張雪嬌，　劉嘉琳,2，　楊　飛，　婁永富，　王　強(qiáng)，　陳冬志，　孟　明△

(1河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，河北 保定 071000; 2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

?

葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶混合肽段誘導(dǎo)的DBA/1小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的建立*

張雪嬌1，劉嘉琳1,2，楊飛1，婁永富1，王強(qiáng)1，陳冬志1，孟明1△

(1河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，河北 保定 071000;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

[摘要]目的： 利用葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)單一肽段及混合多肽片段免疫DBA/1小鼠，建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型，分析其主要評(píng)價(jià)指標(biāo)及特點(diǎn)，為探討RA的免疫機(jī)制及治療提供新的理想動(dòng)物模型。方法: hGPI325-339、hGPI469-483多肽片段和hGPI325-339單一肽段分別與完全弗氏佐劑充分乳化后，于小鼠尾根部皮下注射進(jìn)行造模，并從體重變化、足踝關(guān)節(jié)癥狀評(píng)分、足踝關(guān)節(jié)病理改變、外周血及脾組織CD4+T細(xì)胞的表達(dá)、外周血iNKT細(xì)胞比例以及血清TNF-α和IL-6水平等方面進(jìn)行模型鑒定及分析。結(jié)果: 模型小鼠在造模第8 天，后爪最先出現(xiàn)紅腫，逐漸加重累及四肢，第14 天紅腫達(dá)到高峰，足踝腫脹，行動(dòng)不利，此后開(kāi)始逐漸緩解；組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)足踝關(guān)節(jié)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞為主，漿細(xì)胞少量出現(xiàn)，混合肽段的炎癥狀況明顯強(qiáng)于單肽片段。與健康對(duì)照組和單肽片段模型組相比，混合肽段模型組體重增長(zhǎng)緩慢；外周血、脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯增多；炎癥高峰期外周血iNKT細(xì)胞比例下降明顯(P<0.05)，血清中TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)論: 混合GPI肽段誘導(dǎo)的RA模型小鼠在免疫學(xué)特征，特別是iNKT細(xì)胞免疫病理方面與RA患者尤為接近，可作為RA免疫機(jī)制研究和治療的良好工具。

[關(guān)鍵詞]DBA/1小鼠； 葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶； 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎； iNKT細(xì)胞

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因復(fù)雜的慢性自身免疫性疾病，以慢性、進(jìn)行性、侵襲性為特點(diǎn)，具有高患病率、高致殘率，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且缺乏特效藥物和治療方法。近年發(fā)現(xiàn)恒定自然殺傷T細(xì)胞(invariant nature killer T cells，iNKT細(xì)胞)是T細(xì)胞的一個(gè)亞群，表達(dá)CD4+膜分子，具有調(diào)控炎性因子釋放的功能，與RA發(fā)病密切相關(guān)。通過(guò)研究iNKT細(xì)胞在RA中的作用機(jī)制，有可能發(fā)現(xiàn)RA治療的新靶標(biāo)。

理想動(dòng)物模型的建立對(duì)于RA發(fā)病機(jī)制研究和治療具有重要意義。目前應(yīng)用廣泛且較成熟的整體動(dòng)物模型有膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、佐劑性關(guān)節(jié)炎、酵母多糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、多聚糖蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎等十幾種[2-4]，但尚無(wú)一種模型可以完全模擬人RA的所有特征。根據(jù)研究目的構(gòu)建合理的動(dòng)物模型顯得尤為重要。葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)被認(rèn)為是廣泛應(yīng)用于RA診斷及判斷活動(dòng)性的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，利用重組人的GPI作為抗原可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生與人RA病變特點(diǎn)相似的關(guān)節(jié)炎癥[5]。相比膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎 (collagen-induced arthritis，CIA)模型，在對(duì)CD4+T細(xì)胞的依賴性和對(duì)生物制劑反應(yīng)性方面，GPI誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎更加接近人RA特點(diǎn)[6]。Lisa 等[7]報(bào)道GPI325-339和GPI469-483作為GPI的活性肽片段，可誘導(dǎo)DBA/1小鼠RA的發(fā)生，但單一肽段的誘導(dǎo)效果不如整個(gè)GPI蛋白。根據(jù)結(jié)構(gòu)免疫學(xué)，不同肽段有不同的作用靶點(diǎn)，由此推測(cè)GPI325-339和GPI469-483可能通過(guò)結(jié)合不同的靶點(diǎn)參與RA的病理發(fā)生。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用hGPI325-339和hGPI469-483的混合多肽片段以及hGPI325-339單一肽段分別免疫DBA/1小鼠，并從體重變化、足踝關(guān)節(jié)癥狀評(píng)分、足踝關(guān)節(jié)病理改變、外周血及脾組織CD4+T細(xì)胞的表達(dá)、外周血iNKT細(xì)胞比例以及血清中細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平等多方面進(jìn)行模型鑒定及特點(diǎn)分析，為深入RA的免疫病理研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1動(dòng)物

