王 震，魏玉杰，賴(lài) 斌，劉惠亮

焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體的影響

王 震，魏玉杰，賴(lài) 斌，劉惠亮

目的 探討焦油、尼古丁和瑞舒伐他汀對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（endothelial cell protein C receptor,EPCR）的影響。方法 體外分離培養(yǎng)HUVECs并傳代至4～6代，將其分為對(duì)照組，50 mg/L焦油組，10-4mol/L尼古丁組，10-5mol/L瑞舒伐他汀組。各組分別孵育6 h和24 h后，收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分別檢測(cè)并比較細(xì)胞EPCR蛋白表達(dá)和胞漿中信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平。結(jié)果 （1）與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，EPCR蛋白表達(dá)在焦油組孵育6 h（t=29.513，P＜0.001）及24 h（t=41.759，P＜0.001）后均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而尼古丁組、瑞舒伐他汀組均無(wú)明顯變化。（2）與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，mRNA表達(dá)量在焦油組孵育6 h（t=20.753，P＜0.001）和24 h（t=19.897，P＜0.001）后均明顯增加；而尼古丁組、瑞舒伐他汀組均無(wú)明顯變化。結(jié)論 焦油可上調(diào)HUVECs表面EPCR的表達(dá)，而尼古丁和瑞舒伐他汀對(duì)EPCR的表達(dá)無(wú)影響。

焦油；尼古?。蝗鹗娣ニ。粌?nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體

EPCR是存在于細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白，可與蛋白質(zhì)C特異性結(jié)合后將其呈遞給鄰近的凝血酶/血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物，從而加快蛋白質(zhì)C的激活。吸煙作為冠心病的危險(xiǎn)因素之一，近年有研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物可引起可溶性EPCR含量升高及膜聯(lián)EPCR mRNA減少，導(dǎo)致機(jī)體凝血功能障礙，血栓形成[1]。但香煙中所含物質(zhì)種類(lèi)較多，具體是哪些成分影響了EPCR的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。作為香煙主要有害組分之一，尼古丁可在吸煙者的血清中檢測(cè)到，F(xiàn)ahim等[2]發(fā)現(xiàn)尼古丁可促進(jìn)小鼠腦部微血管內(nèi)血栓形成。既往研究發(fā)現(xiàn)降低香煙中焦油的含量，可使冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，但亦有其他研究未發(fā)現(xiàn)這一效應(yīng)[3]，故焦油在冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用有待進(jìn)一步研究。此外有研究表明，他汀類(lèi)藥物除具有降脂作用外，還有抗凝作用[1,4]。故本研究擬選用尼古丁、焦油、瑞舒伐他汀孵育HUVECs，以探索三者對(duì)HUVECs 表面EPCR表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs取自武警某部三甲醫(yī)院婦產(chǎn)科，焦油（中國(guó)科學(xué)院煙草研究所），瑞舒伐他?。ㄖ袊?guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所），尼古?。绹?guó)Sigma公司），內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（endothelial cell medium，ECM） （北京裕恒豐科技有限公司），胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS） （美國(guó)Hyclone公司），胰蛋白酶和I型膠原酶（美國(guó)Gibco公司），羊抗鼠IgG FITC抗體、鼠抗人EPCR抗體（英國(guó)abcam公司），RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRTPCR試劑盒（日本TaKaRa公司），內(nèi)參β-actin和引物（上海生工生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 焦油溶液、瑞舒伐他汀溶液的制備 10 mg/ml焦油原液：焦油經(jīng)甲醇溶液溶解后分裝，并于4℃保存。將一定量的瑞舒伐他汀原粉倒入盛有雙蒸水的燒杯中，使用磁力攪拌器使其完全溶解，最終配置成10-2mol/L溶液，經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾除菌后于4℃保存。

