王碩，龐曉，曹慧

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苯腎上腺素對(duì)心肌纖維化的調(diào)節(jié)和對(duì)白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子-α的影響

王碩，龐曉，曹慧

摘要

關(guān)鍵詞腎上腺素α1受體激動(dòng)劑；心肌纖維化；白細(xì)胞介素-1；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

作者單位：832002 新疆維吾爾自治區(qū)石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

Impacts of Phenylephrine on Myocardial Fibrosis Regulation and Interleukin-1,Interleukin-6,Tumor Necrosis Factor-α Expressions in Experimental Mice

WANG Shuo,PANG Xiao,CAO Hui.
Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi(832002),Xinjiang,China
Corresponding Author:PANG Xiao,Email:px0993@163.com

Abstract

Objective:To explicit phenylephrine(PE),α1-adrenergic receptor(α1-AR)on myocardial fibrosis regulation and interleukin-1(IL-1),IL-6,tumor necrosis factor-α(TNF-α)expressions in pressure overloaded mice.

Methods:A total of 49 KM mice were randomly divided into 3 groups:Blank control group,n=7,Sham operation group,n=7,Transverse abdominal aortic constriction(TAC)group,n=35,and 8 weeks later,the mice in TAC group were further divided into 5 sub-groups as TAC control,TAC+PE,TAC+Praz,TAC+Prop,TAC+Carv sub-groups,n=5 in each sub-group,and the animals were respectively treated for 3 weeks.Left ventricular collagen volume fraction(CVE),hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions were examined respectively.

Results:By 8 weeks treatment,compared with Blank control group,TAC group had obvious myocardial fibrosis,increased hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions,P<0.001.Compared with TAC control sub-group,TAC+PE,AC+Prop,TAC+Carv sub-groups showed decreased CVF,hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions,P<0.001,while the above changes were not obvious in TAC+Praz sub-group,P>0.05;CVE and hydroxyproline content were similar between TAC+PE and TAC+Prop sub-groups,while the expressions of IL-1,IL-6 and TNF-α were obviously decreased in TAC+Prop sub-group,P<0.05.Conclusion:PE may improve myocardial fibrosis and IL-1,IL-6,TNF-α expressions by activating α1-AR in pressure overloaded mice,α1-AR might be a defending factor for myocardial fibrosis.

Key words Adrenergic alpha-1 receptor agonists;Myocardial fibrosis;Interleukin-1;Interleukin-6;Tumor necrosis factor-α

(Chinese Circulation Journal,2016,31:289.)

心肌纖維化是指在正常的心臟組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過(guò)量積聚、膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生變化，是膠原合成代謝和分解代謝失衡的結(jié)果。這種病理表現(xiàn)存在于多種心血管疾病，與心功能障礙、心律失常甚至心原性猝死密切相關(guān)。交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增加在心血管病的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用[1]?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床研究已證實(shí)，β腎上腺素能受體（β-AR）阻滯劑能夠延緩心血管病進(jìn)展，降低心力衰竭的發(fā)病率和死亡率[2]，但是，與β-AR在心臟中的作用已受到廣泛關(guān)注不同，有關(guān)α1腎上腺素能受體（α1-AR）的研究報(bào)道較少。

炎癥因子在多種疾病所致的心肌纖維化進(jìn)程中起著重要作用。各種致病因素導(dǎo)致心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子水平異常增高，刺激心臟膠原纖維合成增多，最終導(dǎo)致心肌纖維化。急性心肌梗死后的梗死區(qū)和非梗死區(qū)都存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌纖維化，且炎癥因子的水平與纖維化的程度密切相關(guān)。炎癥因子在心肌纖維化過(guò)程中形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在炎癥因子的刺激下，發(fā)生纖維化的心肌組織進(jìn)一步分泌炎癥因子，從而導(dǎo)致惡性循環(huán)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄（TAC）誘導(dǎo)小鼠壓力超負(fù)荷模型，在小鼠出現(xiàn)心肌纖維化后，分別予α1-AR激動(dòng)劑苯腎上腺素（PE）、α1-AR抑制劑哌唑嗪（Praz）、β1/β2受體阻滯劑普萘洛爾（Prop）和α1/β1/β2受體阻滯劑卡維地洛（Carv）處理，明確α1-AR在心肌纖維化過(guò)程中的作用，并且觀察炎癥因子白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在α1-AR調(diào)節(jié)的心肌纖維化過(guò)程中的變化。

