曹連賓+崔占鴻+孫紅梅+郝力壯+劉書杰

摘要： 以青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣全放牧牦牛和青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院舍飼牦牛瘤胃內(nèi)容物為樣本，對牦牛瘤胃細菌多樣性進行分析及比較。使用細菌通用引物進行瘤胃細菌16S rRNA基因序列的擴增，以16S rRNA序列分析技術(shù)分析瘤胃細菌多樣性，并構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫。結(jié)果表明，放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細菌都主要分為兩大類：Firmicutes類和Bacteroidetes類。放牧牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（79.52%）比舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（62.79%）要高，Bacteroidetes類在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比舍飼牦牛（25.58%）要低。放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃內(nèi)纖維降解菌的差別不大，都為瘤胃內(nèi)優(yōu)勢菌群，但舍飼牦牛瘤胃內(nèi)比放牧牦牛瘤胃內(nèi)的蛋白降解菌和淀粉降解菌更豐富。

關(guān)鍵詞： 牦牛；放牧；舍飼；瘤胃細菌；16S rRNA基因序列

中圖分類號： S823.8+55 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0242-07

青海作為中國牦牛第一大省，擁有豐富的牦牛資源，但放牧草場屬于高寒草甸類型，牧草返青期時間短，枯黃期時間長，枯黃期牧草營養(yǎng)品質(zhì)差難以消化利用，造成青海牦牛在冬季掉膘嚴(yán)重的現(xiàn)象，這些情況嚴(yán)重制約了青海牦牛業(yè)的發(fā)展。而牦牛舍飼情況下則能避免這一情況，但瘤胃細菌多樣性受日糧結(jié)構(gòu)影響顯著。An等（2005年）曾報道全放牧牦牛其瘤胃細菌比之黃牛（補飼）的細菌豐富度要低[1]。但是全放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細菌多樣性比較的研究至今尚未見報道。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣牦牛屠宰廠3頭4歲牦牛瘤胃內(nèi)容物；舍飼牦牛瘤胃內(nèi)容物取自青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院3頭4歲舍飼牦牛瘤胃內(nèi)容物。全放牧牦牛飼料為天然牧草（四川嵩草、細果苔草、高山早熟禾），舍飼牦牛飼料（精料 ∶ 粗料=3 ∶ 7，粗料為燕麥青干草，精料原料為玉米、大豆粕、菜籽粕、麩皮）。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

1.2.1 試劑 引物由上海生工生物工程有限公司合成；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），EDTA（乙二胺四乙酸），NaCl，Tris-HCl（pH值為8.0），RNase，1 mol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），20 mg/μL X-gal（β-半乳糖苷酶），100 mg/mL氨芐青霉素，瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit） 購于QIAGEN 公司；PMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

1.2.2 培養(yǎng)基 液體LB培養(yǎng)基：1.0% 胰蛋白胨（tryptone），0.5% 酵母提取物（yeast extract），1.0% 氯化鈉（NaCl）。

固體LB培養(yǎng)基：1.0% 胰蛋白胨（tryptone），0.5% 酵母提取物（yeast extract），1.0%氯化鈉（NaCl），1.0% 瓊脂粉。

1.3 瘤胃微生物總DNA提取方法

稱取0.15 g瘤胃內(nèi)容物于研缽中，加入1.5 mL 1%CTAB抽提液（100 mmol/L Tris.HCI，pH值為8.0；100 mmol/L EDTA；100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液，pH值為8.0；1.5 mol/L NaCl；1%CTAB），倒入液氮迅速研磨，始終保持研缽中存在液氮，研磨7～8次至研缽內(nèi)樣品成白色粉末狀，等其融化后倒入2 mL離心管內(nèi)，加入10 mg/mL蛋白酶K 20 μL和250 μL SDS（10%），65 ℃水浴2 h（每隔20 min顛倒混勻幾次），7 000 g，離心10 min，取上清。避開上層漂浮物，取中層溶液，加入等體積酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1）抽提，12 000 g、4 ℃離心5 min，取上層溶液，重復(fù)操作1次，至上清不渾濁。然后用氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1）抽提1次，12 000 g、4 ℃ 離心5 min，取上清。加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀 2 h，12 000 g、4 ℃離心15 min，棄上清。用75%的乙醇洗滌沉淀，晾干，用 50 μL TE（pH值為8.0，含10 mg/μL RNase）溶解，37 ℃水浴30 min。

