Notch通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷TLR4介導的炎癥反應中的作用*

徐曉嫦，　朱　曄，　張慧濤，　陳萍禎，　鄭　晶，　賈　寧，　林宇靜，　李玲玲，　張　樺△

(中山大學附屬第五醫(yī)院 1腎內(nèi)科，2病理科，3中心實驗室，廣東 珠海 519000)

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Notch通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷TLR4介導的炎癥反應中的作用*

徐曉嫦1，朱曄1，張慧濤1，陳萍禎1，鄭晶1，賈寧1，林宇靜2，李玲玲3，張樺1△

(中山大學附屬第五醫(yī)院1腎內(nèi)科，2病理科，3中心實驗室，廣東 珠海 519000)

[摘要]目的： 探討Notch通路對大鼠腎臟缺血再灌注損傷(IRI)中Toll 樣受體 4(TLR4)介導的炎癥反應的作用。方法: 雄性SD大鼠75只隨機分為假手術組(sham組)、缺血再灌注組(IRI組)和γ-分泌酶抑制劑DAPT干預組(DAPT組)。分別于再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時點觀察各組腎臟病理改變，檢測血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)水平，ELISA檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)水平，免疫組化和Western blot分別檢測大鼠腎臟Notch1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平。結(jié)果: 在IRI組，呈現(xiàn)不同程度的以腎小管上皮細胞和間質(zhì)損傷為主的腎臟病理改變，BUN、Scr及血清炎性因子TNF-α、IL-6含量在各時點均顯著高于sham組(P<0.05)，而在DAPT干預組，在各時點腎臟病理損傷明顯減輕，BUN、Scr和血清TNF-α、IL-6水平均顯著低于IRI組(P<0.05)。Notch1、TLR4和NF-κB p65主要表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì)中，在sham組僅有微量表達，在IRI組則有高表達，在各時點表達與sham組相比均顯著增強(P<0.05)，而在DAPT組，各因子的表達水平在各時點均較IRI組顯著降低(P<0.05)。結(jié)論: 大鼠腎臟IRI出現(xiàn)顯著的腎功能及腎臟病理改變，血清炎性因子TNF-α和IL-6水平升高，Notch1、TLR4及NF-κB p65在腎組織中表達增強；而DAPT可通過抑制Notch1活化和TLR4/NF-κB通路，抑制TLR4所介導的炎癥反應，從而發(fā)揮腎臟保護作用。

[關鍵詞]腎臟； 缺血再灌注損傷； Notch通路； Toll 樣受體4； 炎癥

腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)在腎移植、休克等過程中不可避免，且是其重要損傷環(huán)節(jié)，也是影響移植腎早期功能恢復和長期移植效果的重要因素[1-2]。IRI發(fā)病機制復雜，而炎癥反應起著重要作用[2-4]。在腎缺血缺氧過程中，血管內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞功能障礙，激發(fā)細胞因子、炎癥細胞及因子、免疫細胞的層聯(lián)反應，進而導致腎小管和間質(zhì)損傷。盡管血流再通是挽救腎缺血的重要措施，但在再灌注過程中，組織的炎癥損傷反而加重，故阻抑炎癥因子的分泌、抑制炎癥反應成為防治腎IRI的重要靶點[2-5]。

近年研究表明，Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)在細胞的炎癥與免疫反應中扮演著重要角色。TLR4被生物配體識別及結(jié)合后，可作為“門戶”蛋白活化細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路，啟動機體的炎癥鏈式反應，從而促進炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放[6-7]。而Notch信號通路在大腦[8]、腸道[9]、肝臟[10]、心臟[11]、腎臟[12]等器官的缺血再灌注炎癥損傷的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，抑制Notch通路可以改善缺血再灌注過程中炎癥損傷[11-12]。為了探討腎臟在IRI過程中Notch信號通路是否參與調(diào)節(jié)TLR4誘導的炎癥反應水平，本實驗檢測了Notch1、TLR4以及核因子(nuclear factor,NF)-κB p65在大鼠腎臟IRI中的表達，同時使用抑制Notch信號通路的γ-分泌酶抑制劑DAPT進行干預，初步探討Notch通路對大鼠腎臟IRI中TLR4介導的炎癥反應的作用及可能機制。