DBA/1小鼠45只，雄性，8周齡，體重(20±1) g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2014-0004，SPF級(jí)飼養(yǎng)。

2主要試劑與儀器

多肽片段hGPI325-339(IWYINCFGCETHAML)和hGPI469-483(EGNRPTNSIVFTKLT)由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；百日咳毒素(P7208)和完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)購(gòu)自Sigma；兔抗鼠CD4抗體購(gòu)自Santa Cruz；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PerCP標(biāo)記的CD3抗體、FITC標(biāo)記的CD4抗體、微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(CBA)Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒和紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自BD；PE標(biāo)記的T-selected CD1d Tetramer購(gòu)自MBL；α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(α-galactosylceramide,α-GalCer)購(gòu)自ENZO；熒光倒置顯微鏡(Olympus)；流式細(xì)胞儀Calibur和Accuri C6購(gòu)自BD。

3主要方法

3.1小鼠分組DBA/1小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取出15只作為健康對(duì)照組；15只小鼠進(jìn)行混合肽段人工造模，為混合肽段模型組：hGPI325-339和hGPI469-483多肽片段混合溶于預(yù)冷三蒸水中(每75 μL水中溶解50 μg混合多肽)，溶解后的多肽與CFA等體積混合，充分乳化為乳化劑，每只150 μL于小鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射，當(dāng)天及48 h腹腔注射百日咳毒素(每只200 ng)加強(qiáng)免疫；剩下15只用hGPI325-339單一肽段同樣方法造模，為單一肽段模型組。

3.2小鼠體重及關(guān)節(jié)情況評(píng)估造模后，每隔4 d稱量小鼠體重，監(jiān)測(cè)小鼠體重動(dòng)態(tài)變化。每天觀察小鼠的一般狀況及足踝紅腫程度，并進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)分。對(duì)小鼠每個(gè)關(guān)節(jié)和足踝發(fā)紅腫脹程度進(jìn)行量化，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，正常，表示無(wú)紅腫現(xiàn)象；1分，足趾有輕度紅腫；2分，有明顯可見(jiàn)的足背和足掌紅腫；3分，足踝紅腫，爪子各個(gè)部位均有腫脹。依此分別觀察小鼠四肢情況，所得分?jǐn)?shù)累加即為此小鼠關(guān)節(jié)情況評(píng)分。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD4+T細(xì)胞比例于造模后第8 天小鼠眼球取血，收集每只小鼠全血120 μL，各BSA 500 μL阻斷，然后加入PerCP標(biāo)記的CD3抗體(1∶100)和FITC標(biāo)記的CD4抗體(1∶100)各2 μL，4 ℃避光孵育20 min。之后加紅細(xì)胞裂解液1 mL，避光8 min，離心棄上清，用PBS 1 mL洗滌，最后重懸，加PBS定容至500 μL，用流式細(xì)胞儀Calibur上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件(樹(shù)星公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.4小鼠組織取材造模后第8、14和37 天取小鼠眼球血，斷頸椎處死后置于75% 乙醇中消毒3 min，解剖剪剪下鼠爪。然后將小鼠仰臥位置于解剖盤(pán)上，打開(kāi)腹腔，取出脾組織。關(guān)節(jié)組織和脾組織用75%乙醇沖洗后置于4%甲醛溶液中固定備用。

3.5小鼠關(guān)節(jié)組織HE染色足踝關(guān)節(jié)組織沖洗干凈，進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋切片(5 μm)。然后用二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水洗。然后蘇木素染色15 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水返藍(lán)15 min，水洗，1%乙醇伊紅染色3 min。最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，于顯微鏡下觀察。

3.6小鼠脾組織免疫組化染色脾組織常規(guī)石蠟包埋切片(4 μm)，脫蠟、水化后，蒸餾水洗，0.3%甲醇雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，滴加血清封閉液孵育30 min，滴加anti-CD4抗體(1∶200)，4 ℃過(guò)夜。次日，先后滴加生物素Ⅱ抗和辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS洗，DAB顯色劑顯色，自來(lái)水終止。蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察。細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒狀為陽(yáng)性。

