張 曄，高紅梅，陳文麗，譚青海 綜述 張健鵬 審校

微生物揮發(fā)性有機(jī)物的檢測(cè)及臨床應(yīng)用進(jìn)展

張 曄，高紅梅，陳文麗，譚青海 綜述 張健鵬 審校

感染性疾病是威脅人類健康的重大疾病之一。目前感染性微生物的變異率越來越高，微生物種類越來越多，出現(xiàn)次數(shù)也愈加頻繁，這些嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)給病原微生物的鑒定提出了更大的挑戰(zhàn)。因此，研究和發(fā)展一種實(shí)時(shí)、高效檢測(cè)微生物揮發(fā)性有機(jī)物（microbial volatile organic compounds，MVOCs）的技術(shù)，快速鑒定病原微生物，對(duì)感染性疾病的早期臨床治療和預(yù)后有重要意義。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)，簡要介紹了國內(nèi)外幾種常見檢測(cè)MVOCs的方法及基本原理，對(duì)其近年來在感染性微生物鑒定中的最新應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并展望其未來發(fā)展趨勢(shì)。

微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物；檢測(cè)技術(shù)；微生物鑒定

MVOCs是微生物生長和發(fā)育過程中代謝產(chǎn)生的，并與其生長活動(dòng)密切相關(guān)的，在常溫常壓下具有揮發(fā)性質(zhì)的化合物[1-3]。目前檢測(cè)MVOCs的方法主要有氣相色譜法、質(zhì)譜法、傳感器或電子鼻法和光聲光譜法等[1-3]。筆者就這幾種常見的方法、基本原理及其近年來在感染性微生物鑒定中的最新應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 氣相色譜法

氣相色譜法是Martin等[4]于1952年創(chuàng)立的一種以氣體為流動(dòng)相，采用沖洗法的柱色譜分離技術(shù)，其基本原理是汽化的樣品從色譜柱入口進(jìn)入載氣氣流中，連續(xù)經(jīng)過色譜柱。色譜柱是一種涂有惰性載體的管子，樣品中的各組分在柱內(nèi)流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行分配而分離，最后得到樣品的色譜圖[4,5]。

1966年，Henis等[5]首次報(bào)導(dǎo)，使用氣相色譜法檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)液，獲得細(xì)菌各種代謝產(chǎn)物的色譜圖，這些色譜圖表現(xiàn)出了細(xì)菌屬性或種的特征。Mitruka等[6]用氣相色譜法分析了各種需氧菌培養(yǎng)物中的有機(jī)酸，根據(jù)有機(jī)酸色譜圖的不同鑒別了多種革蘭陰性和陽性需氧菌。隨著氣相色譜法的廣泛應(yīng)用，近期衍生出了裂解氣相色譜法（pyrolysis gas chromatography，PGC），在使用流程上做了較大改進(jìn)，并在一定程度上提高了其選擇性和靈敏度[6,7]。周方等[7]用居里點(diǎn)裂解器-10型氣相色譜儀和CDS型固體樣品裂解器-Hewletr-Paekard 5840A報(bào)告式氣相色譜儀對(duì)桿菌和弧菌的干燥菌粉、腸道桿菌新鮮培養(yǎng)物的水混懸液進(jìn)行裂解鑒定，可根據(jù)其色譜圖特征峰的不同對(duì)各種細(xì)菌進(jìn)行區(qū)別。

氣相色譜法是一種能高效分離復(fù)雜混合物，特別是低極性、熱穩(wěn)定性物質(zhì)的技術(shù)。然而，其存在的主要缺點(diǎn)有：（1）待測(cè)物質(zhì)必須通過乙醚等基質(zhì)預(yù)先處理，變成氣體；（2）操作過程較繁瑣，且必須有預(yù)先標(biāo)定的色譜柱，同時(shí)所有結(jié)果受操作過程影響較大，導(dǎo)致其靈敏度、選擇性及穩(wěn)定性均較差；（3）設(shè)備較昂貴。

