桃子璽，　范挽亭，　李　娟，　黃世光

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632)

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TLR2和TLR4在人慢性根尖周病組織肥大細(xì)胞上的表達(dá)*

桃子璽▲，范挽亭▲，李娟，黃世光△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 觀察人不同類型慢性根尖周病組織中肥大細(xì)胞(mast cells, MCs)上Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和TLR4的表達(dá)情況，探討TLR2-類胰蛋白酶(tryptase)和TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs在慢性根尖周疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。方法: 將60例自愿參與本研究的受試者按根尖周病分類標(biāo)準(zhǔn)分為3組：(1)正常對(duì)照組；(2)根尖周肉芽腫組；(3)根尖周囊腫組。將根尖周組織標(biāo)本置于4%甲醛固定液中浸泡48 h以上，制作連續(xù)組織切片。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組根尖周標(biāo)本的組織學(xué)變化；免疫熒光雙染色后于熒光顯微鏡下觀察TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs在根尖周組織中的分布情況。結(jié)果: 根尖周病變組TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs比正常牙周膜組明顯增多(P<0.01)；與根尖肉芽腫組相比，根尖囊腫組TLR2-tryptase及TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs數(shù)目明顯增高(P<0.01)。結(jié)論: TLR2及TLR4在慢性根尖周疾病組織中MCs上表達(dá)增加，提示TLR2-tryptase及TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs可能參與慢性根尖周病發(fā)病過程的免疫調(diào)節(jié)。

[關(guān)鍵詞]慢性根尖周??； 肥大細(xì)胞； Toll樣受體2； Toll樣受體4

慢性根尖周疾病是口腔常見疾病之一，主要由來源于感染根管的細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物擴(kuò)散至根尖周組織所致，表現(xiàn)為根尖周組織的炎癥與骨吸收。傳統(tǒng)認(rèn)為，肥大細(xì)胞(mast cells, MCs)是過敏性炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，近年的研究發(fā)現(xiàn)， MCs作為效應(yīng)和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在固有免疫的建立和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]。我們前期研究結(jié)果顯示MCs的募集和脫顆粒、肥大細(xì)胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)與牙周病及其炎癥程度密切相關(guān)，肥大細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和干細(xì)胞因子在慢性根尖周疾病致病過程，尤其在根尖周囊腫的纖維組織形成中發(fā)揮重要作用；提示MCs在牙周病的發(fā)病及病理過程中起重要作用，SCF-tryptase及TGF-β-tryptase雙陽(yáng)性MCs與慢性周病的炎癥損害有關(guān)[2-5]。TLR2和TLR4作為TLRs家族的重要成員，能夠識(shí)別各種病原微生物表達(dá)的病原識(shí)別受體(pathogen recognition receptors, PRRs)，屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體[6]，能廣泛識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。已有研究證實(shí)在人類根尖周病變組織中有TLR2和TLR4表達(dá)，提示TLR2和TLR4在機(jī)體對(duì)病原體免疫識(shí)別，以及固有免疫和適應(yīng)性免疫過程中發(fā)揮著重要作用。目前，關(guān)于TLR2和TLR4在MCs上的表達(dá)及其在慢性根尖周病發(fā)病機(jī)制中作用尚未見報(bào)道。本文通過免疫熒光雙染色法，觀察不同類型人慢性根尖周炎組織中MCs上TLR2與TLR4表達(dá)情況，探討MCs的TLR2和TLR4在根尖周感染中的作用及機(jī)制。

材料和方法

1研究對(duì)象

1.1根尖周病例選擇慢性根尖周炎病例選擇2013年7月～2014年6月在暨南大學(xué)荔灣口腔教學(xué)醫(yī)院就診的15～62歲患者共60例，其中男性27例，(32.0±15.5)歲，女性33例，(30.0±14.2)歲，所有患者均排除患有系統(tǒng)性疾病，就診時(shí)為非急性炎癥期，且2個(gè)月內(nèi)沒使用過抗生素，所有患者均簽署知情同意書。