3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iNKT細(xì)胞比例收集各組小鼠各期全血(每只120 μL)置于流式管，BSA阻斷后加入PE標(biāo)記的負(fù)載 α-GalCer的CD1d四聚體(α-GalCer用0.5%Tween-20和0.9% NaCl稀釋至200 mg/L，5 μL的α-GalCer加入100 μL CD1d Tetramer中，室溫孵育12 h)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的anti-CD4各2 μL，4 ℃避光孵育20 min。然后加紅細(xì)胞裂解液1 mL，避光8 min，觀察澄清透亮后離心棄上清，PBS重復(fù)洗滌2次，重懸，加PBS定容500 μL，用流式細(xì)胞儀Calibur上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.8CBA檢測(cè)細(xì)胞因子收集第8、14和37天各組小鼠全血中的血清，應(yīng)用CBA 細(xì)胞因子試劑盒檢測(cè)TNF-α和IL-6水平。梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋倍數(shù)分別為1∶256、1∶128、1∶64、1∶32、1∶16、1∶8、1∶4、1∶2、1∶1。依不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品所形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為質(zhì)控指標(biāo)?；旌喜东@微球，每個(gè)實(shí)驗(yàn)管中加入50 μL捕獲微球，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品管中加入50 μL梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣本管中加入50 μL樣本，然后所有管中加入50 μL PE檢測(cè)試劑，室溫避光孵育2 h，然后每管加入1 mL洗液，200×g離心5 min，棄上清后，每管加300 μL洗液，重懸，流式細(xì)胞儀Accuri C6上機(jī)檢測(cè)前進(jìn)行質(zhì)控，保證機(jī)器的可靠性。FCAP軟件(BD)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1各組小鼠體重的動(dòng)態(tài)變化

與健康對(duì)照組相比，RA小鼠體重增長(zhǎng)緩慢，特別是在炎癥高峰階段呈現(xiàn)零增長(zhǎng)或負(fù)增長(zhǎng)，在炎癥轉(zhuǎn)入緩解期后，體重開(kāi)始緩慢增長(zhǎng)。健康對(duì)照組小鼠平均體重為(22.64±0.18) g，單一肽段組RA小鼠的平均體重為(22.19±0.15) g，混合肽段組小鼠的平均體重為(22.03±0.24) g。模型小鼠與健康對(duì)照組小鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，第37天混合肽段組與單一肽段組模型小鼠的體重相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見(jiàn)圖1。

Figure 1.The change of body weight of the RA mice. The area under the curve was used to indicate the relative diffe-rence. DBA1 mice were immunized with GPI peptides. Mean±SD.n=15.*P<0.05vshGPI325-339;#P<0.05vscontrol.

圖1各組小鼠體重動(dòng)態(tài)變化

2RA小鼠足踝關(guān)節(jié)紅腫的觀察

模型小鼠在造模的第8 天即開(kāi)始出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，后爪最先受累，開(kāi)始僅表現(xiàn)為一個(gè)或幾個(gè)足趾出現(xiàn)紅腫，而后紅腫逐漸加重；在造模的第14 天，小鼠多關(guān)節(jié)紅腫，且有足掌甚至足踝的腫脹，后爪重于前爪，此時(shí)關(guān)節(jié)發(fā)紅腫脹程度最為嚴(yán)重，此后關(guān)節(jié)腫脹程度逐漸緩解。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分，模型小鼠與健康對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，在炎癥高峰期混合肽段組比單一肽段組小鼠關(guān)節(jié)紅腫更嚴(yán)重(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Swelling of the joints and clinical scores at different time points in RA mice.Mean±SD.n=15.*P<0.05vshGPI325-339;#P<0.05vscontrol.