1.4 16S rRNA基因擴增

以瘤胃總DNA逐級稀釋（稀釋5、10、25、50倍）作為模板，使用Premix Taq進行PCR擴增，反應(yīng)體系為50 μL，模板0.5 μL，引物（100 μmol/L）各0.1 μL，Premix Taq 25 μL，ddH2O 25 μL。引物為細菌通用引物：27 F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492 R 5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 DNA的純化回收、克隆以及測序

選擇1.5 kb處條帶最清晰的稀釋倍數(shù)，使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收、純化其PCR產(chǎn)物。將純化回收的目的DNA片段與PMD18-T Vector連接。連接體系：1 μL載體，5 μL solution 1 ，4 μL DNA樣品，16 ℃條件下30 min。轉(zhuǎn)化：取感受態(tài)細胞，冰上融化感受態(tài)2 min，將10 μL上述連接體系加入到感受態(tài)中，冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，冰上放置3～5 min，加入500～700 μL液體LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取AMP（氨芐青霉素）抗性LB平板，提前涂布4 μL 1 mol/L的IPTG和40 μL 20 mg/μL的X-gal于平板上，無菌操作臺上晾干。取轉(zhuǎn)化好的感受態(tài)，4 000 g離心 3 min，棄去部分上清液，留200 μL。用移液器將感受態(tài)細胞吹打混勻，取100 μL涂布平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。氨芐青霉素抗性和藍白斑對陽性克隆進行初選，隨機挑取300個白色單菌落于高頻搖床上6～8 h氨芐青霉素抗性培養(yǎng)，使用引物M13F（-47）5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13R（-48）5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′進行假陽性檢驗，將驗證后的陽性克隆菌液送交上海生工生物工程股份有限公司進行測通，測序引物使用M13F（-47） 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13R（-48） 5′-AGCGGA TAACAATTTCACAC AGGA-3′。

1.6 序列分析

使用MEGA 6軟件中的ClustalW程序?qū)λ行蛄羞M行比對，去掉序列前后的載體序列。Bellerophon軟件檢驗嵌合體序列，去除可能的嵌合體序列[2]。使用Mothur軟件劃分序列OTU單位[3]，選取OTU代表序列，分類學(xué)上相似性大于97%的序列可看做為同一個OTU單位。使用RDP11軟件[4]中的Classifer程序[5]對所有OTU代表序列進行分類。將OTU代表序列在NCBI的Blast程序中搜索相似性最高已知序列以及相似性最高的已知菌種序列[6]。將所有OTU代表序列用MEGA 6軟件中的ClustalW程序重新比對，建樹采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）[7]和Kimura雙參數(shù)距離模型，Bootstrap設(shè)置為1 000[4]，以大腸桿菌（Escherichia coli）作為外群[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU操作單元劃分

青海省河南縣放牧牦牛瘤胃細菌97個序列劃分為83個OTUs，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院舍飼牦牛瘤胃細菌118個序列劃分為86個OTUs。

