喬紅玉，王亞斌，高 磊，徐 斌，江振華，梁 瀟，田 捷，曹 豐,*

（1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710032；2解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853；3中國(guó)科學(xué)院自動(dòng)化研究所，北京100190）

2013年中國(guó)心血管病報(bào)告顯示，中國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，截止到2013年，全國(guó)共有心血管病患者2.9億。2012年心血管病死亡率為255/10萬(wàn)人，即每天9590人、每小時(shí)400人、每10秒鐘1人死于心血管病。而病理研究結(jié)果顯示：急性心肌梗死通常是由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂所致[1,2]，因此，識(shí)別易損斑塊是預(yù)防急性心血管事件的重要內(nèi)容。

臨床研究表明，半數(shù)以上的動(dòng)脈粥樣硬化患者通常以突然死亡或急性心肌梗死為臨床首發(fā)癥狀[3]。臨床上現(xiàn)今用于心血管事件預(yù)防的方法有很多，但都不能達(dá)到理想的效果。舉例來(lái)說(shuō)，接近2/3的急性冠脈綜合征患者在進(jìn)行Framingham風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分時(shí)，事實(shí)上都是屬于中等風(fēng)險(xiǎn)的[4]。而臨床上常用的輔助手段如血管造影、血管內(nèi)超聲（intravenous ultrasound，IVUS）及光學(xué)相干斷層成像（optical coherence tomography，OCT）等也或多或少存在局限性。如：血管造影僅能檢測(cè)出堵塞的血管，而IVUS和OCT僅能利用斑塊成分的不同對(duì)比度進(jìn)行分析來(lái)衡量斑塊的性質(zhì)，并不能從分子生物學(xué)的角度對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。

分子影像作為新興的一項(xiàng)技術(shù)，為從分子生物學(xué)角度進(jìn)行疾病診斷提供了工具[5]。而該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要借助諸多成像設(shè)備如：光學(xué)、磁共振、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission computed tomography/computed tomography，PET/CT）等，而其中熒光成像具有高靈敏度、易實(shí)現(xiàn)等特點(diǎn)，有良好的應(yīng)用前景。理想的靶點(diǎn)是分子影像的一個(gè)重要組成因素。眾所周知，易損斑塊通常具有以下特征：薄纖維帽、巨噬細(xì)胞的大量聚集及巨大的壞死中心等[6]。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種具有多樣功能的分泌性蛋白，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中有表達(dá)，且研究證實(shí)巨噬細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞能分泌產(chǎn)生大量OPN，以進(jìn)一步地促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移和活化[7,8]。因此，OPN有希望作為一個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)靶向泡沫細(xì)胞進(jìn)而識(shí)別易損斑塊。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建一個(gè)偶聯(lián)有OPN抗體和Cy5.5熒光染料的四氧化三鐵納米探針，通過(guò)光學(xué)三維成像來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的識(shí)別。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用6周大小雌性ApoE?/?小鼠及高脂飼料（15%脂肪，0.25%膽固醇）購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華公司。OPN抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，N?羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Cy5.5-NHS購(gòu)自美國(guó)GE公司，二巰基丁二酸修飾的四氧化三鐵納米顆粒（meso-2,3-dimercaptosuccinic acid-Fe3O4magnetic nanoparticles，DMSA-MNPs）購(gòu)自南京東納生物科技有限公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自上海羅氏，小動(dòng)物活體成像儀購(gòu)自美國(guó)Caliper公司，共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本（Olympus FV 10i）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 將20只C57BL/6J ApoE?/?小鼠分為模型組及對(duì)照組，模型組經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)20周，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，對(duì)照組用普通鼠糧喂養(yǎng)。

1.2.2 Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs探針的構(gòu)建 取10ml稀釋為1g/L的DMSA-MNPs溶液，先后加入0.2ml濃度為10g/L的EDC溶液和0.3ml濃度為10g/L的NHS溶液，室溫下固定于翻轉(zhuǎn)搖床上搖晃30min。取0.4ml OPN抗體（25g/L）緩慢加入到DMSA-MNPs混合溶液中，置于4℃翻轉(zhuǎn)搖床上低速搖晃12h。離心除去多余抗體，加入100μl NHS-Cy5.5溶液（20g/L），避光在室溫下置于搖床上搖晃4h。離心，用強(qiáng)力磁鐵收集沉淀即為備用的探針。

