劉越峰，　羅衛(wèi)民，　張　勇，　鐘曉東

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院 1眼科中心, 2心胸外科，湖北 十堰 442000)

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二十二碳六烯酸抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡*

劉越峰1，羅衛(wèi)民2△，張勇1，鐘曉東1

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院1眼科中心,2心胸外科，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的： 觀察二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)對(duì)外源性H2O2誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制。方法： 體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19，加入終濃度為12.5 mol/L的H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，隨后用30～100 μmol/L DHA作用細(xì)胞4～24 h；real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1) mRNA和蛋白的表達(dá)；比色法分析HO-1酶活性；熒光探針檢測(cè)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生；免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)的核轉(zhuǎn)位。最后通過(guò)HO-1 siRNA干擾后，流式細(xì)胞術(shù)觀察其對(duì)ARPE-19細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果： DHA能以濃度依賴性方式誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA和蛋白，同時(shí)，HO-1的酶活性也隨著DHA濃度的遞增而增強(qiáng)；DHA處理也能誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位。此外，H2O2處理可促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生ROS。同時(shí)給予100 μmol/L DHA處理后，細(xì)胞凋亡率和ROS生成顯著降低。轉(zhuǎn)染HO-1 siRNA或用HO-1抑制劑ZnPP處理后，可明顯降低DHA對(duì)細(xì)胞凋亡率和ROS的抑制作用。結(jié)論： DHA可能通過(guò)Nrf2途徑誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)HO-1，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]二十二碳六烯酸； 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞； 血紅素氧合酶-1

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular dege-neration，AMD)是一種黃斑神經(jīng)疾病，好發(fā)于50歲以上人群，其病理生理特征是患者出現(xiàn)雙側(cè)進(jìn)行性視網(wǎng)膜黃斑部退行性病變，是老年人群常見(jiàn)的致盲性眼病之一[1-2]。目前AMD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全明了。流行病學(xué)研究表明它是一種與環(huán)境以及遺傳有關(guān)的多因素疾病[3]，其中氧化應(yīng)激機(jī)制在本病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮核心作用。由于黃斑部解剖學(xué)與組織學(xué)的特殊性，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是AMD發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。目前臨床上針對(duì)AMD尚無(wú)有效的治療方法，主要通過(guò)針對(duì)晚期脈絡(luò)膜新生血管病干預(yù)為主的綜合治療，但治療效果欠佳，僅有20%～40%患者的視力得到一定改善[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及其功能功能方面發(fā)揮重要作用。如DHA可以通過(guò)影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而降低大鼠腦部的缺血再灌注損傷，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[5]。此外，DHA不但具有抗氧化應(yīng)激、抗神經(jīng)炎性反應(yīng)[6]，另外對(duì)黃斑變性以及阿爾茨海默病等神經(jīng)變性性疾病具有一定的預(yù)防和保護(hù)作用[7]。本研究旨在探討DHA對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡的影響，從而進(jìn)一步明確其在AMD保護(hù)作用中的分子機(jī)制。

材料和方法

1主要實(shí)驗(yàn)試劑

ARPE-19細(xì)胞購(gòu)自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、無(wú)內(nèi)毒素胎牛血清購(gòu)自Gibco；DHA、β-actin多克隆抗體、熒光探針H2DCFDA、HO-1抑制劑ZnPP、激動(dòng)劑CoPP為Sigma產(chǎn)品；抗HO-1多克隆抗體、抗Nrf2多克隆抗體以及C3標(biāo)記羊抗鼠多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；細(xì)胞蛋白提取試劑盒和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑為Pierce產(chǎn)品；Nrf2和HO-1 siRNA由廣州銳博公司合成；siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Qiagen；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche；HO-1活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自GENMED。

2主要實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理ARPE-19細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺和抗生素)，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%后接種至6孔板中，并改用含1%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。隨后細(xì)胞加入不同濃度的DHA作用4～24 h。