圖2各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)關(guān)節(jié)紅腫情況和評(píng)分

3小鼠外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞比例

造模第8天，健康對(duì)照組外周血的CD3+CD4+T細(xì)胞頻率均值為(5.24±0.36)%，單一肽段模型小鼠外周血的CD3+CD4+T細(xì)胞頻率均值為(15.98±1.06)%，而混合肽段模型小鼠的CD3+CD4+T細(xì)胞頻率為(17.76±0.22)%。混合肽段模型小鼠的CD3+CD4+T細(xì)胞頻率與健康對(duì)照組、單一肽段模型小鼠相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見(jiàn)圖3。

4RA小鼠足踝關(guān)節(jié)炎細(xì)胞的浸潤(rùn)情況

模型小鼠足踝關(guān)節(jié)的骨與骨之間、骨與上皮之間的滑膜下疏松結(jié)締組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)腔變窄，并且有與人RA相似的血管翳形成，混合肽段與單一肽段模型相比炎性細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多，見(jiàn)圖4。混合肽段模型小鼠不同時(shí)期浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞不同：造模第8天可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞存在；在造模第14天以淋巴細(xì)胞為主，也可見(jiàn)少量漿細(xì)胞；造模第37天各類炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，伴大量纖維結(jié)締組織增生，見(jiàn)圖5。

5RA小鼠脾組織的病理變化

健康對(duì)照組脾組織中CD4+T細(xì)胞數(shù)量較少，而模型組小鼠脾組織中CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P<0.05)，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見(jiàn)圖6。

6小鼠外周血的iNKT細(xì)胞比例

健康對(duì)照組的iNKT細(xì)胞比例為(0.39±0.03)%；單一肽段模型小鼠的比例為(0.17±0.07)%，混合肽段模型小鼠的比例為(0.11±0.02)%，造模第8天的iNKT細(xì)胞比例為(0.20±0.04)%，第14 天為(0.04±0.13)%，第37天為(0.22±0.34)%。第14天混合肽段模型小鼠的iNKT細(xì)胞比例顯著下降，與其它組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見(jiàn)圖7。

Figure 3.The proportion of CD3+CD4+T cells in peripheral blood of RA mice on the 8th day.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖3第8天各組小鼠外周血CD3+CD4+T細(xì)胞比例

Figure 4.Histopathological changes of the ankle joint in different groups on day 14 (×100).

圖4第14天各組小鼠關(guān)節(jié)組織HE染色對(duì)比圖

Figure 5.Histopathological changes of the ankle joint in hGPI325-339+hGPI469-483 RA mice (×400).→: monocytes; ↓：lymphocytes; oblique ↓: plasma cells.

圖5混合肽段模型組不同時(shí)點(diǎn)足踝關(guān)節(jié)HE染色對(duì)比圖

Figure 6.The expression of CD4+T cells in splenic tissue in different groups (×400).

圖6各組小鼠脾組織淋巴細(xì)胞膜CD4+T細(xì)胞表達(dá)情況

Figure 7.The proportion of iNKT cells in peripheral blood of RA mice.Mean±SD.n=15.*P<0.05vscontrol.

圖7各組小鼠外周血iNKT細(xì)胞頻率

7RA小鼠血清中細(xì)胞因子的變化

檢測(cè)第8、14和37天小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6的水平，發(fā)現(xiàn)模型組的TNF-α和IL-6第8天含量上升，在第14天到達(dá)最高峰，第37 天含量下降，且第14天時(shí)混合肽段模型小鼠的TNF-α水平較單一肽段模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見(jiàn)圖8。

討論

RA是累及全身大小關(guān)節(jié)和多器官的自身免疫病，機(jī)體的免疫失衡和過(guò)度炎癥反應(yīng)是其發(fā)病基礎(chǔ)：機(jī)體自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的過(guò)度增殖打破了原有細(xì)胞間平衡，出現(xiàn)了Th1和Th17亞群過(guò)度增殖，Th2和Treg被抑制[8]。iNKT細(xì)胞是一群兼具NK細(xì)胞功能和T細(xì)胞特點(diǎn)的特殊細(xì)胞群，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)控CD4+T細(xì)胞的分化方向，影響免疫應(yīng)答的格局，是免疫系統(tǒng)的“瑞士軍刀”[9]。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者體內(nèi)存在iNKT細(xì)胞比例和功能的缺陷[10]，外周血中iNKT細(xì)胞比例與IFN-γ/IL-4比值呈負(fù)相關(guān)[11]。