1.2.3 DMSA-MNPs的表征 透射電鏡觀察DMSA-MNPs形態(tài)和粒徑大?。簩悠废♂?zhuān)我坏稳芤河谕干潆婄R專(zhuān)用銅網(wǎng)上，常溫下風(fēng)干，在透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs探針經(jīng)細(xì)胞攝取后的熒光成像 將小鼠的Raw264.7巨噬細(xì)胞系用1640培養(yǎng)基（加10%胎牛血清）培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，種于24孔板（105/孔），待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，加入Ox-LDL（50mg/L）刺激24h，然后分別向其中加入不同濃度Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs：0，5，15，30，50mg/L。孵育12h后去離子水洗3min×3次，去除未被細(xì)胞攝取的顆粒。使用PBS將細(xì)胞吹下，轉(zhuǎn)移至黑色96孔板，使用小動(dòng)物活體成像儀進(jìn)行熒光成像。參數(shù)設(shè)置如下：曝光時(shí)間（exposure time）：30s，binning 4，f/stop 2，激發(fā)波長(zhǎng)（excitation wavelength）640nm，emission Cy5.5。

1.2.5 Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs探針的細(xì)胞毒性檢測(cè) Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs探針對(duì)Raw264.7細(xì)胞活力影響的MTT檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以104/孔的數(shù)量接種至96孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，加入不同濃度探針：0，5，10，15，20，25，30mg/L，孵育24h后，每孔加入20μl MTT溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h后小心吸去上清，每孔加入150μl的DMSO，室溫下水平搖床緩慢搖蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定A490nm。

Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs探針對(duì)Raw264.7細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(cè)：將對(duì)生長(zhǎng)數(shù)期細(xì)胞以105/孔的數(shù)量接種至預(yù)先加有爬片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的探針：0，10，20，25，30mg/L，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h，取出細(xì)胞爬片，PBS清洗3min×3次，使用4%多聚甲醛固定15min，PBS輕柔清洗后，使用0.1%Triton100透膜5min，PBS輕柔清洗，3min×3次；TUNEL工作液按說(shuō)明書(shū)配置，滴至細(xì)胞爬片，于37℃孵育1h，PBS輕柔清洗，3min×3次；使用DAPI工作液滴于細(xì)胞爬片，室溫孵育5min，PBS輕柔清洗，5min×3次；細(xì)胞爬片自然風(fēng)干，中性甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 動(dòng)脈粥樣硬化模型的大體油紅染色 將血管自頸動(dòng)脈到腹主動(dòng)脈從小鼠體內(nèi)分離后，用PBS洗凈，剝?nèi)ネ饽?，剪開(kāi)后固定于4%多聚甲醛，24h后使用油紅工作液固定2h，70%異丙醇脫色，直至血管壁變白為止，固定拍照。

1.2.7 動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的在體3D熒光成像將小鼠用異氟烷麻醉后，脫去頸部的毛發(fā)，以仰臥位置于成像臺(tái)上，探針經(jīng)小鼠尾靜脈注入（5mg Fe/kg），參數(shù)設(shè)置如下：曝光時(shí)間（exposure time）：30s，binning 4，f/stop 2，激發(fā)波長(zhǎng)（excitation wavelength）640nm，emission Cy5.5，以小鼠表面任意4個(gè)點(diǎn)為基點(diǎn)，選取仰臥位動(dòng)物模板，進(jìn)行三維成像。

1.2.8 組織切片的HE染色及Cy5.5激光共聚焦檢測(cè) 在體成像結(jié)束后，將小鼠頸部血管取出做冰凍切片，通過(guò)HE染色鑒別斑塊部位的同時(shí)將冰凍切片用PBS洗滌5min×3次，DAPI工作液染色3min之后，PBS清洗1min×3次，激光共聚焦顯微鏡照相，以確定探針富集部位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用GraphPad Prism-5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 探針的表征

DMSA-MNPs以串聯(lián)的方式先后偶聯(lián)OPN抗體和Cy5.5熒光染料，示意圖見(jiàn)圖1A，電鏡結(jié)果顯示，DMSA-MNPs核心顆粒大小為7.2nm（圖1B），Cy5.5的偶聯(lián)使得探針表現(xiàn)出明顯的光學(xué)效應(yīng)，且光學(xué)信號(hào)隨著細(xì)胞探針的濃度增加表現(xiàn)出相應(yīng)的線性增加（圖1C）。

2.2 探針的毒性檢測(cè)

MTT結(jié)果顯示，不同濃度探針：0，5，10，15，20，25，30mg/L相較于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A490nm：1.10±0.03，1.05±0.03，1.03±0.02，0.96±0.02，0.96±0.03，0.93±0.03vs1.11±0.05，P＞0.05；圖2A）；TUNEL結(jié)果顯示，不同濃度的探針：0，10，20，25，30mg/L與對(duì)照組比較來(lái)說(shuō)，細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（21.2±1.5）%，（21.8±1.1）%，（21.5±1.2）%，（22.3±1.2）%vs（20.5±1.0）%，P＞0.05；圖2B]，綜合以上結(jié)果可知，探針濃度即使加到30mg/L時(shí)仍未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