2.2細(xì)胞總蛋白提取與Western blot實(shí)驗(yàn)ARPE-19細(xì)胞經(jīng)DHA處理結(jié)束后，用PBS漂洗1次，加入含蛋白酶抑制劑的Cocktails裂解細(xì)胞。采用Pierce公司試劑盒提取胞漿蛋白，并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。獲取20 μL蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入相應(yīng)的 I 抗和 II 抗孵育，ECL顯影、拍照。

2.3HO-1酶活性分析收集處理后細(xì)胞，1 000 r/min離心8 min。根據(jù)試劑盒操作步驟裂解細(xì)胞，并設(shè)置好背景管和樣品管，分別加入340 μL緩沖液、20 μL反應(yīng)液和20 μL底物混勻，37 ℃溫育60 min后加入400 μL終止液。經(jīng)1 000 r/min離心 5 min后，獲取綠色相，酶標(biāo)儀上設(shè)置波長(zhǎng)為464 nm和530 nm，根據(jù)取其吸光度計(jì)算出HO-1的活性，結(jié)果以每毫克蛋白中每小時(shí)生成的膽綠素含量表示。

2.4免疫熒光觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位ARPE-19細(xì)胞處理完畢后，用3.5%多聚甲醛重懸浮細(xì)胞，室溫固定15 min。經(jīng)甲醇通透10 min，洗滌后用1%羊血清封閉30 min。隨后加入抗Nrf2抗體，室溫孵育2 h。洗滌后繼續(xù)加入C3標(biāo)記羊抗鼠II 抗孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡(Nikon C2 Plus)拍照。

2.5活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的測(cè)定ARPE-19細(xì)胞處理完畢后加入終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗細(xì)胞并重懸細(xì)胞，熒光分光光度計(jì)(SynergyHT，Bio-Tec)測(cè)量熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)，計(jì)算相對(duì)熒光值(relative fluorescence intensity，RFI)。

2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)于培養(yǎng)皿中的ARPE-19細(xì)胞(約5×105個(gè))在轉(zhuǎn)染前更換為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h。將100 nmol/L HO-1 siRNA或?qū)φ誷iRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合后，加至細(xì)胞培養(yǎng)液中。4 h后用無(wú)菌PBS漂洗細(xì)胞，并更換為完全培養(yǎng)基，隨后加入DHA用于下一步研究。

2.7凋亡檢測(cè)取1 mL細(xì)胞(約5×105個(gè))，加入195 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞后，繼續(xù)加入5 μL Annexin V-FITC使總體積為200 μL，并混勻，室溫避光10 min；離心棄上清，再次用190 μL結(jié)合液重懸細(xì)胞，繼續(xù)加入10 μL PI染液，4 ℃避光10 min后用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，并重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)后行SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1DHA誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA

Real-time PCR結(jié)果顯示，DHA作用ARPE-19細(xì)胞8 h后，HO-1的mRNA表達(dá)隨著DHA濃度增加而增加。此外，100 μmol/L DHA在不同的時(shí)點(diǎn)誘導(dǎo)HO-1的mRNA表達(dá)量也有所不同。其中DHA作用4 h后，HO-1的mRNA開(kāi)始升高，8～12 h達(dá)到峰值，24 h時(shí)接近對(duì)照組水平，見(jiàn)圖1。

Figure 1.DHA induced the mRNA expression of HO-1 in the ARPE-19 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L;#P<0.05,##P<0.01vs0 h.

圖1DHA誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA

2DHA上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)并增強(qiáng)其酶活性

Western blot結(jié)果顯示，0、30、50和100 μmol/L DHA與ARPE-19細(xì)胞孵育8 h后，HO-1蛋白的表達(dá)水平隨之增多，呈一定的劑量依賴性。此外，100 μmol/L DHA作用ARPE-19細(xì)胞4 h后，HO-1酶活性逐漸增高，16 h后開(kāi)始下降，見(jiàn)圖2。

Figure 2.DHA induced ARPE-19 cells to express HO-1 protein and upregulated its enzymic activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L.