1　材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：昆明（KM）小鼠49只，雄性，8周齡，體重22～25 g，購(gòu)自新疆石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)適應(yīng)1周后，記錄體重、活動(dòng)狀態(tài)作為基線資料，隨后將動(dòng)物隨機(jī)分為3組：（1）TAC組（n=35）：分離小鼠腹主動(dòng)脈，在腎臟水平用6號(hào)手術(shù)線將腹動(dòng)脈和0.18 mm針頭一起結(jié)扎；（2）假手術(shù)組（n=7）：只分離腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎；（3）空白對(duì)照組（n=7）。8周后重新記錄體重、活動(dòng)狀態(tài)，將TAC組隨機(jī)分為5組，每組7只：TAC+PE組（每日PE 0.65 mg/kg腹腔注射）、TAC+Praz組（每日Praz 5 mg/kg灌胃）、TAC+Prop組（每日Prop 40 mg/kg灌胃）、TAC+Carv組（每日Carv 10 mg/kg灌胃）和TAC對(duì)照組（每日生理鹽水灌胃）。3周后處死小鼠。

心肌羥脯氨酸測(cè)定：羥脯氨酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。按試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定左心室心肌組織中羥脯氨酸含量。間質(zhì)膠原平均包含13.4% 羥脯氨酸，間質(zhì)膠原含量等于羥脯氨酸的含量乘以7.46[3]，結(jié)果以μg /mg 表示每毫克心臟組織中膠原的含量[4]。

心肌膠原形態(tài)學(xué)觀察及定量分析：石蠟包埋，切片厚約4 μm，用Van-Gieson（VG）染色法，光鏡下可見心肌細(xì)胞呈黃色，膠原呈紅色。然后用Image-Pro 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)量左心室的膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），CVF=左心室膠原面積/所測(cè)視野面積。隨機(jī)取6個(gè)視野，以均值作為該心臟的CVF。

免疫組織化學(xué)法測(cè)定心肌IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)情況：石蠟切片，常規(guī)脫蠟，3 ml/L過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，熱修復(fù)抗原后，滴加一抗IL-1（1:200 稀釋，購(gòu)自博士德公司）、IL-6 （1:100 稀釋，購(gòu)自?shī)W博森公司）、TNF-α（1:200 稀釋，購(gòu)自博士德公司），4℃過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min；加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液；二氨基苯聯(lián)胺（DAB）顯色，封片。應(yīng)用Image-Pro 6.0圖像分析軟件對(duì)IL-1、IL-6、TNF-α（細(xì)胞質(zhì)中棕褐色顆粒為陽(yáng)性）蛋白表達(dá)進(jìn)行圖像分析，每張切片取5 個(gè)連續(xù)的高倍視野，在陽(yáng)性表達(dá)區(qū)隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，通過(guò)image-Pro6.0分析測(cè)定平均陽(yáng)性表達(dá)率，其值越高，表達(dá)量越多，進(jìn)行半定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 17.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示。三組間比較在方差齊時(shí)用方差分析，兩兩比較用LSD。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

七組小鼠VG 染色以及膠原容積分?jǐn)?shù)、羥脯氨酸和膠原含量結(jié)果（圖1、表1）：空白對(duì)照組及假手術(shù)組小鼠心臟組織可見少量纖維組織，TAC對(duì)照組、TAC+Praz組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌內(nèi)小血管周圍及心肌間質(zhì)有較多膠原沉積，左心室CVF較空白對(duì)照組明顯增高（P<0.01）；TAC+PE組、TAC+Prop組、TAC+Carv組心肌膠原沉積較TAC對(duì)照組減少，CVF 顯著降低（P<0.01），但仍高于空白對(duì)照組（P<0.01）；TAC+PE組心肌膠原沉積較TAC+Carv組減少，CVF降低（P<0.01），TAC+Prop組心肌膠原沉積較TAC+Carv組減少，CVF降低（P<0.05）。TAC對(duì)照組、TAC+Praz組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較空白對(duì)照組顯著升高（P<0.01）；TAC+PE組、TAC+Prop組、TAC+Carv組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較TAC對(duì)照組減少（P<0.01），但仍高于空白對(duì)照組（P<0.01），TAC+PE組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較TAC+Carv組減少（P<0.01），TAC+Prop組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較TAC+Carv組減少（P<0.05）。

