張　楊，　徐　菁△，　張翠明，　張　玲，　喬愛秀

(山西醫(yī)科大學(xué) 1病理教研室， 2第二醫(yī)院超聲診斷科，山西 太原 030001)

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Hedgehog信號通路抑制劑對肝內(nèi)膽管癌RBE細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

張楊1，徐菁1△，張翠明2，張玲1，喬愛秀1

(山西醫(yī)科大學(xué)1病理教研室，2第二醫(yī)院超聲診斷科，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 研究Hedgehog(Hh)信號通路特異性抑制劑環(huán)杷明(cyclopamine)對人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株RBE生物學(xué)行為的影響。方法: 用臺盼藍(lán)染色計數(shù)法和MTT比色法檢測環(huán)杷明對RBE細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率，Transwell檢測環(huán)杷明處理前后RBE細(xì)胞侵襲能力的變化，Western blot檢測環(huán)杷明處理前后RBE細(xì)胞中Gli1和MMP-9的蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果: 環(huán)杷明對RBE細(xì)胞株增殖的抑制作用呈劑量和時間依賴性。環(huán)杷明作用細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，RBE細(xì)胞凋亡率逐漸升高，明顯高于對照組的凋亡率。Transwell檢測對照組穿透細(xì)胞數(shù)為154.52±13.61，而實(shí)驗(yàn)組穿透數(shù)為62.00±12.17，侵襲能力明顯下降(P<0.01)。Gli1和MMP-9蛋白均在RBE細(xì)胞中表達(dá)，環(huán)杷明下調(diào)RBE細(xì)胞的Gli1和MMP-9表達(dá)。結(jié)論: 阻斷Hh信號通路能抑制RBE細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并抑制其侵襲能力。

[關(guān)鍵詞]Hedgehog信號通路； 膽內(nèi)膽管細(xì)胞癌； 環(huán)杷明

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是一種來源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其具有發(fā)生隱匿、發(fā)展迅速、惡性度高、臨床預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。近年來其發(fā)病率有逐年升高的趨勢，雖然傳統(tǒng)的治療方法取得了較大進(jìn)展，但是患者的預(yù)后并無明顯改善。因此，從基因水平充分了解膽管細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，鑒定明確的靶標(biāo)基因，這對膽管細(xì)胞癌進(jìn)行早期診斷、預(yù)防和臨床靶向治療具有十分重要的意義。

我們前期實(shí)驗(yàn)通過采用人全基因組表達(dá)譜芯片和RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)信號通路在ICC細(xì)胞株RBE中呈高度激活狀態(tài)[2]，說明Hh信號通路的異?；罨c肝內(nèi)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Hh信號通路主要由配體Sonic hedgehog (Shh) 、膜受體Patched (Ptch)、信號開關(guān)蛋白Smoothened(Smo)及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli組成[3]。正常表達(dá)的Hh信號在器官發(fā)育和器官修復(fù)再生過程中起著重要作用[4]，但持續(xù)異常激活的Hh信號可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通利用Hh下游分子Smo的特異性阻斷劑——環(huán)杷明(cyclopa-mine)，抑制Hh信號通路的活性，進(jìn)而觀察其對膽管癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響，旨在為膽管癌的臨床診斷、治療以及預(yù)后提供依據(jù)。

材料和方法

1材料與試劑

人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系RBE細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；環(huán)杷明購自Selleckchem；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Transgen biotech；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自Sigma；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物技術(shù)公司；Transwell培養(yǎng)板購自Corning；Matrigel基質(zhì)膠購自BD；Gli-1單克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品；基質(zhì)金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)單克隆抗體為Abcam產(chǎn)品。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)將RBE細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞計數(shù)法檢測環(huán)杷明對RBE細(xì)胞增殖的影響收集對數(shù)生長期細(xì)胞按1×104/cm2接種于6孔板，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時加入不同濃度(5、10、15、20、40 μmol/L)環(huán)杷明。處理細(xì)胞24 h后胰酶消化各孔細(xì)胞并用臺盼藍(lán)染色計數(shù)。活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。方法同上，選取20 μmol/L環(huán)杷明作用于RBE細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后進(jìn)行臺盼藍(lán)計數(shù)，計算活細(xì)胞率。