1.2.2 HUVECs的分離培養(yǎng)與分組 取婦產(chǎn)科剖宮產(chǎn)的無(wú)菌臍帶，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行以下操作：將臍帶置于無(wú)菌托盤(pán)，用生理鹽水沖洗干凈，于臍帶兩頭找到臍靜脈并于一端固定結(jié)扎三通管（入口），采用生理鹽水經(jīng)三通管沖洗臍靜脈內(nèi)腔，至出口流出無(wú)色透明液體，再于臍靜脈另外一端固定結(jié)扎另外一個(gè)三通管（出口），注入0.1% I型膠原酶，于37℃無(wú)菌生理鹽水中靜置消化20 min后收集消化液，1000 r/min離心5 min后棄上清，加入含10%FBS的ECM，按1×105/ml的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至90%，吸出培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1×105/ml的密度接種至6孔板孵育過(guò)夜，并隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組，50 mg/L焦油組，10-4mol/L尼古丁組，10-5mmol/L瑞舒伐他汀組，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，均孵育6 h和24 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 提取六孔板內(nèi)細(xì)胞，按試劑盒步驟說(shuō)明操作：（1）分組培養(yǎng)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，加入750 μl 0.25%胰酶消化細(xì)胞，加入2 ml含1%FBS磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）吹打細(xì)胞至懸浮狀態(tài)，轉(zhuǎn)移至流式管；（2）500 r/min離心5 min，使用含1%FBS的PBS洗滌兩次，離心后棄上清加入抗體稀釋液；（3）每管加入1 μl鼠抗人EPCR單克隆抗體，手指輕彈流式管底部混勻細(xì)胞，4℃避光靜置30 min；（4）1%FBS的PBS洗滌兩次后，加入抗體稀釋液和1 μl羊抗鼠IgG FITC二抗，手指輕彈流式管底部混勻細(xì)胞，4℃避光靜置30 min；（5）1%FBS的PBS洗滌兩次，加入300 μl含1%FBS的PBS，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面EPCR的表達(dá)，每次計(jì)數(shù)30 000個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.4 qRT-PCR 提取六孔板內(nèi)細(xì)胞mRNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品的濃度和純度（A260/A280=1.8～2.0）。EPCR上游引物5'-CACCCTGCAGCAGCTCAATGC-3'，下游引物5'-ACATCGCCGTCCACCTGTGC-3'，β-actin 上游引物5'- GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'，下游引物5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃（5 min）預(yù)變性；95℃（15 s），55℃（20 s），72℃（20 s）運(yùn)行40個(gè)循環(huán)；95℃（15 s），59℃（1 min）溶解曲線(xiàn)。采用美國(guó)ABI公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀VIIA7配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，各組結(jié)果以公式2-ΔΔCT表示相對(duì)表達(dá)量，每組設(shè)立3個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀對(duì)EPCR蛋白表達(dá)的影響 各組分別孵育6 h和24 h后，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，尼古丁組和瑞舒伐他汀組EPCR蛋白表達(dá)均上調(diào)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而焦油組孵育6 h（t =29.513，P＜0.001）及24 h（t=41.759，P＜0.001）后細(xì)胞EPCR蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組HUVECs表面EPCR細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)情況（x ±s；n=3）

2.2 尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀對(duì)EPCR mRNA表達(dá)的影響 使用qRT-PCR定量分析各組EPCR mRNA水平的變化，統(tǒng)計(jì)各組2-ΔΔCT值的變化，并設(shè)立對(duì)照組數(shù)值為1。結(jié)果如圖1所示，分別孵育6 h和24 h后，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，尼古丁組和瑞舒伐他汀組EPCR mRNA含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而焦油組孵育6 h（t=20.753，P＜0.001）和24 h（t=19.897，P＜0.001）后mRNA表達(dá)量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)EPCR mRNA相對(duì)水平比較注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，①P＜0.05

3 討 論

蛋白C抗凝系統(tǒng)在人體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，其中EPCR參與蛋白C激活和活化蛋白C所介導(dǎo)的蛋白酶活化受體的激活，從而發(fā)揮相應(yīng)的細(xì)胞效應(yīng)[5]。此外，亦有研究表明EPCR可與活化的VII因子結(jié)合，發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞間屏障保護(hù)功能[6]。EPCR可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等[7]。作為人體較易獲得的細(xì)胞種類(lèi)之一，Lee等[8]使用烏茸菌提取物polyozellin探討其對(duì)HUVECs表面EPCR脫落的影響，樊芳芳等[1]亦使用HUVECs探討香煙提取物對(duì)EPCR表達(dá)的影響，因此本研究選用HUVECs作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