七組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)情況（圖2、表2）：心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α在心肌細(xì)胞胞漿表達(dá)。TAC對(duì)照組、TAC+Praz組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)較空白對(duì)照組顯著升高（P<0.01）；TAC+PE組、TAC+Prop組、TAC+Carv組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)較TAC對(duì)照組減少（P<0.01），但仍高于空白對(duì)照組（P<0.01），TAC+PE組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)較TAC+Carv組減少（P<0.01），TAC+Prop組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α較TAC+Carv組減少（P<0.05）。

圖1　七組小鼠Van-Gieson染色膠原形態(tài)學(xué)觀察（×100）

表1　七組小鼠膠原容積分?jǐn)?shù)及羥脯氨酸和膠原含量比較（n=7，±s）

表2　七組小鼠心肌組織中白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的含量（IOD）比較（n=7，±s）

表2　七組小鼠心肌組織中白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的含量（IOD）比較（n=7，±s）

注：IOD：光密度，通過(guò)Image-Pro 6.0軟件測(cè)定定量分析所得，反映蛋白單位面積濃度，與蛋白定量呈對(duì)數(shù)關(guān)系。與空白對(duì)照組相比*P<0.01；與腹主動(dòng)脈縮窄對(duì)照組相比△P<0.01；與腹主動(dòng)脈縮窄+卡維地洛組相比▲P<0.01▲▲P<0.05

組別　白細(xì)胞介素-1(D/μm2)　白細(xì)胞介素-6(D/μm2)　腫瘤壞死因子-α(D/μm2))空白對(duì)照組　2.16±0.14△▲　3.71±0.53△▲2.45±0.26△▲假手術(shù)組　2.61±0.65△▲　4.22±0.41△▲　2.70±0.34△▲腹主動(dòng)脈縮窄對(duì)照組　43.56±1.76*▲　46.75±0.76*▲　43.49±2.14*▲腹主動(dòng)脈縮窄+苯腎上腺素組　5.34±0.30*△▲　8.59±0.32*△▲　6.57±0.58*△▲腹主動(dòng)脈縮窄+哌唑嗪組　42.54±1.98*▲　47.00±1.28*▲　42.78±2.35*▲腹主動(dòng)脈縮窄+普萘洛爾組　18.97±0.82*△▲▲　20.22±1.51*△▲▲　19.50±1.99*△▲▲腹主動(dòng)脈縮窄+卡維地洛組　21.39±1.47*△　21.85±0.29*△　22.19±1.01*△

圖2　免疫組織化學(xué)法檢測(cè)七組小鼠白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α表達(dá)情況

3　討論

心肌纖維化是多種心血管病不斷進(jìn)展最終導(dǎo)致心臟功能衰竭的一個(gè)重要病理改變，是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵病理特征和重要形成原因。其主要表現(xiàn)為心肌組織中膠原纖維過(guò)度沉積，膠原含量顯著增加，各型膠原比例失調(diào)且排列紊亂。目前認(rèn)為，心肌纖維化過(guò)程中的靶細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞，研究比較明確的刺激因素有：腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、細(xì)胞因子以及壓力超負(fù)荷等。最終影響心肌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積的表達(dá)產(chǎn)物或使ECM過(guò)度增生，或使ECM降解異常，主要與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）及其組織抑制因子（TIMP）的平衡失調(diào)有關(guān)[5]，而成纖維細(xì)胞的增殖異常則受某些細(xì)胞周期因子的調(diào)控。IL-1、IL-6和TNF-α被認(rèn)為是心肌纖維化過(guò)程中的胞外刺激因素，它們可以對(duì)上述某些環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響。

交感神經(jīng)系統(tǒng)作為多種心臟病理生理狀態(tài)的重要刺激因素之一，已被很多研究所證實(shí)。臨床和動(dòng)物遺傳學(xué)研究均顯示，α1-AR在心肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和病理肥厚中有著重要的作用[6]，但對(duì)于α受體阻滯劑對(duì)心肌纖維化的作用研究較少。