2 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法的基本原理是將待測(cè)物質(zhì)離子化后通過適當(dāng)?shù)碾妶?、磁場，由于其空間位置、時(shí)間或軌道等因素不同，導(dǎo)致質(zhì)荷比分離，并按照質(zhì)荷比的大小順序排列[8]。離子化質(zhì)譜是一種能產(chǎn)生帶電荷的分子碎片并獲得其質(zhì)荷比，可以表征母體分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有更高靈敏度和選擇性的一種新型質(zhì)譜技術(shù)。Dolch等[9]運(yùn)用離子化質(zhì)譜技術(shù)，將6種革蘭陰性細(xì)菌（陰溝桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣克雷伯桿菌及沙雷氏菌）在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體進(jìn)行檢測(cè)，通過主成分分析和聚類分析，將各細(xì)菌一一區(qū)別。目前在檢測(cè)MVOCs方面，較常用的主要是離子質(zhì)譜與其他技術(shù)聯(lián)用的方法。

氣相色譜與離子化質(zhì)譜的有機(jī)結(jié)合在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，是目前分析揮發(fā)性化合物的傳統(tǒng)技術(shù)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）的基本原理是氣化的樣品在載氣攜帶下流經(jīng)色譜柱，根據(jù)其分配系數(shù)的不同先后從色譜柱流出，并進(jìn)入質(zhì)譜儀，進(jìn)而得到各組分的質(zhì)譜圖[9]。

李絢梅和應(yīng)可凈[10]利用固相萃取及GC-MS技術(shù)研究了肺部感染幾種常見致病菌，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌的特征性揮發(fā)物分別是吲哚、十一烷醇、丁基羥基甲苯。Barbieri等[11]運(yùn)用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（solidphase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GCMS）檢測(cè)感染了巴氏葡萄球菌的塊狀松露，發(fā)現(xiàn)了45種細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)揮發(fā)物。Matysik等[12]運(yùn)用SPME-GCMS技術(shù)，成功區(qū)分幾種霉菌屬，并發(fā)現(xiàn)1，3-二甲氧基苯、2，4-戊二酮分別為雜色曲霉菌、抗性曲霉菌的特征揮發(fā)性產(chǎn)物。

然而，隨著GC-MS技術(shù)被廣泛地運(yùn)用，該方法存在的一些問題也不容忽視：（1）分析化合物種類少，檢測(cè)周期長；（2）獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有時(shí)無規(guī)律或不理想；（3）在數(shù)據(jù)處理及分析時(shí)，不能較好地定量研究化合物的強(qiáng)度及從相應(yīng)揮發(fā)性特征提取潛在生物信息等。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜（proton transfer reaction-mass spectrometry，PTR-MS）的基本原理是根據(jù)被測(cè)物的質(zhì)子親和力能高于水而低于高聚水的性質(zhì)，使物質(zhì)電離后多種揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds,Vocs）能與H3O+進(jìn)行質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，產(chǎn)生分子離子，根據(jù)其分子量信息，對(duì)混合物成分定性定量分析[13,14]。

Bunge等[15]運(yùn)用PTR-MS很好地區(qū)分了大腸桿菌、福氏志賀菌、腸炎沙門氏菌、熱帶假絲酵母菌。Hara 等[16]將金黃色葡萄球菌分別接種在富含營養(yǎng)、葡萄糖及牛腦心培養(yǎng)液上，用PTR-MS進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)類型與培養(yǎng)液的類型關(guān)系不大，但是其濃度與時(shí)間密切相關(guān)。

選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜（selective ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）是一種選擇離子流動(dòng)管技術(shù)與質(zhì)譜分析相結(jié)合的方法，其主要原理為水和空氣經(jīng)微波放電后，產(chǎn)生初始離子與待測(cè)氣體進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的離子在分析器中進(jìn)行質(zhì)量分析。Thorn等[17]運(yùn)用SIFT-MS聯(lián)合矩陣分析、聚類分析及多元統(tǒng)計(jì)分析，成功將綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等區(qū)別開來。

然而，SIFT-MS和PTR-MS僅適用于檢測(cè)小分子MVOCs，并且需真空系統(tǒng)來維持離子反應(yīng)區(qū)，導(dǎo)致其系統(tǒng)整體龐大，能量消耗較高。此外，由于離子之間的反應(yīng)，不可避免地形成許多離子性簇化物（clusters）。因此，所獲得的譜圖趨于復(fù)雜，即使是專業(yè)人士，也較難準(zhǔn)確解析質(zhì)譜圖。