2.3MTT法檢測環(huán)杷明對RBE細(xì)胞活力的影響胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞制成 5×107/L細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)組分別加入5、10、15、20、40 μmol/L濃度的環(huán)杷明(無水乙醇稀釋)，陰性對照組不加環(huán)杷明，每種濃度均設(shè)5個復(fù)孔；空白對照組僅加入等體積培養(yǎng)液。作用24 h后，每孔加入MTT (5 g/L)10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL的DMSO，室溫振蕩10 min。酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%。方法同上，選取20 μmol/L環(huán)杷明作用于RBE細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后進(jìn)行MTT法檢測，計算抑制率。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測環(huán)杷明對RBE細(xì)胞凋亡的影響待培養(yǎng)瓶中RBE細(xì)胞貼壁生長后，分別加入含有20 μmol/L環(huán)杷明的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，依照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測。

2.5Transwell侵襲小室法檢測環(huán)杷明對RBE細(xì)胞體外侵襲能力的影響胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞制成懸液，設(shè)置不加藥對照組，實(shí)驗(yàn)組用含5 μmol/L環(huán)杷明的無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，8 μm孔徑的聚碳酸酯膜用Matrigel膠進(jìn)行包被，具體方法按參考文獻(xiàn)[5]操作，在400倍顯微鏡下隨機(jī)5個視野觀察細(xì)胞，記數(shù)，結(jié)果求平均數(shù)。

2.6Western blot法檢測環(huán)杷明對RBE細(xì)胞Gli1蛋白及MMP-9蛋白表達(dá)的影響將RBE細(xì)胞分別用5 μmol/L的環(huán)杷明處理24 h、48 h后收集細(xì)胞，依照BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取總蛋白并測其濃度。20%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，添加Gli1和MMP-9的 I 抗過夜，洗膜，加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗，室溫下結(jié)合2 h，ECL顯影，掃描膠片并分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用t檢驗(yàn)及單因素方差分析比較組間差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1環(huán)杷明對RBE細(xì)胞增殖和活力的影響

RBE細(xì)胞經(jīng)環(huán)杷明作用后，在相差倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其生長減慢、細(xì)胞變小變圓、細(xì)胞間連接減少或消失、部分細(xì)胞皺縮、核固縮現(xiàn)象明顯、出現(xiàn)較多懸浮的單個細(xì)胞，且濃度越高、時間越長這種變化越明顯。臺盼藍(lán)計數(shù)及MTT檢測不同濃度的環(huán)杷明調(diào)控Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對RBE細(xì)胞的影響，濃度在5～40 μmol/L有明顯的抑制作用,顯示一定的濃度依賴性(圖1)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。選取20 μmol/L濃度環(huán)杷明作用于細(xì)胞，可以發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)杷明作用于RBE細(xì)胞時間的延長，細(xì)胞的生長能力有明顯下降(圖2)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。由此可見，在一定范圍內(nèi)隨著濃度的增高和作用時間的延長，環(huán)杷明對膽管癌細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯。

Figure 1.The effects of cyclopamine at different concentrations on the proliferation (A； cell counting) and the inhibition of viability (B； MTT assay) of RBE cells after 24 h. Mean±SD.n=5.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1不同濃度環(huán)杷明對RBE細(xì)胞增殖和活力的影響

2環(huán)杷明對RBE細(xì)胞凋亡的影響

環(huán)杷明可以明顯促進(jìn)RBE細(xì)胞的凋亡，且隨著作用時間的增加，凋亡率也逐漸增加。環(huán)靶明作用于RBE細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(30.61±1.54)%、(47.62±2.07)% 和(63.39±2.48)%，與對照組相比，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。

3環(huán)杷明對RBE細(xì)胞侵襲能力的影響

5 μmol/L環(huán)杷明處理的RBE細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。環(huán)杷明處理組每400倍視野計數(shù)RBE細(xì)胞的穿透數(shù)為62.00±12.17，而陰性對照組的穿透數(shù)為154.52±13.61，2組相比差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖4。

Figure 2.The effects of cyclopamine for different time on the proliferation (A； cell counting) and the inhibition of viability (B； MTT assay) of RBE cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vs0 h group.