GPI存在于大多數(shù)RA患者血清和關(guān)節(jié)液中，是當(dāng)前臨床RA診斷及判斷活動(dòng)性的一個(gè)常用檢測(cè)指標(biāo)[12]。Schubert 等[5]用重組人GPI免疫小鼠，小鼠關(guān)節(jié)腫脹變形，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成。Bruns等[7]報(bào)道GPI325-339和GPI469-483作為GPI的活性片段，均可誘導(dǎo)RA的發(fā)生，其致炎率前者高于后者。本研究發(fā)現(xiàn)，混合肽段的誘導(dǎo)效果優(yōu)于單一肽段hGPI325-339，這可能與混合肽段通過(guò)多個(gè)作用靶點(diǎn)激活免疫應(yīng)答有關(guān)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們以單一肽段hGPI325-339為對(duì)照，使用混合多肽片段免疫DBA/1小鼠，結(jié)果無(wú)論從體重變化、足踝關(guān)節(jié)癥狀評(píng)分、關(guān)節(jié)病理改變、外周血及脾組織CD4+T細(xì)胞的表達(dá)、外周血iNKT細(xì)胞比例和血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平等方面，混合肽段的誘導(dǎo)效果均優(yōu)于單肽段?；旌想亩文Ｐ托∈笞沲钻P(guān)節(jié)在造模的第8 天出現(xiàn)腫脹，組織病理以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主，第14 天炎癥到達(dá)高峰，伴食欲減退、活動(dòng)受限、行動(dòng)不利，組織病理以淋巴細(xì)胞為主，偶見(jiàn)漿細(xì)胞，進(jìn)入緩解期后，炎癥減輕，炎細(xì)胞數(shù)量顯著減少，大量纖維組織增生，這些均符合RA慢性、以滑膜炎性改變?yōu)橹鞯奶攸c(diǎn)?；旌想亩文Ｐ徒M外周血和脾組織的CD4+T細(xì)胞過(guò)度增殖，而iNKT細(xì)胞在炎癥高峰期明顯降低，與RA患者iNKT細(xì)胞的改變趨勢(shì)一致[10]，故我們推測(cè)，CD4+T細(xì)胞在外周血和脾組織的大量增殖，提示體內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞免疫異常，可能是由于多肽抗原刺激了胸腺中CD4+T細(xì)胞的成熟，并向外周器官不斷遷移，而外周血中iNKT細(xì)胞比例和功能的缺陷，一方面可能由于炎癥初始階段iNKT細(xì)胞的過(guò)度活化導(dǎo)致細(xì)胞衰竭；另一方面可能由于體內(nèi)慢性炎癥的刺激使得可以遞呈抗原給iNKT細(xì)胞的CD1d減少，致使iNKT細(xì)胞活化降低，功能缺陷[13]。此外，血清中TNF-α和IL-6含量升高，提示模型小鼠體內(nèi)存在與RA患者相似的Th1和Th17亞群的極化[8, 14]，在抗原和炎癥因子的作用下，iNKT細(xì)胞不僅自身能迅速釋放大量的炎性細(xì)胞因子和趨化因子，而且能調(diào)控多種免疫細(xì)胞(Treg細(xì)胞、DC細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等)的分化方向[15]，促進(jìn)以TNF-α為代表的炎性因子的釋放，進(jìn)而影響RA免疫應(yīng)答格局，但具體iNKT細(xì)胞參與RA的發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，應(yīng)用hGPI325-339和hGPI469-483混合多肽片段誘導(dǎo)的RA模型，可以模擬人RA體內(nèi)CD4+T細(xì)胞過(guò)度增殖和iNKT細(xì)胞缺陷等特點(diǎn)，可作為RA細(xì)胞免疫研究的理想動(dòng)物模型。

Figure 8.The serum levels of TNF-α and IL-6 in RA mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vshGPI325-339+hGPI469-483.

圖8RA小鼠血清細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平

[參考文獻(xiàn)]

[1]Lee DM, Weinblatt ME. Rheumatoid arthritis[J]. Lancet, 2001, 358(9285):903-911.

[2]Schurgers E, Billiau A, Matthys P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-γ[J]. Interferon Cytokine Res, 2011, 31(12):917-926.

[3]Griffiths MM, Remmers EF.Genetic analysis of collagen-induced arthritis in rats: a polygenic model for rheumatoid arthritis predicts a common framework of cross-species inflammatory/autoimmune disease loci[J]. Immunol Rev, 2001, 184(1):172-183.

[4]van Haalen HG, Severens JL, Tran-Duy A, et al. How to select the right cost-effectiveness model?A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation model for rheumatoid arthritis[J]. Pharmacoeconomics, 2014, 32(5):429-442.

[5]Schubert D, Maier B, Morawietz L, et al. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-depen-dent peripheral polyarthritis in generally unaltered mice[J]. J Immunol, 2004, 172(7):4503-4509.