1.2分組及取材(1)正常對(duì)照(control)組：取自因正畸治療需要拔除的根尖周組織健康且牙根發(fā)育完全的前磨牙的根尖牙周膜組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：活髓牙；X線顯示根尖區(qū)未見低密度的透射影；牙周膜光滑連續(xù)且拔牙過程未傷及根尖區(qū)牙周膜；組織學(xué)觀察未見毛細(xì)血管增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。(2)根尖周肉芽腫(periapical granuloma)組：取自因根尖周病變無法通過非手術(shù)方法治愈須行根尖刮治術(shù)獲取的根尖周組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：非活髓牙；X線顯示患牙的根尖區(qū)有圓形或橢圓形邊界清晰的低密度透射影，直徑≤1 cm；手術(shù)過程中發(fā)現(xiàn)根尖區(qū)存有病變實(shí)性軟組織；組織學(xué)觀察顯示根尖周病變組織為肉芽組織團(tuán)塊，伴毛細(xì)血管增生及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。(3)根尖周囊腫(periapical cyst)組：取自因根尖周病變無法通過非手術(shù)方法治愈須行刮治術(shù)的根尖周組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：非活髓牙；X線顯示患牙的根尖區(qū)有圓形或橢圓形低密度透射影，直徑≥1 cm，邊緣有明顯的白色阻射線；手術(shù)過程中發(fā)現(xiàn)根尖區(qū)病變組織為內(nèi)含液體或半固體的囊性組織；組織學(xué)觀察顯示根尖周病變組織含大量的膠原纖維，為非角化復(fù)層鱗狀上皮完全或部分覆蓋的囊腔或組織。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1組織標(biāo)本采集、處理與觀察根尖肉芽腫和根尖囊腫標(biāo)本是在根尖刮治手術(shù)時(shí)取得的根尖周病變組織。正常對(duì)照組標(biāo)本取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，用無菌刀片將牙周膜從牙根上刮取。樣本取出后立即固定于4%甲醛中浸泡48 h以上，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備成5 μm厚度連續(xù)組織切片。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組標(biāo)本的組織學(xué)改變。

2.2TLR2和TLR4陽(yáng)性MCs免疫熒光雙染色Ⅰ抗: tryptase 抗體(Abcam)，稀釋濃度為1∶200；TLR2和TLR4 抗體(武漢博士德)稀釋濃度為1∶100。Ⅱ抗: 山羊抗鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 488 和山羊抗兔IgG(H+L)Alexa Fluor 555(CST)，稀釋濃度為1∶200。DAPI(MP Biomedicals)，稀釋濃度1∶200。組織切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、乙醇復(fù)水，檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)、山羊血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色后，立即在熒光顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照組用PBS代替Ⅰ抗和Ⅱ抗，DAPI核染，立即在熒光顯微鏡下觀察。Tryptase 免疫熒光陽(yáng)性信號(hào)為綠色熒光，TLR2和TLR4信號(hào)均顯示紅色熒光，定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜，同一視野下tryptase 綠色熒光分別與TLR2和TLR4 紅色熒光重疊后為橘色熒光，DAPI 信號(hào)顯示為藍(lán)色，定位于細(xì)胞核。由2 名病理醫(yī)師于免疫熒光顯微鏡下觀察到MCs 均表達(dá)有TLR2 和TLR4，從而對(duì)各組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中TLR2和TLR4陽(yáng)性MCs 計(jì)數(shù)并計(jì)算各組TLR2 和TLR4 陽(yáng)性MCs 密度(cells/mm2)。每張切片在高倍鏡下(×400)選取橘色熒光最多的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野中TLR2和TLR4陽(yáng)性的MCs的密度(cells/mm2)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0分析處理。各組標(biāo)本組織中TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs平均密度的比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，采用Nemenyi 檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1組織學(xué)觀察

正常對(duì)照組：根尖周牙周膜組織結(jié)構(gòu)完整，纖維組織豐富，以成纖維細(xì)胞為主，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；根尖肉芽腫組：根尖周牙周膜組織結(jié)構(gòu)破壞，主要由新生的毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞和浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞構(gòu)成，部分病變內(nèi)部見上皮條索及上皮島；根尖周囊腫組：根尖周牙周膜組織結(jié)構(gòu)破壞，毛細(xì)血管擴(kuò)張，鏡下可見根尖周囊腫組織上皮層表現(xiàn)為細(xì)胞間水腫，上皮層下方見大量慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；纖維組織層以膠原纖維為主，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)部分囊壁內(nèi)見含鐵血黃素和膽固醇晶體沉積的梭形間隙，見圖1。

Figure 1.Histology of human periapical tissues(HE staining, ×400). A: healthy control; B: periapical granuloma; C: the epithelial layer of periapical cyst; D: the fibrous tissue area of periapical cyst.