圖220 μmol/L環(huán)杷明作用不同時間對RBE細(xì)胞增殖和活力的影響

4環(huán)杷明對RBE細(xì)胞Gli1蛋白及MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果用軟件Alpha View經(jīng)灰度值分析后顯示，肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞株RBE存在Gli1和MMP-9的蛋白高表達(dá)。環(huán)杷明處理后，Gli1和MMP-9的蛋白表達(dá)有下調(diào)趨勢(P<0.05)，且隨著時間的增加表達(dá)降低，見圖5。

討論

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌是僅次于肝細(xì)胞癌的肝臟第2大惡性腫瘤，起源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞。其傳統(tǒng)手術(shù)治療復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[1]。隨著ICC發(fā)病率的提高，對其進(jìn)行早期診斷和治療已十分重要。已有研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin、TGF-β、Notch和Hh信號通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并且這些通路可以作為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[6]。我們前期實(shí)驗(yàn)[2]已經(jīng)證實(shí)Hh信號通路的異常活化與肝內(nèi)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此，對其靶向性阻斷有可能成為治療ICC的新手段。

Figure 3.The effects of cyclopamine on cell apoptosis of RBE. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h group;#P<0.05vs24 h group;△P<0.05vs48 h group.

圖320 μmol/L環(huán)杷明對RBE細(xì)胞凋亡的影響

高度保守的Hh信號通路在早期器官發(fā)育和成人組織維護(hù)及修復(fù)功能中起著重要的作用。通過Hh配體和受體Patched1結(jié)合，激活Hh信號通路，解除對Smo的抑制作用，Smo激活Gli，Gli轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，最終激活目的靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)染色體形成、細(xì)胞周期活動、細(xì)胞運(yùn)動和凋亡[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤都與Hh信號通路的異常激活有關(guān)，如結(jié)腸癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌[9]。特異性阻斷劑環(huán)杷明可以抑制由Hh信號引起的細(xì)胞反應(yīng)。目前，關(guān)于Hh信號通路在ICC發(fā)生發(fā)展中的作用及環(huán)杷明對肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響作用的文獻(xiàn)報道甚少。本實(shí)驗(yàn)以肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系RBE為研究對象，通過觀察環(huán)杷明對肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為ICC的臨床診斷、治療及預(yù)后提供依據(jù)。

Figure 4.The effects of cyclopamine on invasion ability of RBE cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vswithout cyclopamine.

圖4環(huán)杷明對RBE細(xì)胞侵襲能力的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明可以抑制RBE細(xì)胞Hh信號通路的激活。既往研究證實(shí)環(huán)杷明是一種對Hh通路有效的藥物，它主要通過對抗Hh下游分子Smo而抑制Hh信號通路的活性，但并不是一種全身性的化療藥物，對機(jī)體的其它部位不會產(chǎn)生副作用[10]。而Gli1是Hh信號通路Smo下游的一個重要因子，起著承上啟下的關(guān)鍵性調(diào)控作用[11]。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)過環(huán)杷明處理的RBE細(xì)胞Gli1的表達(dá)顯著降低，抑制了Hh信號通路的激活，與既往研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，環(huán)杷明處理后，RBE細(xì)胞變小變圓、生長緩慢、細(xì)胞間連接減少或消失、部分細(xì)胞皺縮、核固縮現(xiàn)象明顯、出現(xiàn)較多懸浮的單個細(xì)胞，且濃度越高這種變化越明顯。MTT檢測結(jié)果顯示其能顯著抑制RBE細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性；凋亡檢測結(jié)果顯示其促進(jìn)RBE細(xì)胞凋亡，且隨著作用時間的延長，凋亡增加明顯。上述結(jié)果提示，Hh信號分子對RBE細(xì)胞的增殖起維持作用，阻斷該信號通路可以抑制膽管癌細(xì)胞RBE的生長與增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Thayer等[12]和Berman等[13]在胰腺癌和胃癌細(xì)胞株等消化道腫瘤中也得出了相似的結(jié)論，上述研究表明用環(huán)杷明處理癌細(xì)胞,可能會導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖降低，凋亡增加。其可能的機(jī)制為環(huán)杷明通過對抗Smo而抑制了其下游的Gli，使得PDGFRα和Bcl-2表達(dá)下調(diào)；Fas和DR5表達(dá)上調(diào)，而Fas和DR5有凋亡誘導(dǎo)活性，Bcl-2則可通過多種途徑抑制凋亡[14]。其抑制增殖的作用可能與其促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Figure 5.The effects of cyclopamine for different time on Gli1 and MMP-9 protein expression in RBE cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vs24 h group.