材料和方法

1動物與試劑

1.1實驗動物健康雄性、SPF級的Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，體質(zhì)量220～250 g，購于中山大學實驗動物中心，合格證號為SCXK(粵)2011-0029，飼養(yǎng)于動物實驗室SPF級環(huán)境。

1.2主要試劑及藥物大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒；兔抗大鼠TLR4多克隆抗體、兔抗大鼠NF-κB p56多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔抗體、組織蛋白抽提試劑等購自武漢博士德公司、兔抗大鼠Notch1多克隆抗體購自CST；PVDF膜購自Millipore；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)等相關試劑購自藝佳生物公司；γ-分泌酶抑制劑DAPT購自Abcam。

2方法

2.1實驗分組雄性SD大鼠75只，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(sham)組、IRI組和DAPT組，每組25只。

2.2模型建立及標本采集大鼠術前禁食8 h，不禁水，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉。常規(guī)固定、消毒、鋪巾，腹正中切口，游離腎蒂，IRI組以無創(chuàng)小血管夾同時夾閉雙側(cè)腎蒂50 min，之后松開血管夾，血流再通。Sham組和DAPT組大鼠手術方式與IRI組相同，但sham組不用血管夾阻斷血流，DAPT組于松開血管夾時予DAPT(10 μmol/kg)腹腔注射，IRI組與sham組則以等容量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。各組分別于再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h共5個時點取血標本(腹主動脈穿刺)及腎臟標本。右腎用冰生理鹽水沖洗后置液氮保存，待行Western blot檢測；左腎用10%甲醛固定緩沖液固定，待制備石蠟切片。

2.3指標檢測(1)全自動生化分析儀檢測血清肌酐(serum creatinine, Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平；(2) ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6含量，具體步驟按照試劑盒說明書進行；(3) 腎組織石蠟切片行蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察腎組織病理學改變；(4) 免疫組織化學法檢測腎組織Notch1、TLR4和NF-κB p65的表達水平：石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇入水，檸檬酸鹽抗原修復液高溫高壓修復，過氧化物酶封閉液室溫孵育，滴加適當濃度 I 抗，4 ℃過夜復溫后滴加 II 抗，二氨基聯(lián)苯氨溶液顯微鏡下控制顯色，復染細胞核、分化、反藍，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。各指標均用PBS代替 I 抗作為空白對照。細胞質(zhì)染色呈棕黃色為陽性結(jié)果。(5) Western blot檢測腎組織Notch1、TLR4和NF-κB p56蛋白的表達：取出大鼠腎組織取出后稱重，加入100 g/L 的裂解液將組織進行勻漿，勻漿轉(zhuǎn)入EP管，加入PMSF(100 mmol/L)，冰浴裂解30 min，于4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，取上清液并測定蛋白含量。取腎組織勻漿蛋白100 μg與等體積的緩沖液混合，煮沸10 min，經(jīng)10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，2%脫脂奶粉封閉膜，室溫1 h，加入兔抗大鼠Notch1(1∶1 000)、TLR4(1∶200)和NF-κB p56(1∶200)多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加辣根過氧化物酶標記的 II 抗，37 ℃孵育30 min，TBST洗膜3次，化學發(fā)光試劑處理后于暗室曝光。將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。以GAPDH為內(nèi)參照行光密度分析，比較目的條帶/內(nèi)參照條帶灰度值，測定各組蛋白質(zhì)的相對含量。

3統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多個樣本均數(shù)兩兩之間的比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1腎臟病理學改變

Sham組大鼠腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)基本正常。在IRI 組，隨著再灌注時間的延長呈現(xiàn)不同程度的腎臟病理改變，可見腎小管上皮細胞渾濁腫脹，出現(xiàn)水樣或空泡變性，刷狀緣消失，部分腎小管上皮細胞凝固性壞死、脫落，腔內(nèi)可見管型，并可見間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)灶性炎癥細胞浸潤，腎小球病變不明顯。而DAPT組的腎臟病理改變在各時點均較同期IRI組明顯減輕。

2腎功能改變

在IRI 組，BUN、Scr于再灌注6 h即顯著升高，且隨著再灌注時間的延長呈現(xiàn)進行性升高，于24 h達高峰，之后逐漸下降，在各時點均顯著高于sham組(P<0.05)；而在DAPT組，再灌注2 h時BUN、Scr水平與IRI 組相比無統(tǒng)計學差異，在其余各時點BUN、Scr水平則均明顯低于IRI 組(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠血清BUN、Scr、TNF-α和IL-6含量的變化

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIRI group.