2.2 RDP分類

青海省河南縣牦牛瘤胃細菌有66個OTUS屬于厚壁菌門（Firmicutes），占總OTUS的79.52%。其中1個OTUS屬于未分類的Firmicutes門；61個OTUS屬于Clostridia綱（占總OTUS的73.49%），除22個OTUS分屬未分類的Clostridiales目外，剩余的39個OTUS分屬于Clostridiales目的Clostridiales_Incertae Sedis ⅩⅢ科（2個OTUS）、Ruminococcaceae科（18個OTUS）、Eubacteriaceae科（1個OTU）和Lachnospiraceae科（18個OTUS）；4個OTUS屬于Negativicutes綱（占總OTUS的4.82%），分屬于Selenomonadales目的Acidaminococcaceae科（3個OTUS）和Veillonellaceae科（1個OTU）。青海省河南縣牦牛瘤胃細菌有16個OTUS屬于擬桿菌門（Bacteroidetes），占總OTUS的19.27%。其中2個OTUS屬于未分類的Bacteroidetes門；14個OTUS屬于Bacteroidia綱（占總OTUS的16.87%），這14個OTUS中13個OTUS屬于未分類的Bacteroidales目，剩余的1個OTU屬于Bacteroidales目的Prevotellaceae科。青海省河南縣牦牛瘤胃細菌有1個OTU屬于黏膠球形菌門（Lentisphaerae），歸類于Oligosphaeria綱（占總OTUS的1.20%）的Oligosphaerales目Oligosphaeraceae科。

青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院舍飼牦牛瘤胃細菌的86個OTUs有54個OTUs（占總OTUs的62.79%）屬于Firmicutes菌門，其中48個OTUs屬于Clostridia菌綱，除6個OTU屬于未分類的Clostridia菌綱外，其余42個OTUs分屬于Clostridiales目的Ruminococcaceae科（18個OTUs）、Lachnospiraceae科（21個OTUs）和Clostridiales_Incertae Sedis ⅩⅢ科（3個OTUs），其中5個OTUs屬于Negativicutes菌綱，分屬于Selenomonadales目的Veillonellaceae科（1個OTU）和Acidaminococcaceae科（4個OTUs）；86個OTUs有22個OTUs（占總OTUs的25.58%）屬于Bacteroidetes菌門，其中8個OTUs不能確定分類，剩余的14個OTUs分屬于Bacteroidales目的Prevotellaceae科（8個OTUs）和Porphyromonadaceae科（6個OTUs）；86個OTUs中剩余的10個OTUs有7個OTUs（占總OTUs的8.14%）屬于Proteobacteria菌門，1個OTU屬于Verrucomicrobia菌門，1個OTU屬于Synergistetes菌門，還有1個OTU在細菌中不能確定其分類地位可能為尚未發(fā)現(xiàn)的新屬。

RDP分類結(jié)果中顯示，青海省河南縣放牧牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（79.52%）比之舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（62.79%）要高，Bacteroidetes類在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比之舍飼牦牛（25.58%）要低。舍飼牦牛RDP分類結(jié)果比之放牧牦牛要豐富。

2.3 16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化分析

2.3.1 青海省河南縣全放牧牦牛瘤胃細菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹分析 83個OTUs中有6個OTUs與已培養(yǎng)細菌的相似性≥97%，占總OTUs的7.23%；20個OTUs與已培養(yǎng)細菌的相似性在90%～96%之間，占總OTUs的24.10%；57個OTUs與已培養(yǎng)細菌的相似性大于90%，占總OTUs的 68.67%。

將83個OTUs代表序列Blast后，取相似性≥97%的已知序列（53個序列）以及已培養(yǎng)瘤胃細菌序列（6個序列）與這83個OTUs代表序列以大腸桿菌（Escherichia coli）為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。由圖1可以看出，系統(tǒng)發(fā)育進化樹上把所有序列分為3個部分：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）。同時，83個OTUs中有66個OTUs屬于Firmicutes，其中1個OTU（YAK-A91）與瘤胃解琥珀酸菌（Succiniclasticum ruminis）相似性97%，1個OTU（YAK-A30）與瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio ruminis）相似性99%，2個OTUs（YAK-A36、YAK-A80）與溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）相似性 98%～99%，1個OTU（YAK-A2）與亨氏丁酸弧菌（Butyrivibrio hungatei）相似性99%；83個OTUs中有16個OTUs屬于Bacteroidetes，其中1個OTU（YAK-A96）屬于帕萊斯氏血矛線蟲（Haemonchus placei）相似性97%；83個OTUs中有1個OTU屬于Lentisphaerae。

YAK-A82序列屬于Firmicutes類，但是從圖1系統(tǒng)發(fā)育進化樹上可以看出其并沒有與Firmicutes類的其他序列歸在一起，其進化距離較遠。因此，YAK-A82可能是目前尚未發(fā)現(xiàn)的新的菌屬。