本研究采用TAC法建立壓力超負(fù)荷小鼠模型，TAC組小鼠心肌組織中總膠原（VG染色）及羥脯氨酸含量明顯增多，證實(shí)壓力超負(fù)荷導(dǎo)致小鼠心肌纖維化的發(fā)生，IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)也較空白對(duì)照組明顯升高，這與有關(guān)研究報(bào)道[7-9]相同。給予PE、Prop、Carv對(duì)心肌纖維化小鼠進(jìn)行干預(yù)后，這三組小鼠的CVF、羥脯氨酸含量均較TAC對(duì)照組明顯降低，但仍高于空白對(duì)照組，表明PE、Prop、Carv均可部分緩解壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化；TAC+PE組、TAC+Prop組小鼠的CVF、羥脯氨酸含量與TAC+Carv組相比明顯降低，表明PE、Prop對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)心肌纖維化的緩解作用優(yōu)于Carv；給予Praz對(duì)心肌纖維化小鼠進(jìn)行干預(yù)后，CVF、羥脯氨酸含量均較TAC對(duì)照組無(wú)明顯降低，表明Praz對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化無(wú)明顯影響；提示激活α1-AR或抑制β-AR可部分緩解壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化，且抑制β-AR的同時(shí)抑制α1-AR會(huì)部分降低β-AR對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化的緩解作用。TAC+PE組小鼠IL-1、IL-6 和TNF-α表達(dá)較TAC+Prop組和TAC+Carv組明顯降低，TAC+Prop組小鼠IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)較TAC+Carv組降低，表明PE緩解壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化的同時(shí)伴隨著IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)的降低；雖然TAC+PE組與TAC+Prop組小鼠心肌纖維化程度無(wú)顯著差異，但TAC+PE組小鼠IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)明顯低于TAC+Prop組，提示PE與Prop緩解壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化的機(jī)制可能不同，且PE緩解壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化可能影響IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)。

在正常心臟的所有受體中，β-AR大約占90%，而α1-AR約占10%。β-AR抑制對(duì)心力衰竭有明顯的益處，但有臨床研究結(jié)果表明，在心力衰竭患者中過(guò)多降低去甲腎上腺素水平是有害的[10]。有研究提示，心力衰竭時(shí)α1-AR數(shù)量并沒有下調(diào)，而是相應(yīng)提高，通過(guò)激活生理性肥厚、阻止細(xì)胞死亡和增加正性肌力反應(yīng)保護(hù)心臟，預(yù)防病理性心室重構(gòu)[11]，使得我們不得不重新審視α1-AR的功能。

本研究證實(shí)，PE可以有效減輕壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠的心肌纖維化，因此我們推測(cè)，早期使用α1受體激動(dòng)劑可能會(huì)改善心肌纖維化程度，減緩心室重構(gòu)發(fā)生、發(fā)展的病理進(jìn)程。本研究還觀察到PE對(duì)心肌纖維化的調(diào)節(jié)伴隨IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)的降低，但具體機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步證實(shí)及探討。

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（編輯：朱柳媛）

收稿日期：（2015-08-30）

中圖分類號(hào)：R54

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3614（2016）03-0289-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.03.020

作者簡(jiǎn)介：王碩 碩士研究生 研究方向?yàn)樾难芗膊』A(chǔ)與臨床 Email：ddd456852@ 126.com 通訊作者：龐曉 Email：px0993@163.com

目的：明確α1腎上腺素能受體（α1-AR）激動(dòng)劑苯腎上腺素（PE）在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)心肌纖維化過(guò)程中的作用，觀察該過(guò)程中炎癥因子白細(xì)胞介素-1（IL-1)、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的變化。

方法：昆明（KM）小鼠49只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、腹主動(dòng)脈結(jié)扎（TAC）組和假手術(shù)組，8周后再將TAC組小鼠隨機(jī)分為5組，包括TAC對(duì)照組、TAC+PE組、TAC+哌唑嗪（Praz）組、TAC+普萘洛爾（Prop）組和TAC+卡維地洛（Carv）組，分別給予不同的藥物處理3周后，測(cè)定小鼠左心室組織膠原容積積分（CVF）、羥脯氨酸含量以及炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-α的表達(dá)變化。

結(jié)果：TAC 8周后，小鼠出現(xiàn)明顯心肌纖維化，左心室組織CVF、羥脯氨酸含量以及IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)均較空白對(duì)照組顯著增高（P<0.01）；與TAC組相比，TAC+PE組、TAC+ Prop組和TAC+Carve組的左心室CVF、羥脯氨酸含量及IL-1、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.01），而TAC+Praz組的左心室CVF、羥脯氨酸含量及IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)變化不明顯（P>0.05）；與TAC+PE組相比，TAC+Prop組左心室CVF、羥脯氨酸含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但I(xiàn)L-1、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。

結(jié)論：PE通過(guò)激活α1-AR，可改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化和炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α的表達(dá)，α1-AR可能是心肌纖維化的防御因素。