3血清TNF-α和IL-6含量的變化

在IRI 組，大鼠血清TNF-α和IL-6含量在各時間點均顯著高于sham組(P<0.05)，且隨著再灌注時間的延長呈現(xiàn)進行性升高；而在DAPT組，血清TNF-α、IL-6含量在各時點均顯著低于IRI 組(P<0.05)，但在48 h前仍高于sham組(P<0.05)，在48 h后與sham組相比無統(tǒng)計學差異，見表1。

4腎組織Notch1、TLR4和NF-κB p65蛋白的表達

4.1免疫組化結(jié)果Notch1、TLR4和NF-κB p65主要表達于腎小管上皮細胞胞質(zhì)中，在sham組表達較弱，而在IRI 組則有高表達，于再灌注6 h時點， 3者即有明顯表達，于再灌注24 h表達最強，之后表達減弱。在DAPT組，3者在各時點的表達均較IRI組顯著減弱，但仍較sham組為強，見圖1～3。

Figure 1.The expression of Notch1 in the renal tissue of the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200). A: sham group; B: reperfusion for 6 h in IRI group; C: reperfusion for 6 h in DAPT group; D: reperfusion for 12 h in IRI group; E: reperfusion for 12 h in DAPT group; F: reperfusion for 24 h in IRI group; G: reperfusion for 24 h in DAPT group; H: reperfusion for 48 h in IRI group; I: reperfusion for 48 h in DAPT group; J: reperfusion for 72 h in IRI group; K: reperfusion for 72 h in DAPT group.

圖1各組大鼠腎組織Notch1的表達

Figure 2.The expression of TLR4 in the renal tissue of the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200). A: sham group; B: reperfusion for 6 h in IRI group; C: reperfusion for 6 h in DAPT group; D: reperfusion for 12 h in IRI group; E: reperfusion for 12 h in DAPT group; F: reperfusion for 24 h in IRI group; G: reperfusion for 24 h in DAPT group; H: reperfusion for 48 h in IRI group; I: reperfusion for 48 h in DAPT group; J: reperfusion for 72 h in IRI group; K: reperfusion for 72 h in DAPT group.

圖2各組大鼠腎組織TLR4的表達

Figure 3.The expression of NF-κB p65 in the renal tissue of the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200). A: sham group; B: reperfusion for 6 h in IRI group; C: reperfusion for 6 h in DAPT group; D: reperfusion for 12 h in IRI group; E: reperfusion for 12 h in DAPT group; F: reperfusion for 24 h in IRI group; G: reperfusion for 24 h in DAPT group; H: reperfusion for 48 h in IRI group; I: reperfusion for 48 h in DAPT group; J: reperfusion for 72 h in IRI group; K: reperfusion for 72 h in DAPT group.

圖3各組大鼠腎組織NF-κB p65的表達

4.2Western blot檢測結(jié)果Notch1、TLR4和NF-κB p65在sham組大鼠腎組織表達較弱，而在IRI 組則有高表達，于再灌注6 h 三者即有明顯表達，隨著再灌注時間的延長其表達隨之增強，于再灌注24 h達到峰值，在各時點的表達水平均顯著高于sham組(P<0.05)。在DAPT組，三者的表達水平在各時點均較IRI組顯著降低(P<0.05)，但仍高于sham組(P<0.05)，見圖4。