圖2DHA誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)并增高其酶活性

3DHA經(jīng)Nrf2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)

ARPE-19細(xì)胞在DHA處理前，Nrf2位于細(xì)胞漿中。經(jīng)20～100 μmol/L DHA處理4 h后，細(xì)胞核中Nrf2顯著增多，采用siRNA干擾Nrf2表達(dá)后，HO-1表達(dá)顯著降低，見(jiàn)圖3。

4抑制HO-1表達(dá)減弱DHA對(duì)ARPE-19細(xì)胞凋亡的抑制作用

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，H2O2處理可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞凋亡。而同時(shí)給予100 μmol/L DHA處理8 h后，與H2O2處理組相比，細(xì)胞凋亡率明顯降低。而在DHA干預(yù)的同時(shí)給予5 μmol/L HO-1抑制劑ZnPP處理，或采用siRNA干擾HO-1表達(dá)后，可明顯逆轉(zhuǎn)DHA對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制效應(yīng)，而給予10 μmol/L HO-1激動(dòng)劑CoPP處理后，得到了與DHA類似的效果，見(jiàn)圖4。

5抑制HO-1表達(dá)減弱DHA對(duì)ROS產(chǎn)生的抑制作用

H2O2處理可明顯誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS。DHA可有效降低H2O2對(duì)細(xì)胞ROS的誘生作用。HO-1抑制劑ZnPP和siRNA處理后，ROS含量恢復(fù)至H2O2組水平；而DHA聯(lián)合HO-1激動(dòng)劑CoPP能進(jìn)一步降低ROS的含量，見(jiàn)圖5。

Figure 3.DHA induced HO-1 expression via Nrf2. A: DHA induced Nrf2 nuclear translocation; B: silencing ofNrf2 down-regulated HO-1 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L;#P<0.05vs100 μmol/L DHA.

圖3DHA經(jīng)Nrf2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)

討論

HO-1是降解血紅素代謝為CO、Fe2+和膽綠素的限速酶。多種病理生理狀態(tài)，如氧化應(yīng)激、感染、糖尿病和視網(wǎng)膜病變等因素均可上調(diào)其表達(dá)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，多種對(duì)AMD具有保護(hù)作用的抗氧化治療藥物是通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[9-11]。HO-1可通過(guò)其產(chǎn)物CO、膽紅素和Fe2+而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，包括降低TNF-α的促凋亡毒性[12]，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能，減輕炎癥和氧化應(yīng)激損傷[13]。DHA是含有22個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸，是人體內(nèi)不飽和程度最高的脂肪酸之一，其高度不飽和性可影響膜蛋白活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及受體功能。研究表明，DHA可有效改善光損傷所致的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能上調(diào)內(nèi)源性抗氧化蛋白的表達(dá)[14-15]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19，通過(guò)DHA干預(yù)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 μmol/L的DHA即可能誘導(dǎo)HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)能上調(diào)其酶活性?；贖O-1多方面的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，以上結(jié)果表明DHA可能通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)從而減輕視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。

Nrf2是一種重要的氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄保護(hù)因子。生理?xiàng)l件下Nrf2存在于胞漿中，并與胞漿中抑制蛋白Keap1相結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到各種外源性刺激時(shí)，Keap1經(jīng)泛素化降解而促使其與Nrf2分離。Nrf2隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與基因 5’非編碼區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相結(jié)合而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)DHA處理后，Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)而調(diào)控HO-1的表達(dá)。同時(shí)，采用Nrf2 siRNA沉默后發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達(dá)顯著減少，這表明Nrf2參與了HO-1的表達(dá)。

Figure 4.The effect of inhibition of HO-1 expression on ARPE-19 cells apoptosis. 1: control; 2: H2O2; 3: H2O2+DHA; 4: H2O2+DHA+ZnPP; 5: H2O2+DHA+HO-1 siRNA; 6: H2O2+DHA+CoPP. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsH2O2;#P<0.05vsH2O2+DHA.

