.20)U/g，均顯著增高；NS-IR組3種酶分別為(124.39±8.68)U/L、(64.84±4.21)U/L和(823.31±25.98)U/g，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，均提示心肌損傷，且出現(xiàn)了明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)聚集。HES-IR組3種酶含量分別為(88.01±3.35)U/L、(43.27±4.82)U/L和(567.21±19.53)U/g，與IR組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，提示HES對(duì)缺血再灌注后的心肌損傷和無(wú)復(fù)流現(xiàn)象有改善作用，見(jiàn)圖5。

4各組內(nèi)皮細(xì)胞活力的比較

心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力情況，H/R組、NS-H/R組的A值分別為0.428±0.068和0.429±0.039，明顯低于正常對(duì)照組，提示內(nèi)皮細(xì)胞活力降低。HES-H/R組的A值為0.607±0.043，與H/R組相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見(jiàn)圖7。

5各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞流式檢測(cè)凋亡率的比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率顯示，H/R組和NS-H/R組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率增高，其值分別為(8.4±1.4)%和(8.4±0.9)%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。HES-H/R組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為(3.4±0.7)%，較H/R組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見(jiàn)圖8。

6各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子濃度的比較

激光共聚焦觀察顯示，H/R組和NS-H/R組的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，其值分別為(226.44±18.83) nmol/L和(229.53±6.25) nmol/L，2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。HES-H/R組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度為(145.00±18.53)nmol/L，與H/R組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖9。

Figure 5.The levels of CK-MB, cTnI and MPO in each group. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssham group；#P<0.05vsIR group.

圖5各組大鼠心肌 CK-MB、cTnI和 MPO 水平的比較

討論

PCI術(shù)后無(wú)復(fù)流的發(fā)生已成為當(dāng)今 AMI治療中實(shí)現(xiàn)心肌有效再灌注的最大障礙，然而其機(jī)制至今尚未闡述清楚，這嚴(yán)重制約著無(wú)復(fù)流防治的進(jìn)展。目前較認(rèn)可的機(jī)制中，PMN介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是心肌缺血再灌注損傷眾多機(jī)制的共同效應(yīng)環(huán)節(jié)或途徑[5]。首先，PMN體積較大，變形能力弱，極易嵌頓。

Figure 6. Appraisement of rat cardiac microvessel endothelial cells.

圖6第Ⅷ因子抗原檢測(cè)鑒定大鼠心肌微血管細(xì)胞

Figure 7.The cell activity of rat microvascular endothelial cells in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsH/R group.

圖7各組大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的比較

再灌注時(shí)毛細(xì)血管內(nèi)PMN的數(shù)量可增加10～20倍，大量PMN沿血管內(nèi)皮細(xì)胞附壁滾動(dòng)、在黏附分子參與下緊密黏附并浸潤(rùn)于內(nèi)皮下，引起血小板聚集并機(jī)械性堵塞毛細(xì)血管[6]，導(dǎo)致無(wú)復(fù)流的發(fā)生。其次，PMN激活產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)和蛋白水解酶、氧自由基、花生四烯酸等還可通過(guò)多種機(jī)制妨礙組織有效再灌注：直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞；受損的內(nèi)皮、PMN和血小板可釋放大量縮血管物質(zhì)，導(dǎo)致微血管痙攣，血流受阻[7]；血管通透性增加使大量漿液滲出、局部血液濃縮、黏度增高，加重心肌缺血缺氧；嚴(yán)重滲出可引起組織間隙水腫、壓迫毛細(xì)血管從而加劇微循環(huán)障礙，這些均利于無(wú)復(fù)流的發(fā)生。此外，PMN還可誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子和血管細(xì)胞黏附分子廣泛表達(dá)，促進(jìn)自身的黏附、滾動(dòng)、激活和浸潤(rùn)。

MPO是PMN的特異性標(biāo)志物[8]，通過(guò)測(cè)定MPO 的活性即可靈敏、定量地反映PMN 的含量及其在組織中的浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠心肌缺血再灌注后出現(xiàn)了明顯的梗死灶和無(wú)復(fù)流區(qū)，其MPO活性顯著增高，提示PMN大量浸潤(rùn)，與過(guò)往研究一致；而HES干預(yù)組的PMN心肌浸潤(rùn)明顯減輕，梗死程度和無(wú)復(fù)流面積均明顯減少，說(shuō)明HES不僅能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，還能通過(guò)減少PMN的心肌浸潤(rùn)抑制心肌無(wú)復(fù)流的發(fā)生。其機(jī)制可能與PMN參與的上述一系列炎癥反應(yīng)被抑制有關(guān)。此前，周大春等[9]就發(fā)現(xiàn) HES 通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化和細(xì)胞間黏附分子ICAM-1的表達(dá)、減少PMN的黏附與遷移來(lái)減輕鼠腎缺血再灌注損傷。Matharu 等[10]則觀察到 HES通過(guò)抑制 E-選擇素和 IL-8 的產(chǎn)生來(lái)抑制PMN的黏附和激活。陳雪君等[11]還發(fā)現(xiàn)HES 能抑制內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的產(chǎn)生和釋放從而減輕心肌缺血再灌注損傷。但HES具體通過(guò)經(jīng)何種途徑抑制上述分子的合成目前尚不清楚，可能涉及到HES對(duì)NF-κB活性的抑制[12]。

Figure 8.The apoptosis of microvascular endothelial cells detected by flow cytometry in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsH/R group.

圖8各組大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)

Figure 9.The intracellular calcium ion concentration ([Ca2+]i) of microvascular endothelial cells in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon group;#P<0.05vsH/R group.