相對(duì)上述質(zhì)譜分析方法需在真空環(huán)境下操作，多毛細(xì)管柱離子遷移譜技術(shù)（multi-capillary column-ion mobility spectrometer，MCC-IMS）是一種可以在大氣環(huán)境下工作，簡便、快速、靈敏度高的新技術(shù)，其工作原理主要是：待測(cè)樣品由載氣（如空氣、氮?dú)獾龋腚婋x反應(yīng)區(qū)后，載氣分子和樣品分子在離子源的作用下發(fā)生電離反應(yīng)和離子-分子反應(yīng)，產(chǎn)生各種離子。在電場的驅(qū)使及與逆流的中性漂移氣體分子不斷碰撞過程中，這些離子根據(jù)各自遷移速率的不同，先后進(jìn)入漂移區(qū)而被檢測(cè)，見圖1。

圖1 多毛細(xì)管柱離子遷移譜技術(shù)裝置原理[18]

Sasidhar等[19]利用MCC-IMS技術(shù)對(duì)大腸桿菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)，乙醇、丙酮、庚烷-2-酮和2-壬酮四種代謝產(chǎn)物與其生長相關(guān)。此外，大腸桿菌數(shù)量與空間代謝物濃度之間呈正相關(guān)。Perl等[20]運(yùn)用MCCIMS檢測(cè)了煙曲霉菌及四種念珠菌的揮發(fā)性氣體，通過分析3-辛酮、苯乙醇在各種微生物間的不同，能夠明顯區(qū)分曲霉菌和各種念珠菌，但不能有效進(jìn)行念珠菌屬之間的區(qū)分。Kunze等[21]運(yùn)用MCC-IMS分析技術(shù)對(duì)在溶原肉湯液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)的大腸桿菌和綠膿桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)正癸醇、吲哚、辛烷單體及二聚體結(jié)構(gòu)有助于鑒定大腸桿菌，而2-丙酮，氨二聚體、十二烷、乙基己醇等與綠膿桿菌鑒定相關(guān)。以上的研究表明，MCC-IMS是一種實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)微生物代謝產(chǎn)物的方法，在感染病原學(xué)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。

3 電子鼻法

電子鼻法是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的，以模擬人的嗅覺傳導(dǎo)系統(tǒng)，進(jìn)而檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)的一種電子傳感技術(shù)，其主要原理是，待測(cè)氣體分子通過氣味傳感器陣列（初級(jí)嗅覺神經(jīng)元），引起傳感器陣列發(fā)生響應(yīng)（即電信號(hào)），微弱的電信號(hào)經(jīng)集成電路識(shí)別與放大（二級(jí)嗅覺神經(jīng)元），最后由計(jì)算機(jī)分析軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析（cluster analysis，CA）等處理，進(jìn)而區(qū)分不同氣體分子及細(xì)菌[22]。PCA主要是通過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維傳感器陣列響應(yīng)的特征向量進(jìn)行線性分類，并以PCA 散點(diǎn)圖的形式展現(xiàn)，從而將原來許多變量重新組合成一組新的互相無關(guān)的幾個(gè)綜合變量。CA是按照物以類聚的原則，使特征向量矩陣置于一個(gè)多維空間中，將具有相似屬性的變量聚為一類，并根據(jù)各自屬性的不同進(jìn)行區(qū)分[23,24]。

Parry等[24]利用電子鼻對(duì)腿部潰瘍產(chǎn)生的特殊氣味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，可明確區(qū)分金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染引起的潰瘍。Setkus等[25]也對(duì)引起傷口感染的細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，能夠確定傷口感染類型和感染階段。Bruins等[23]通過使用一種稱作mononose的電子鼻對(duì)37℃下培養(yǎng)6～8 h后的52株不同致病菌產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體進(jìn)行檢測(cè)。其中，艱難梭狀芽胞桿菌的診斷特異性是100%，陰溝桿菌的特異性是67%，總的特異性是87%。鄧高燕等[26]運(yùn)用電子鼻法對(duì)5株單增李斯特菌和5株副溶血性弧菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)合 PCA和 CA等化學(xué)分析方法進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電子鼻能夠很好地將5株單增李斯特菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物圖譜進(jìn)行區(qū)分，而在同一技術(shù)條件下只能對(duì)5株副溶血性弧菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物圖譜進(jìn)行部分區(qū)分。然而，若向這5株副溶血性弧菌的培養(yǎng)液中添加NaCl至飽和，則可完全區(qū)分這5株細(xì)菌。