2.3.2 青海省舍飼牦牛瘤胃細菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹分析 86個OTUs中有8個OTUs與已培養(yǎng)細菌的相似性≥97%，占總OTUs的9.30%；34個OTUs與已培養(yǎng)細菌的相似性在90%～96%之間，占總OTUs的39.53%；44個OTUs與已培養(yǎng)細菌的相似性<90%，占總OTUs的51.16%。

將86個OTUs代表序列Blast比對后，取相似性≥97%的已知序列（54個序列）以及已培養(yǎng)瘤胃細菌序列（9個序列）與這86個OTUs代表序列以大腸桿菌（Escherichia coli）為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，從系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析上可以發(fā)現(xiàn)所有序列主要分為2個部分：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。有1個序列歸類到了Verrucomicrobia菌門。YAK39、YAK58、YAK74、YAK 80、YAK 81、YAK 93、YAK 111在RDP分類中歸于Proteobacteria菌門，但從進化樹上可以發(fā)現(xiàn)，這7個序列并沒有聚在一起，且進化距離較遠，不能確定這7個系列的分類地位。YAK21在RDP分類中歸于Firmicutes這一類，但從樹圖上發(fā)現(xiàn)，這一序列距離Firmicutes其他序列的進化距離較遠，未歸于Firmicutes這一類。由圖2系統(tǒng)發(fā)育進化樹可以看出86個OTUs中有54個OTUs屬于Firmicutes，其中1個OTU（YAK112）與瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio ruminis）相似性99%，2個OTUs（YAK59、YAK75）與羅斯伯里氏菌（Roseburia faecis ）相似性97%～98%，1個OTU（YAK73）與蛋白溶解梭菌（Clostridium proteoclasticum）相似性98%，1個OTU（YAK119）與溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）相似性97%，1個OTU（YAK53）與黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）相似性98%，2個OTUs（YAK103、YAK133）與瘤胃解琥珀酸菌（Succiniclasticum ruminis）相似性97%～98%，1個OTU（YAK91）與Anaerovibrio lipolyticus相似性97%；86個OTUs中有22個OTUs屬于Bacteroidetes。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)全放牧牦牛（97個序列共屬于83個OTUs），舍飼牦牛（118個序列共屬于86個OYUs）說明不管放牧牦牛還是舍飼牦牛瘤胃微生物都非常豐富，比劉利等報道的廣西水牛瘤胃中的細菌多樣性（74個16S rRNA基因序列分屬于51個OTUs分類單位）[9]和王遠亮等報道的荷斯坦奶牛瘤胃細菌多樣性（45個16S rRNA序列分屬于28個OTUs分類單位）[10]更豐富多樣。

由RDP分類結(jié)果可以看出，放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細菌都主要分為2大類：Firmicutes類和Bacteroidetes類。這與Edwards 等闡述的牛瘤胃細菌[11]和Koike等闡述的羊瘤胃細菌[12]主要分為2大類LGCGPB類和CFB類結(jié)果相同。Yang等曾報道，荷斯坦奶牛、大額牛、水牛瘤胃細菌主要分為LGCGPB和CFB2大類[13]。Monica等也曾報道馴鹿瘤胃細菌主要分為LGCGPB和CFB2大類[14]。但青海省河南縣放牧牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（79.52%）比舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（62.79%）要高，Bacteroidetes類在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比舍飼牦牛（25.58%）要低。An等曾報道的甘肅放牧牦牛（54.89%）比晉南舍飼黃牛（16.97%）瘤胃內(nèi)Firmicutes類所占比例要高，而Bacteroidetes類所占比例晉南舍飼黃牛（38.99%）比甘肅放牧牦牛（34.78%）要高[1]。本試驗結(jié)果與這一觀點相符。Fernando 等也曾報道反芻家畜在飼喂精料時，瘤胃內(nèi)Bacteroidetes類占優(yōu)勢[15]。同時，在RDP分類上，舍飼牦牛（歸類于4個菌門）的分類結(jié)果比放牧牦牛（歸類于3個菌門）更加豐富，An等曾報道由于舍飼黃牛的日糧成分比放牧牦牛日糧成分更為復(fù)雜，使其瘤胃微生物更加復(fù)雜多樣[1]。