圖4抑制HO-1表達(dá)對(duì)ARPE-19細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5.The effect of inhibition of HO-1 expression on ROS production in the ARPE-19 cells. 1: control; 2: H2O2; 3: H2O2+DHA; 4: H2O2+DHA+ZnPP; 5: H2O2+DHA+HO-1 siRNA; 6: H2O2+DHA+CoPP. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsH2O2;#P<0.05vsH2O2+DHA.

圖5抑制HO-1表達(dá)對(duì)ARPE-19細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

由于細(xì)胞凋亡是AMD發(fā)生的根本原因，因此本研究隨后對(duì)HO-1在氧化應(yīng)激條件下的細(xì)胞護(hù)作用進(jìn)行了觀察，首先采用HO-1抑制劑ZnPP和DHA共同與ARPE-19細(xì)胞孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZnPP可顯著降低DHA對(duì)細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生的抑制作用。此外，通過(guò)siRNA干擾HO-1表達(dá)后也得到了類似結(jié)果。另外本研究也從正向方面得到了驗(yàn)證，即，DHA處理的同時(shí)加入HO-1激動(dòng)劑CoPP共同孵育，與單純DHA處理相比，凋亡率和ROS的產(chǎn)生進(jìn)一步降低。以上結(jié)果證明DHA可能通過(guò)上調(diào)HO-1表達(dá)，從而改善ARPE-19細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)及凋亡。

總之，本課題研究結(jié)果說(shuō)明，DHA可激活視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞Nrf2并誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。HO-1的上調(diào)可減少氧化應(yīng)激損傷后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡以及ROS的產(chǎn)生，最終發(fā)揮對(duì)其保護(hù)作用，在隨后的研究中，我們將對(duì)HO-1抗凋亡機(jī)制開(kāi)展進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Docosahexaenoic acid protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress-induced apoptosis

LIU Yue-feng1, LUO Wei-min2, ZHANG Yong1, ZHONG Xiao-dong1

(1DepartmentofOphthalmology,2DepartmentofCardiothoracicSurgery,TaiheHospitalofShiyanAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China.E-mail:weiminluo120@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of docosahexaenoic acid (DHA) on H2O2-induced apoptosis in human retinal pigment epithelium cells and its molecular mechanism. METHODS: Human retinal pigment epithelium cell line ARPE-19 was cultured in vitro, and 12.5 mmol/L H2O2 was used to mimic the oxidative stress condition. The cells were treated with 30～100 μmol/L DHA for 4～24 h. The expression of heme oxygenase-1 (HO-1) at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot, respectively. The enzymic activity of HO-1 was measured by colorimetry. Production of reactive oxygen species (ROS) was determined by fluorescent probe. Activation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was examined by immunofluorescence method. Apoptosis of ARPE-19 cells was analyzed by flow cytometry. RESULTS: The mRNA and protein expression and the enzymic activity of HO-1 were significantly increased in the ARPE-19 cells after DHA treatment. Meanwhile, nuclear translocation of Nrf2 was also observed. Apoptosis appeared and ROS was produced upon H2O2 incubation. In contrast, DHA at 100 μmol/L significantly abrogated H2O2-induced apoptosis and ROS production. Furthermore, silencing of HO-1 by specific siRNA, or treatment with ZnPP, an inhibitor of HO-1, partly counteracted the protective effect against H2O2-induced apoptosis and ROS production. CONCLUSION: DHA protects retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via induction of heme oxygenase-1 expression after Nrf2 activation.

[KEY WORDS]Docosahexaenoic acid; Retinal pigment epithelial cells; Heme oxygenase-1

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.019

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 0719-8801710； E-mail: weiminluo120@163.com

*[基金項(xiàng)目]十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(No. 14Y40)

[收稿日期]2015- 09- 15[修回日期] 2016- 02- 04

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0504- 06

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