討論

腎IRI是急性腎損傷的主要發(fā)病機制之一，而炎癥是腎IRI 的一個重要病理生理機制。缺血再灌注可引發(fā)炎性細胞聚集、炎性因子(如TNF-α、IL-1、IL-6)和化學趨化因子(如MCP-1)釋放及黏附分子增加，它們共同作用激發(fā)炎癥的級聯(lián)反應，導致炎癥的發(fā)生，進而引起器官損傷[2-4]。本實驗觀察到，IRI組大鼠呈現(xiàn)以急性腎小管間質(zhì)損傷為主，伴有炎性細胞浸潤的病理學特征，且隨著再灌注時間延長腎臟病理改變愈發(fā)顯著，同時出現(xiàn)BUN、Scr水平顯著升高和血清炎性因子TNF-α、IL-6含量顯著增加，并隨著再灌注時間的延長呈現(xiàn)進行性升高。上述結(jié)果說明，缺血再灌注誘發(fā)了腎組織炎癥反應的發(fā)生，并導致腎功能障礙。

近年來在對啟動機體炎癥反應的研究中，TLR4的作用備受矚目。TLR4 作為“門戶”蛋白啟動機體的炎癥鏈式反應，在跨膜信號轉(zhuǎn)導受體家族TLRs中占有重要的位置。TLR4廣泛存在于血管內(nèi)皮細胞、單核(巨噬)細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等多種細胞中，其被生物配體(如脂多糖、高遷移率部族蛋白1、熱休克蛋白等)識別及結(jié)合后，可激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，促發(fā)下游通路NF-κB活化，誘導促炎細胞因子(如TNF-α、IL-1β 、IL-6等)的產(chǎn)生和釋放，從而引起和促進組織的炎癥損傷[6, 13]。

研究表明，腎IRI發(fā)生時可啟動多種信號通路，其中具有高度保守性的Notch信號通路可被重新激活，參與腎小管上皮細胞的再生與修復[5]。Notch信號通路由一系列的蛋白分子家族組成，在哺乳動物中包括4種受體(Notch1～Notch4)和5種配體(DLL1、DLL3、DLL4、jagged1和jagged2)。受體和配體均為跨膜蛋白，分為胞內(nèi)段和胞外段。Notch信號通路直接以相鄰細胞件的受體與配體結(jié)合，然后啟動信號傳遞，而不需要第二信使及蛋白激酶參與其中。受體與配體結(jié)合后，通過γ-分泌酶裂解，胞內(nèi)段可轉(zhuǎn)位至細胞核，啟動相關靶基因轉(zhuǎn)錄[5,14]。Notch在成熟的器官組織中表達極低，但在組織損傷和應激情況下表達增加。已有研究報道Notch信號通路參與腎IRI時的炎癥反應，但其與TLR4信號通路之間是否發(fā)生交互作用，從而調(diào)節(jié)TLR4誘導的炎癥反應水平？目前鮮有文獻報道。

Figure 4.The expression of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissue of the rats detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIRI group.

圖4Western blot檢測各組大鼠腎組織Notch1、TLR4和NF-κB p65蛋白的表達

已有研究證明，脂多糖刺激巨噬細胞后可以同時引起TLR4高表達及DLL4/Notch1信號通路的活化，通過NF-κB通路，直接與TNF-α、iNOS共同介導炎癥反應[11, 15]。本實驗顯示，在IRI組，隨著再灌注時間的延長，腎臟病理顯示間質(zhì)中炎細胞浸潤明顯，血清TNF-α和IL-6含量升高，而腎組織中Notch1、TLR4及NF-κB p65表達明顯增強，且Notch1表達與TLR4、NF-κB p65表達水平相平行，同時Notch1、TLR4及NF-κB p65蛋白表達的高峰時間與血清TNF-α、IL-6升高相一致，均于再灌注24 h達到高峰，之后逐漸減弱。結(jié)果提示，在腎IRI的早期，Notch信號通路被活化，并與TLR4、NF-κB p65同步參與了腎IRI的炎癥反應。同時我們推測，在缺血再灌注過程中，組織損傷產(chǎn)生內(nèi)源性配體與TLR4結(jié)合，通過激活下游NF-κB通路，促進炎性細胞因子分泌而介導炎癥反應；組織的炎癥損傷因子又可繼續(xù)作為TLR4的內(nèi)源性配體，形成正反饋機制，進一步擴大炎性損傷。而Notch信號通路可能通過NF-κB通路，與TLR4協(xié)同介導炎癥反應。