胡惠平等[2]利用電子鼻和頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS）對(duì)3株從豬肉中分離的假單胞菌在胰酪胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）純培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，成功區(qū)分3 株假單胞菌，并發(fā)現(xiàn)這3株細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)各不相同。陳雪等[27]采用GC-MS技術(shù)與電子鼻技術(shù)對(duì)5種常見李斯特屬細(xì)菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性及相對(duì)定量研究，獲得李斯特菌共有的揮發(fā)性化合物和特有的化學(xué)物質(zhì)，有望用來作為單增李斯特菌鑒定的依據(jù)。

由于電子鼻結(jié)構(gòu)的特殊性，它只能對(duì)整體混合物的揮發(fā)性特征做出作出分析，很難對(duì)單獨(dú)的揮發(fā)性成分做出具體分析。同時(shí)受到傳感器靈敏度、模式識(shí)別等技術(shù)方面影響，電子鼻在低濃度的揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)中受到一定限制，更無法進(jìn)一步進(jìn)行定量分析，因此，電子鼻目前僅用于辨識(shí)或檢測(cè)一種揮發(fā)性成分或少數(shù)幾種揮發(fā)性成分的混合物。對(duì)于典型揮發(fā)性成分的確定或復(fù)雜揮發(fā)性成分體系的分析，電子鼻的使用受到明顯限制[28]，且這些研究尚處于試驗(yàn)研究階段，對(duì)微生物鑒定的靈敏度、穩(wěn)定性及選擇性仍不容樂觀，這在一定程度上阻礙了其在臨床中的應(yīng)用。

4 光聲光譜法

光聲光譜法是建立在光聲效應(yīng)基礎(chǔ)上，反映物質(zhì)與光相互作用的特性，其本質(zhì)是一個(gè)光、熱、聲、電的能量轉(zhuǎn)移過程[29]。由于其體現(xiàn)的是透射光與入射光強(qiáng)度的比值及弱吸收的情況，很小的吸收也能被微音器檢測(cè)，所以光聲光譜的靈敏度和選擇性均較高。其基本測(cè)量原理是單色光源（如紅外激光）通過光聲池，使待測(cè)氣體吸收光能量，隨即后產(chǎn)生脈沖壓力波（即聲信號(hào)），光學(xué)微音器檢測(cè)聲壓的微小變化，其聲壓信號(hào)的幅度與待測(cè)氣體濃度成正比[29,30]。