溶纖維丁酸弧菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃內(nèi)主要的纖維降解菌，而后三者又是公認(rèn)的瘤胃內(nèi)纖維降解的優(yōu)勢菌群；同時溶纖維丁酸弧菌還與瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的降解有關(guān)系；瘤胃解琥珀酸菌可以將瘤胃內(nèi)的琥珀酸轉(zhuǎn)化為丙酸，是瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌種[15]；瘤胃假丁酸弧菌、羅斯伯里氏菌的主要作用是發(fā)酵瘤胃各種碳水化合物，主產(chǎn)物為丁酸[16]；Anaerovibrio lipolyticus菌是瘤胃內(nèi)主要淀粉降解菌之一[17]；亨氏丁酸弧菌能進行少量的乳酸發(fā)酵，且是瘤胃內(nèi)生成乙酸的重要微生物之一[18]；蛋白溶解梭菌有降解瘤胃蛋白質(zhì)的作用。由圖1系統(tǒng)進化樹上可以看出，放牧牦牛瘤胃內(nèi)共檢測到6株已培養(yǎng)細菌分別為1株瘤胃解琥珀酸菌、1株瘤胃假丁酸弧菌、2株溶纖維丁酸弧菌、1株亨氏丁酸弧菌、1株帕萊斯氏血矛線蟲；由圖2可以看出，舍飼牦牛瘤胃內(nèi)9株已培養(yǎng)細菌分別為1株瘤胃假丁酸弧菌、2株羅斯伯里氏菌、1株蛋白溶解梭菌、1株溶纖維丁酸弧菌、1株黃色瘤胃球菌、2株瘤胃解琥珀酸菌、1株Anaerovibrio lipolyticus。由此可以發(fā)現(xiàn)放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃內(nèi)都檢測到了纖維降解菌的存在，其差別不明顯。但是舍飼牦牛瘤胃內(nèi)檢測到了1株主要蛋白降解菌（蛋白溶解梭菌）和1株降解淀粉的細菌（Anaerovibrio lipolyticus），這2種細菌在放牧牦牛瘤胃內(nèi)未檢測到。這是因為舍飼牦牛的日糧中添加有精料，而精料中蛋白質(zhì)和淀粉含量比之天然牧草要高，致使瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)降解菌和淀粉降解菌的菌群數(shù)量增加。Coe等曾報道當(dāng)給反芻家畜飼喂精料時，其瘤胃內(nèi)淀粉降解菌的數(shù)量和種類會增加[19-21]。同時，舍飼牦牛瘤胃內(nèi)檢測到的產(chǎn)丁酸菌的種類（1株瘤胃假丁酸弧菌、2株羅斯伯里氏菌）比放牧牦牛瘤胃內(nèi)檢測到的產(chǎn)丁酸菌的種類（1株瘤胃假丁酸弧菌）要多。溶纖維丁酸弧菌在舍飼牦牛瘤胃內(nèi)（1株溶纖維丁酸弧菌）和放牧牦牛瘤胃（2株溶纖維丁酸弧菌）內(nèi)都有檢測到且差別不明顯，這可能是因為溶纖維丁酸弧菌除了降解纖維素外，對于瘤胃蛋白的降解也有作用有關(guān)，致使這2種條件下日糧的不同對溶纖維丁酸弧菌的影響不大。

4 結(jié)論

放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細菌都主要分為2大類：Firmicutes類和Bacteroidetes類。放牧牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（79.52%）比舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類所占比例（6279%）要高，Bacteroidetes類在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比舍飼牦牛（25.58%）要低。放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃內(nèi)纖維降解菌的差別不大，都為瘤胃內(nèi)優(yōu)勢菌群，但舍飼牦牛瘤胃內(nèi)比放牧牦牛瘤胃內(nèi)的蛋白質(zhì)降解菌和淀粉降解菌更豐富。

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