有實驗表明，用Notch的特異性配體，或者通過轉(zhuǎn)基因純合子的方法，上調(diào)腎小管Notch信號通路之后，可以加劇組織缺血再灌注損傷[16]。在體外和體內(nèi)實驗中，DAPT可以下調(diào)很多缺氧上調(diào)的炎癥介質(zhì)，減少巨噬細胞活化，同時也可以下調(diào)NF-κB p65的表達和易位，下調(diào)TLR4/MyD88通路，從而顯示出Notch和NF-κB之間的交互作用[17-18]。Zeng等[11]在分離培養(yǎng)的人主動脈瓣間質(zhì)細胞中，證明用Notch1受體的特異性配體Jagged1能增強TLR4介導的NF-κB的活化，DAPT能抑制TLR4介導的NF-κB的磷酸化，從而調(diào)控TLR4介導的炎癥反應。

為探討Notch參與腎臟IRI的炎癥反應的機制，本實驗采用γ-分泌酶抑制劑DAPT干預Notch信號通路，并觀察其對TLR4/NF-κB炎癥通路的影響。結(jié)果顯示，DAPT組大鼠在再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時點腎功能均較IRI組明顯改善，腎小管間質(zhì)損傷和炎癥細胞浸潤明顯減輕，血清炎性因子TNF-α、IL-6含量均顯著降低，且高峰提前至12 h后逐漸下降；同時，使用DAPT干預后，腎組織中不僅Notch1表達較IRI組顯著減弱，而且TLR4和NF-κB p65的表達也較IRI組同步減弱。這提示DAPT不僅抑制了Notch通路，而且還可能通過NF-κB通路與TLR4有交互作用，共同下調(diào)炎性因子的生成與釋放，并阻斷TLR4損傷的正反饋機制，阻抑或減輕TLR4所致的炎癥反應，發(fā)揮腎保護作用。但腎臟IRI 的機制非常復雜，有多種信號通路和細胞因子參與其中，Notch通路與TLR4通路的交互作用機制仍需進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Role of Notch pathway in Toll-like receptor 4 mediated inflammatory response in renal ischemia reperfusion injury in rats

XU Xiao-chang1, ZHU Ye1, ZHANG Hui-tao1, CHEN Ping-zhen1, ZHENG Jing1, JIA Ning1, LIN Yu-jing2, LI Ling-ling3, ZHANG Hua1

(1DepartmentofNephrology,2DepartmentofPathology,3CentreofLaboratory,TheFifthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhuhai519000,China.E-mail:zh3196@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of the Notch pathway in Toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated inflammatory response in renal ischemia reperfusion injury (IRI) in rats. METHODS: A total of 75 male sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, IRI group and DAPT treatment group. Blood samples and the kidneys were obtained at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after reperfusion. The concentrations of blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (Scr) were measured. The serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were detected by ELISA, and the expression of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissues was assessed by immunohistochemistry and Western blot. RESULTS: The serum levels of BUN, Scr, TNF-α and IL-6 in IRI group were markedly increased as compared with sham group (P<0.05). The protein levels of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in renal tubular epithelial cells in IRI group was significantly enhanced as compared with sham group (P<0.05). In DAPT group, the serum levels of BUN, Scr, TNF-α and IL-6 were significantly reduced compared with IRI group (P<0.05), and the protein levels of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 were apparently less than those in IRI group (P<0.05). CONCLUSION: Significant changes of renal function, a rise of serum inflammatory factor including TNF-α and IL-6 and enhanced expression of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissue occurred in the rats with IRI. γ-Secretase inhibitor DAPT attenuates TLR4-mediated inflammatory response in the renal IRI through the inhibition of Notch1 and down-regulation of NF-κB.

[KEY WORDS]Kidney; Ischemia-reperfusion injury; Notch pathway; Toll-like receptor 4; Inflammation

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.016

[中圖分類號]R363.2+1

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel： 0756-2528189； E-mail: zh3196@126.com

*[基金項目]廣東省自然科學基金資助項目(No.S2013010016698)；珠海市醫(yī)學科研基金資助項目(No.201504)

[收稿日期]2015- 10- 08[修回日期] 2015- 12- 08

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0485- 07

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