圖1各實(shí)驗(yàn)組組織學(xué)觀察

2TLR2陽(yáng)性MCs免疫熒光雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs 免疫熒光雙染色結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，各組標(biāo)本組織MCs 均表達(dá)TLR2。正常對(duì)照組：根尖周牙周膜組織中見少量散在分布的TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs；根尖肉芽腫組：與正常對(duì)照組對(duì)比，根尖周組織中可見TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs 數(shù)目顯著增多，且MCs 有脫顆粒現(xiàn)象；根尖囊腫組：根尖周病變組織中出現(xiàn)大量的TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs，且MCs 伴明顯脫顆粒現(xiàn)象；各組標(biāo)本組織的陰性對(duì)照組均未見TLR2和tryptase陽(yáng)性表達(dá)，可見DAPI核染，見圖3。

各組標(biāo)本組織中TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs密度的比較見圖4，結(jié)果顯示：2組慢性根尖周病組織中TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs的數(shù)量較正常對(duì)照組明顯增多(P<0.01)；根尖周囊腫組TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs的數(shù)量較根尖周肉芽腫組明顯增多(P<0.01)。

各標(biāo)本組織中TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs及脫顆粒MCs密度比較見圖5。與正常對(duì)照組相比，2組慢性根尖周病組織中MCs密度及脫顆粒MCs密度顯著上升(P<0.01)，且根尖囊腫組的MCs密度及脫顆粒MCs明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)。

3TLR4陽(yáng)性MCs免疫熒光雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs 免疫熒光雙染色結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，各組標(biāo)本組織MCs 均表達(dá)TLR4。正常對(duì)照組牙周膜組織中見少量散在分布的TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs；根尖肉芽腫組組織中TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs數(shù)目顯著增多，且MCs有脫顆粒現(xiàn)象；根尖囊腫組組織中出現(xiàn)大量的TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs，且MCs伴明顯脫顆?，F(xiàn)象；各組標(biāo)本組織的陰性對(duì)照組均未見TLR4和tryptase陽(yáng)性表達(dá)，可見DAPI核染，見圖7。

Figure 2.TLR2-tryptase double-positive mast cells in human gingival tissues (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖2各實(shí)驗(yàn)組中TLR2-tryptase雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞

Figure 3.Negative control group for TLR2 and tryptase staining (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖3TLR2 和tryptase染色的陰性對(duì)照組

Figure 4.The density of TLR2-tryptase positive MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;##P<0.01vsperiapical granuloma.

圖4各組標(biāo)本組織中TLR2-tryptase雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞密度的比較

各組標(biāo)本組織中TLR4-tryptase 雙陽(yáng)性MCs 密度見圖8，結(jié)果顯示：2組慢性根尖周病組織中TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs的數(shù)量較正常對(duì)照組明顯增多(P<0.01)；根尖周囊腫組TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs的數(shù)量較根尖周肉芽腫組明顯增多(P<0.01)。

各標(biāo)本組織中tryptase陽(yáng)性MCs及脫顆粒MCs密度比較見圖9。與正常對(duì)照組相比，2組慢性根尖周病組織中MCs密度及脫顆粒MCs密度顯著上升(P<0.01)，且根尖囊腫組的MCs密度及脫顆粒MCs明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)。

討論

目前研究認(rèn)為，根尖周疾病的發(fā)病與革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌混合感染相關(guān)[7]。感染根管的細(xì)菌或細(xì)菌毒素?cái)U(kuò)散侵入根尖周組織區(qū)域，啟動(dòng)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生一系列引起根尖周局部組織損傷的介質(zhì)[8]。根尖周組織抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells, APCs)通過對(duì)病原微生物PRRs進(jìn)行特異性抗原識(shí)別，上調(diào)共刺激分子并分泌細(xì)胞因子，從而激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[9]。研究顯示，在健康根尖周組織中僅有少量APCs存在；受病原微生物入侵刺激，根尖周組織中APCs的表達(dá)明顯增加[7]。

Figure 5.Density of TLR2-tryptase positive MCs and degranulated MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;#P<0.05vsperiapical granuloma.

圖5各標(biāo)本組織中TLR2-tryptase雙陽(yáng)性MCs及脫顆粒MCs密度的比較

MCs是機(jī)體固有免疫細(xì)胞，參與特殊炎癥反應(yīng)或機(jī)體防御反應(yīng)，發(fā)揮多種免疫功能[10]。研究證實(shí)MCs能表達(dá)多種PRRs，包括TLRs。MCs通過其表面的TLRs，如TLR2和TLR4識(shí)別廣泛的PAMPs，此過程與其抗菌防御和炎癥反應(yīng)的進(jìn)展密切相關(guān)[11-12]。MCs可被TLRs激活劑直接激活，合成分泌TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-8等細(xì)胞因子；此外，TLRs活化也可引起MCs脫顆粒，釋放組胺、蛋白酶、趨化因子等細(xì)胞介質(zhì)。TLR受體信號(hào)通路已被證實(shí)與FcεRI通路間有交聯(lián)反應(yīng)，兩者協(xié)同調(diào)節(jié)MCs的功能[13]。Konopka等[14]體外實(shí)驗(yàn)顯示，TLRs和FcεRI同時(shí)活化可促使MCs釋放細(xì)胞因子。