2.3 在體的小鼠3D熒光成像及離體鑒定

血管的大體油紅染色結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)組小鼠血管壁有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，紅色面積顯著高于對(duì)照組（40%vs5%，P＜0.05；圖3A）。小鼠的在體3D熒光成像顯示，在小鼠頸動(dòng)脈處表現(xiàn)出明顯的信號(hào)點(diǎn)（圖3B），且體外激光共聚焦結(jié)果顯示探針主要集中在斑塊內(nèi)（圖3C）。

3 討 論

圖1 探針的相關(guān)表征Figure 1 Characterization of probesA:the schema of Cy5.5-anti-OPN-DMSA-MNPs;B:transmission electron microscope(TEM)images,average iron core size was 7.2nm;C:the fluorescence feature of probes and after incubation the probes with foam macrophages for 24h,which were induced by Ox-LDL(50mg/L),the signal intensity was linearly proportional to the concentration of probes

圖2 探針的細(xì)胞毒性檢測(cè)Figure 2 Cytotoxicity assessment of probesA:The MTT results showed that there was no significant discrepancy on cells’viability between different concentrations and control group(A490nm:1.10±0.03,1.05±0.03,1.03±0.02,0.96±0.02,0.96±0.03,0.93±0.03 vs 1.11±0.05,P＞0.05);B:The TUNEL positive nuclei in each group were calculated and no significant difference was found[(21.2±1.5)%,(21.8±1.1)%,(21.5±1.2)%,(22.3±1.2)%vs(20.5±1.0)%,P＞0.05]

如今，越來(lái)越多的研究都著眼于易損斑塊的分子層面，尋找靶點(diǎn)，從而進(jìn)行診斷。分子影像也因此成為熱點(diǎn)工具[9]。良好的探針是分子影像能夠?qū)崿F(xiàn)的重要保證，納米顆粒因具有以下優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。首先，納米顆粒的大小和諸多生物大分子大小一致，因此在血液循環(huán)過(guò)程中不會(huì)帶來(lái)血管的阻塞；其次，納米顆粒本身可以由很多材料組成，如：脂質(zhì)，金屬等，應(yīng)用范圍較為廣泛；另外，納米顆粒的合成和修飾過(guò)程都可以進(jìn)行嚴(yán)格控制，一方面可以保證實(shí)驗(yàn)的需求，另一方面也可以提高自身的生物相容性[10]。本實(shí)驗(yàn)中采用的四氧化三鐵納米顆粒，除以上優(yōu)勢(shì)外，還具有安全性好、容易制備的特點(diǎn)[11]。

巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是斑塊易損性的重要特征之一，而OPN的表達(dá)被認(rèn)為與巨噬細(xì)胞的遷移和活化密切相關(guān)。先前的研究表明：OPN過(guò)表達(dá)時(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積會(huì)增加，且巨噬細(xì)胞的聚集增多；反之，當(dāng)OPN下調(diào)時(shí)，斑塊的面積會(huì)較小，且伴隨著巨噬細(xì)胞的聚集減少[12,13]，因此OPN有望成為一個(gè)靶向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的重要靶點(diǎn)。

圖3 動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及探針注射后的熒光成像Figure 3 Fluorescence imaging of atherosclerotic modelsHFD:high fat diet.A:oil red staining of mice feeding with high fat diet and the control group,the area of plaques was significantly higher in atherosclerotic group(40%vs 5%,P＜0.05);B:3D fluorescence imaging of atherosclerotic model after tail-vein injection of probes for 24h and predominant signal was observed in the carotid artery;C:images taken by confocal fluorescent microscope showed that our probes mainly located in the plaque,which was further characterized by HE staining

如今，臨床上動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂通常發(fā)生在癥狀發(fā)生之前，因此，如何有效且及時(shí)識(shí)別易損斑塊，并有針對(duì)性地采取措施，是臨床亟待解決的難題[14]。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用OPN作為靶向分子，采用三維光學(xué)的成像手段，有效地識(shí)別了動(dòng)物模型頸部斑塊。雖然目前光學(xué)成像由于穿透力有限，尚不能有效地從體表獲取動(dòng)物體深部的信號(hào)，但是得益于血管內(nèi)近紅外熒光傳感導(dǎo)管技術(shù)的發(fā)展，熒光成像將在未來(lái)有希望應(yīng)用于臨床[15]。

OPN靶向的四氧化三鐵納米顆粒在本實(shí)驗(yàn)中取得了較好的識(shí)別斑塊效果，相較于之前的研究[16,17]，三維光學(xué)成像能更直觀地展示動(dòng)脈粥樣硬化斑塊所在的位置，但是仍需要對(duì)所識(shí)別斑塊的性質(zhì)進(jìn)行研究，我們希望能借助于OPN分子與巨噬細(xì)胞的密切聯(lián)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)易損斑塊的識(shí)別和診斷，從而有效地降低急性心血管事件的發(fā)生率。

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