圖5環(huán)杷明對RBE細(xì)胞Gli1蛋白及MMP-9蛋白表達(dá)的影響

基膜和細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤轉(zhuǎn)移的屏障，因此MMPs對它們的降解在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。MMP-9屬明膠酶類, 是能夠降解IV型膠原的主要基質(zhì)水解酶，參與體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移，其表達(dá)增加與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)過環(huán)杷明處理的RBE細(xì)胞MMP-9的表達(dá)顯著降低，說明環(huán)杷明可能通過抑制MMP-9的表達(dá)而使RBE細(xì)胞的侵襲和遷移能力降低。Transwell實(shí)驗(yàn)也得出了相同的結(jié)論。上述結(jié)果提示，通過特異性阻斷Hh信號通路，可以抑制膽管癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。

總之，Hh信號通路的活性與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在ICC中Hh信號通路異常激活，通過特異性抑制Hh信號傳遞可以達(dá)到分子靶向治療ICC的目的。2012年1月，GDC-0449(Smo合成抑制劑)被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期基底細(xì)胞癌[16]，而環(huán)杷明作為Hh信號通路抑制劑靶向Smo，可能成為一種新的化療藥物。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Effect of Hedgehog signaling pathway inhibitor on biological behavior of intrahepatic cholangiocarcinoma cell line RBE

ZHANG Yang1, XU Jing1, ZHANG Cui-ming2, ZHANG Ling1, QIAO Ai-xiu1

(1DepartmentofPathology，2DepartmentofUltrasound，ThesecondAffiliatedHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001，China.Email:xuj766@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of cyclopamine, a Hedgehog (Hh) signaling pathway inhibitor, on the biological behavior of intrahepatic cholangiocarcinoma cell line RBE. METHODS: The proliferation of RBE cells was detected by cell counting with Typan blue staining and MTT assay, and the apoptosis was analyzed by the flow cytometry. The Transwell invasive cabin assay was used to detect the invasion ability, and Western blot was used to determine the protein expression of Gli1 and MMP-9 in the RBE cells before and after cyclopamine treatment. RESULTS: Cyclopamine inhibited the growth of RBE cells in a time- and dose-dependent manner. After cyclopamine treatment for 24 h, 48 h and 72 h, the apoptotic rates were significantly higher than those in control group. In control group, the number of cells invading through the Matrigel of invasion chamber was 154.52±13.61, while in experimental group it was 62.00±12.17, indicating that the invasion ability of the cells declined significantly. Furthermore, Western blot showed that the protein levels of Glil and MMP-9 in the RBE cells were decreased after treatment with cyclopamine for 24 h and 48 h. CONCLUSION: Blockage of the Hh signaling pathway with cyclopamine suppresses the proliferation, promotes the apoptosis and inhibits the invasion ability of RBE cells.

[KEY WORDS]Hedgehog signaling pathway; Intrahepatic cholangiocarcinoma; Cyclopamine

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.026

[中圖分類號]R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0351-4135642； E-mail: xuj766@163.com

*[基金項(xiàng)目]山西省回國留學(xué)人員科研項(xiàng)目(No.2011-046)；山西省留學(xué)回國人員科技活動擇優(yōu)資助項(xiàng)目(No.2011-762)；山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院331基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科技培植基金計劃項(xiàng)目(No.201407)；山西醫(yī)科大學(xué)校創(chuàng)新基金(No.01201302)

[收稿日期]2015- 10- 29[修回日期] 2016- 01- 08

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0544- 05

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