Figure 6.TLR4-tryptase double-positive mast cells in human gingival tissues (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖6各實(shí)驗(yàn)組中TLR4-tryptase雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞

Figure 7.Negative control group for TLR4 and tryptase staining (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖7TLR4T和tryptase染色的陰性對(duì)照組

TLRs活化導(dǎo)致多效應(yīng)分子的釋放，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、抗菌肽，起到抑制病原體的作用[15]。TLR2能與TLR1或TLR6形成功能性復(fù)合體[16-17]，識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌肽聚糖(PGN)及脂磷壁酸(LTA)、革蘭氏陰性菌脂蛋白脂肽、牙齦卟啉單胞菌非典型脂多糖等。糞腸球菌是難治性根尖周病根管內(nèi)主要細(xì)菌，能使人成牙本質(zhì)細(xì)胞中TLR2/TLR1復(fù)合體的活化[18]。在以T淋巴細(xì)胞為主導(dǎo)的慢性根尖肉芽腫中，在CD4+CD3+CD14-T細(xì)胞上有TLR2表達(dá)[19]。TLR4是最先被發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物的TLRs，其主要配體是革蘭氏陰性菌的LPS[20]。TLR4能與髓樣細(xì)胞分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2, MD2)，形成復(fù)合物發(fā)揮作用，參與LPS信號(hào)的識(shí)別和轉(zhuǎn)導(dǎo)，這在MCs上有所表現(xiàn)[21]。Vosskuhl 等[22]研究表明，經(jīng)TLR4激活的MCs，能夠使自然殺傷細(xì)胞的干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌量增長(zhǎng)20倍，增強(qiáng)MCs在固有免疫調(diào)控中的作用。

Figure 8.The density of TLR4-tryptase positive MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;##P<0.01vsperiapical granuloma.

圖8各組標(biāo)本組織中TLR4-tryptase雙陽(yáng)性肥大細(xì)胞密度的比較

Figure 9.Density of TLR4-tryptase positive MCs and degranulated MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;#P<0.05vsperiapical granuloma.

圖9各標(biāo)本組織中TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs及脫顆粒MCs密度的比較

本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs的數(shù)量在慢性根尖周病組織中較正常牙周膜組的數(shù)量顯著增多，而TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs在根尖囊腫組的數(shù)量明顯多于根尖肉芽腫組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是該領(lǐng)域的首次發(fā)現(xiàn)，提示TLR2-tryptase與TLR4-tryptase雙陽(yáng)性MCs在根尖周病的發(fā)病中具有重要作用。因此，通過調(diào)控肥大細(xì)胞Toll樣受體可能成為阻止根尖周病發(fā)展的一個(gè)治療目標(biāo)，從而為根尖周病的治療提供新的方向。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

Expression of TLR2 and TLR4 on mast cells in human chronic periapical diseases

TAO Zi-xi, FAN Wan-ting, LI Juan, HUANG Shi-guang

(FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thshg@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the expression of TLR2 and TLR4 on mast cells (MCs) in the periapical tissues from different types of human chronic periapical diseases, and to analyze the role of TLR2 and TLR4 on tryptase-positive MCs in the immunopathogenesis of human chronic periapical diseases. METHODS: A total of 60 donors, including healthy control group, periapical granuloma group and periapical cyst group, were enrolled in the study. The periapical tissue specimens were fixed in 10% buffered formalin and stained with hematoxylin and eosin for histopathology, or stained with double-immunofluorescence for identification of TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs in the periapical tissues. RESULTS: Compared with the healthy control, the densities of TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs in periapical tissues were significantly increased in human chronic periapical diseases (P<0.01). The densities of TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs in periapical cyst group were significantly higher than those in periapical granuloma group (P<0.01). CONCLUSION: TLR2 and TLR4 were expressed on the MCs in the periapical tissues of human chronic periapical diseases. TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs may participate in the pathogenesis of chronic periapical diseases.

[KEY WORDS]Chronic periapical diseases; Mast cells; Toll-like receptor 2; Toll-like receptor 4

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.021

[中圖分類號(hào)]R781

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

*[基金項(xiàng)目]廣東省社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃 (No. 2013B021800043； No. 2014A020212212)

[收稿日期]2015- 08- 31[修回日期] 2015- 09- 30

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0516- 06

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