[6]Horikoshi M, Goto D, Segawa S, et al. Activation of invariant NKT cells with glycolipid ligand a-galactosylceramide ameliorates glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis[J]. PLoS One, 2012, 7(12):e51215.

[7]Bruns L,Frey O, Morawietz L, et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice[J]. Arthritis Res Ther, 2009, 11(4):R117.

[8]Boissier MC, Assier E, Falgarone G, et al. Shifting the imbalance from Th1/Th2 to Th17/treg: the changing rheumatoid arthritis paradigm[J]. Joint Bone Spine, 2008, 75(4):373-375.

[9]Matsuda JL, Mallevaey T, Scott-Browne J, et al. CD1d-restricted iNKT cells, ′the swiss-army knife′ of the immune system[J]. Curr Opin Immunol, 2008, 20(3): 358-368.

[10]Parietti V, Chifflot H, Sibilia J,et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis[J]. Clin Immunol,2010,134(3):331-339.

[11]孟明，陳丹，許鳴華，等. RA患者iNKT細(xì)胞頻率與IFN-γ/IL-4的相關(guān)性研究[J]. 中華微生物和免疫學(xué)雜志, 2015, 35(3):213-218.

[12]Zong M, Lu T, Fan S, et al. Glucose-6-phosphate isome-rase promotes the proliferation and inhibits the apoptosis in fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Res Ther, 2015,17:100.

[13]Kojo S, Adachi Y, Keino H, et al. Dysfunction of T cell receptor AV24AJ18+, BV11+ double-negative regulatory natural killer T cells in autoimmune diseases[J]. Arthritis Rheum, 2001, 44(5):1127-1138.

[14]Yoshida Y, Mikami N, Matsushima Y, et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model[J]. Biol Pharm Bull, 2015, 38(8):1120-1125.

[15]Patel O, Cameron G, Pellicci DG, et al. NKT TCR recognition of CD1d-α-C-galactosylceramide[J]. J Immunol, 2011, 187(9):4705-4713.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA/1 mice

ZHANG Xue-jiao1, LIU Jia-lin1, 2, YANG Fei1, LOU Yong-fu1, WANG Qiang1, CHEN Dong-zhi1, MENG Ming1

(1HebeiUniversityHealthScienceCenter,Baoding071000,China;2InstituteofLaboratoryAnimalSciences,ChineseAcademyofMedicalSciences,TheComparativeMedicineCenter,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100021,China.E-mail:mengming127@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To establish an animal model of rheumatoid arthritis (RA) in DBA/1 mice induced by immunodominant mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase (GPI). METHODS: The DBA/1 mice were immunized with emulsified mixed peptide fragments of hGPI325-339+hGPI469-483 or single peptide hGPI325-339 in complete Freund′s adjuvant by subcutaneous injection to induce the model of RA. Body weight, ankle joint symptom scores, the pathological change of the ankle joint, the levels of CD4+ T cells in the spleen and peripheral blood, the proportion of iNKT cells in the peripheral blood, and the levels of TNF-α and IL-6 in serum were detected to evaluate and analyze the model. RESULTS: The hind paw of the model mice appeared red swelling on the 8th day, and then aggravated gradually to the limbs. The red swelling reached peak on the 14th day, and then relieved gradually. Inflammation response dominated by lymphocytes and monocytes was observed in the ankle joint. The inflammatory effect of mixed peptides was more obvious than that of the single one (P<0.05). Compared with control group and the mice treated with single peptide, the weight gain was slow, the amount of CD4+ T cells in the peripheral blood and spleen were increased, the proportion of peripheral iNKT cells in the inflammatory peak was decreased (P<0.05), and the serum level of TNF-α was increased significantly (P<0.05) in the mice treated with mixed peptide fragments. CONCLUSION: The immunological characteristics of RA model induced by mixed GPI peptides in DBA/1 mice is closer to that in RA patients, especially in the immunopathology of iNKT cells. Therefore, this model can be used as a new tool for studying the mechanism and immunological intervention of RA.

[KEY WORDS]DBA/1 mice; Glucose-6-phosphate isomerase; Rheumatoid arthritis; iNKT cells

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.031

[中圖分類號(hào)]R363.2; R593.22

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0312-5079024； E-mail: mengming127@163.com

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81373197)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.H2014201133; No.H2015201131)；河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)基金資助項(xiàng)目(No.2014A1001; No.2014A1002)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目基金資助項(xiàng)目(No.201510075030);保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃(No.14ZF003)

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2015- 12- 07

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0569- 08

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·