Zhang等[9]使用0.01～100 μmol/L尼古丁分別孵育HUVECs 0、8、24 h，發(fā)現(xiàn)尼古丁可明顯促進(jìn)HUVECs增生，且呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性，因而本研究直接選用10-4mol/L尼古丁孵育HUVECs，并選擇6、24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，但發(fā)現(xiàn)尼古丁對(duì)EPCR的表達(dá)無(wú)影響，而焦油可上調(diào)EPCR的表達(dá)，從而可能增強(qiáng)人體的抗凝作用，這與吸煙易致血栓形成的結(jié)論不一致[10]，因此其上調(diào)效應(yīng)是短期保護(hù)反應(yīng)還是長(zhǎng)期效應(yīng)仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。至于焦油上調(diào)EPCR表達(dá)的具體機(jī)制，既往研究表明，葡萄糖和轉(zhuǎn)錄因子Fli1的基因敲除均可調(diào)節(jié)HUVECs表面EPCR表達(dá)[11]；絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）也可能參與了其表達(dá)調(diào)節(jié)，其中脂多糖可通過(guò)P38 MAPK通路下調(diào)EPCR表達(dá)[12]；腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子可能通過(guò)增加c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） MAPK下調(diào)EPCR的表達(dá)[13]。但焦油是否也通過(guò)該通路或其他信號(hào)通路上調(diào)EPCR仍有待研究。

他汀類(lèi)藥物因其降脂作用而被臨床廣泛應(yīng)用于冠心病等疾病的治療，但隨著研究深入，Yang等[14]發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物可通過(guò)上調(diào)Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而上調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗凝作用。Landsberger等[15]使用10-8～10-5mol/L瑞舒伐他汀孵育HUVECs 8～12 h后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶表達(dá)明顯增加，且與瑞舒伐他汀的濃度呈正相關(guān)。故本研究選用10-5mol/L瑞舒伐他汀分別孵育內(nèi)皮細(xì)胞6、24 h，但EPCR的表達(dá)量均無(wú)明顯變化，這與文獻(xiàn)[1]的研究結(jié)果有所矛盾，可能是不同他汀因分子結(jié)構(gòu)差異較大，導(dǎo)致其降脂以外的多效性有所差別，亦有可能是因孵育時(shí)間較短，EPCR的表達(dá)所需時(shí)間不足，該結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)焦油可上調(diào)EPCR的表達(dá)，而尼古丁和瑞舒伐他汀對(duì)EPCR的表達(dá)無(wú)影響，該結(jié)論與吸煙是心血管疾病的危險(xiǎn)因素這一點(diǎn)不符，這可能是內(nèi)皮細(xì)胞的急性應(yīng)激保護(hù)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，因時(shí)間有限，本研究未深入探索EPCR的表達(dá)是否受尼古丁、焦油和瑞舒伐他汀的濃度及孵育時(shí)間的影響，今后的研究中需進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]樊芳芳,胡曉蕓,扈麗娟,等.辛伐他汀對(duì)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)sEPCR和mEPCR的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2012,28（4）:727-729.

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（2016-01-07收稿 2016-03-08修回）

（責(zé)任編輯 付 輝）

Effects of tar,nicotine and rosuvastatin on expression of EPCR in human umbilical vein endothelial cells

WANG Zhen,WEI Yujie,LAI Bin,and LIU Huiliang.Department of Cardiology,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China

LIU Huiliang,E-mail:huiliangl531@163.com

Objective To explore the effects of tar,nicotine and rosuvastatin on expression of endothelial cell protein C receptor (EPCR)in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods HUVECs were isolated and cultured in vitro,and were randomly divided into control group,50 mg/L tar group,10-4mol/L nicotine group,10-5mol/L rosuvastatin at passage 4 to 6.All groups were incubated for 6 h and 24 h,then collected the HUVECs.Flow cytometry and quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR)were respectively used to detect and compare expression of EPCR protein and the EPCR level of messenger ribonucleic acid (mRNA)of in each HUVECs group.Results (1)Compared with control group at the same time point,expression of EPCR protein in 50 mg/L tar group after incubated for 6 h (t=29.513，P＜0.001)and 24 h (t=41.759，P＜0.001)were both increased,and the differences were statistically significant;but in 10-4mol/L nicotine group and 10-5mol/L rosuvastatin group had no obvious change.(2)Compared with control group at the same time point,expression of EPCR mRNA in 50 mg/L tar group after incubated for 6 h (t=20.753，P＜0.001)and 24 h (t=19.897，P＜0.001)were significantly increased;but there were no significant change in 10-4mol/L nicotine group and 10-5mol/L rosuvastatin group.Conclusions Tar has the effect of up-regulating the expression of EPCR in HUVECs,whereas nicotine and rosuvastatin have no effect on the expression of EPCR in HUVECs.

tar;nicotine;rosuvastatin;endothelial cell protein C receptor

R363

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.04.005

王 震，碩士研究生在讀，E-mail:wzlunwen@126.com

100039 北京，武警總醫(yī)院心內(nèi)科

劉惠亮，E-mail:huiliangl531@163.com