圖9各組大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的比較

鈣是最常見(jiàn)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能影響重大。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞的[Ca2+]i增高時(shí)，除細(xì)胞損傷外，Ca2+還可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合并激活肌球蛋白輕鏈激酶，使肌球蛋白輕鏈磷酸化，進(jìn)而重建細(xì)胞骨架，引起細(xì)胞變形回縮。故通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i的升高，多形核白細(xì)胞可使內(nèi)皮細(xì)胞間隙增加[13]，有助于PMN的穿過(guò)和浸潤(rùn)。本研究進(jìn)一步進(jìn)行心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)缺氧/復(fù)氧組內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i顯著增加，且細(xì)胞凋亡率明顯增高，而HES處理組內(nèi)皮細(xì)胞的[Ca2+]i和細(xì)胞凋亡率均較缺氧/復(fù)氧組顯著降低，說(shuō)明HES能夠阻止缺氧/復(fù)氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i的增加，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。有趣的是，Ca2+作為第二信使，恰好可引起P-選擇素和細(xì)胞間黏附分子-I等在內(nèi)皮細(xì)胞的快速表達(dá)[14-15]，同時(shí)也是許多分子如IL-8、內(nèi)皮素和一氧化氮合酶等合成表達(dá)的重要調(diào)控物質(zhì)[16]，能夠促進(jìn)白細(xì)胞黏附、滾動(dòng)、穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及炎癥損傷的發(fā)生。HES能減低缺氧/復(fù)氧內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i，則其不僅能抑制內(nèi)皮細(xì)胞骨架改變，還能抑制Ca2+調(diào)控的細(xì)胞間黏附分子-1等上述分子的合成。這與過(guò)去報(bào)道的HES通過(guò)下調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1等表達(dá)抑制PMN激活、浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)的機(jī)制基本一致，提示了HES抑制PMN激活、浸潤(rùn)作用的具體途徑，可能與減低內(nèi)皮細(xì)胞[Ca2+]i，與線粒體功能恢復(fù)或離子通道改變等等有關(guān)。

此外，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加可激活磷脂酶類，促使膜磷脂降解，導(dǎo)致線粒體膜破壞，加重能量代謝障礙，引起細(xì)胞腫脹。腫脹的內(nèi)皮細(xì)胞在再灌注后2 h 之內(nèi)可大量出現(xiàn)，壓迫毛細(xì)血管，阻塞微循環(huán)。故HES或許還可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞 [Ca2+]i、減輕細(xì)胞腫脹來(lái)改善無(wú)復(fù)流。

總之，本實(shí)驗(yàn)證明HES可通過(guò)減少PMN心肌浸潤(rùn)、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載等途徑來(lái)減輕心肌缺血再灌注后心肌無(wú)復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生。這一工作對(duì)HES抗炎作用的具體機(jī)制進(jìn)行了補(bǔ)充，并為今后HES 應(yīng)用于AMI術(shù)后無(wú)復(fù)流現(xiàn)象防治新策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of HES 130/0.4 on no-reflow after myocardial ischemia-reperfusion injury in rats

HUANG Chong-an, HE Li-na, SUN Jia-li, YING An-na, YE Yong-ting, CAI Qi, YUAN Lin-bo, HUA Chun-yan

(DepartmentofPhysiology,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:yuanlinbo_2011@126.com；florshine@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects and mechanisms of hydroxyethylstarch (HES) 130/0.4 on no-reflow phenomenon after myocardial ischemia-reperfusion in rats. METHODS: SD rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group, ischemia-reperfusion (IR, treated with normal saline) group, normal saline ischemia-reperfusion (NS-IR, treated with NS) group and HES ischemia-reperfusion (HES-IR, treated with HES) group. Myocardial infarct size and no-reflow range were determined by staining methods, and the activities of myocardial enzymes (CK-MB, cTnI and MPO) were measured. Meanwhile, cardiac microvascular endothelial cells of the rat were cultured and divided into 4 groups: control group, hypoxia/reoxygenation (H/R) group, NS-H/R group and HES-H/R group. Acute ischemia reperfusion models were simulated, and the concentration of calcium ions was measured. The relative cell activity was evaluated by CCK-8 assay, and the apoptotic rate was detected by flow cytometry. RESULTS: In HES-IR group, the myocardial infarct size, the no-reflow zone, CK-MB, cTnI and MPO activity were all significantly lower than those in IR group (P<0.05). In microvascular endothelial cells, the concentration of calcium ions and the apoptotic rate in HES-H/R group were significantly decreased, while the relative cell activity increased compared with H/R group (P<0.05). CONCLUSION: HES reduces no-reflow in acute myocardial ischemia-reperfusion. The mechanism may be involved in the inhibition of both the infiltration of neutrophils and the calcium overload of endothelial cells.

[KEY WORDS]Hydroxyethylstarch; Myocardial reperfusion injury; No-reflow phenomenon; Myeloperoxidase; Calcium ions

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.005

[中圖分類號(hào)]R363.2; R541.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△袁琳波 Tel: 0577-86699521； E-mail: yuanlinbo_2011@126.com；花春艷 Tel: 0577-86689769; E-mail: florshine@163.com

*[基金項(xiàng)目]浙江省教育廳資助項(xiàng)目(No.Y201223758);溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.Y20140230);溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)生新苗課題(No.wyx201401024;No.wyx2015101072)

[收稿日期]2015- 09- 21[修回日期] 2015- 12- 11

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0411- 07

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