傳統(tǒng)的氣相色譜、質(zhì)譜及電子鼻檢測(cè)方法只能間斷采樣，靈敏度較低，且需要長時(shí)間收集氣體，易干擾微生物的生長過程，引起測(cè)量誤差。而高靈敏度的光聲光譜檢測(cè)技術(shù)則消除了上述缺點(diǎn)，為生物組織微量氣體研究提供了一種新的手段。作為一種更便宜、實(shí)時(shí)、高效的分析儀器，該技術(shù)除在化學(xué)藥品、毒品、炸藥及環(huán)境污染物氣體檢測(cè)方面得到普遍應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有相關(guān)應(yīng)用[30-33]。Inagaki等[34]使用真空紫外光束（300～130 nm）作為光源，檢測(cè)到脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、溶菌酶（lysozyme）、烯（squalene）、酵母細(xì)胞、胸腺嘧啶（thymine）、酪氨酸（tyrosin）、腺嘌呤（adenine）、麥角甾醇（ergosterol）和多聚苷酸（polyadenylicacid）等生物分子的真空紫外光聲光譜。Poulet等[35]用光聲光譜技術(shù)研究了人血中血紅蛋白和載氧血紅蛋白的光聲光譜，并對(duì)人血的氧化作用和沉降速率等問題進(jìn)行了研究。Arslanov等[36]對(duì)綠膿桿菌中的氰化氫進(jìn)行連續(xù)13 d的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其濃度變化與時(shí)間變化的相關(guān)性。周篪聲等[37]利用自制雙光束光聲光譜檢測(cè)裝置測(cè)量了人體（如胃、子宮、肺等）癌變組織和正常組織的光聲光譜，發(fā)現(xiàn)人體癌變組織均在630 nm 附近有吸收峰出現(xiàn)，而正常組織均無此峰。由此初步判斷在630 nm處出現(xiàn)的吸收峰是反映癌變組織所特有分子結(jié)構(gòu)的特征譜帶，因而可用來作為診斷癌癥的重要依據(jù)，同時(shí)也為激光治療癌癥提供了有價(jià)值的光學(xué)資料[38]?？傊?，光聲光譜技術(shù)檢測(cè)MVOCs用于微生物鑒定方面的研究屬國內(nèi)外首創(chuàng)，具有較大的研究空間和臨床應(yīng)用價(jià)值，但是，建立大型的標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)庫，形成計(jì)算機(jī)自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)，后期仍需要大量的研究。

5 展 望

MVOCs種類較多、成分復(fù)雜，其檢測(cè)技術(shù)也形式多樣，且各有利弊。氣相色譜法和質(zhì)譜法是目前發(fā)展較為成熟的技術(shù)，相關(guān)報(bào)道較多并取得了一些研究成果。但其預(yù)處理較復(fù)雜，操作過程較繁瑣，設(shè)備較昂貴，且只能用于檢測(cè)已知樣品，靈敏度、選擇性及穩(wěn)定性均受到一定限制。電子鼻法是一種傳感器診斷方法，但只能對(duì)整體混合物的生物揮發(fā)性特征作出響應(yīng)，很難對(duì)單獨(dú)揮發(fā)性成分做出具體分析。同時(shí)受傳感器靈敏度、模式識(shí)別等技術(shù)方面的影響，其臨床應(yīng)用受到了一定的阻礙。光聲光譜技術(shù)光源強(qiáng)度大、波長可調(diào)，信噪比大，靈敏度高，樣品無需進(jìn)行復(fù)雜的前處理，保持了生物試樣的自然狀態(tài)，減少了其他方法難以避免的誤差。此外，其構(gòu)造簡單，體積小，價(jià)格較低，且易于和其他儀器（如電子計(jì)算機(jī)）聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。然而，光聲光譜技術(shù)仍處于發(fā)展階段，如需用于感染性致病菌的鑒定和臨床疾病的診斷，有待更深入的研究?？傊?，通過檢測(cè)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)一步鑒定病原微生物的方法是可行的，但是，其在臨床中的應(yīng)用任重而道遠(yuǎn)。

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（2016-01-15收稿 2016-03-03修回）

（責(zé)任編輯 付 輝）

Research progress on detection and clinical application of microbial volatile organic compounds

ZHANG Ye,GAO Hongmei,CHEN Wenli,TAN Qinghai,and ZHANG Jianpeng.Department of Internal Respiratory,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China

ZHANG Jianpeng,E-mail:zjp99vip@sina.com

Infectious disease is one of the serious diseases threating human health.At present,the aberration rate of infectious microorganism turns to be higher,species of microorganism are becoming diversified,and appears more frequently,these grim facts put forward greater challenges on identification of pathogenic microorganisms.Thus,it is of critical meaningful for early clinical treatment and prognosis of infectious diseases by developing a real-time and efficient technology that could detect microbial volatile organic compounds,and quickly identify pathogenic microorganisms.The author reviewed literatures,briefly introduced several common methods of MVOCs detection and their basic principles at home and abroad,summarized their latest application progress in identification of pathogenic microorganisms,and prospected their future development trend.

microbial volatile organic compounds;detection technology;microbial identification

R56

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.04.011

張 曄，碩士研究生在讀，

E-mail:zhangye422208@163.com

100039 北京，武警總醫(yī)院呼吸內(nèi)科

張健鵬，E-mail:zjp99vip@sina.com