馮健男　杜守穎　白潔　陸洋　李鵬躍　武慧超

100102　北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[馮健男(碩士研究生)、杜守穎、白潔、陸洋、李鵬躍、武慧超]

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星點-效應(yīng)面法優(yōu)化芍藥苷醇質(zhì)體制備工藝

馮健男杜守穎白潔陸洋李鵬躍武慧超

100102北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[馮健男(碩士研究生)、杜守穎、白潔、陸洋、李鵬躍、武慧超]

【摘要】目的Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化芍藥苷醇質(zhì)體的制備工藝。方法采用逆相蒸發(fā)法制備芍藥苷醇質(zhì)體。以磷脂與膽固醇比例(X1)、磷脂濃度(X2)、芍藥苷濃度(X3)為考察因素，包封率(Y)為評價指標，采用Box-Behnken效應(yīng)面法對處方工藝進行優(yōu)化。結(jié)果最佳處方為磷脂與膽固醇比例(mg/mg)=5.0，磷脂濃度(mg/mL)=18.0 mg/mL，芍藥苷濃度(mg/mL)=5.2 mg/mL。包封率為(44.27±0.27)%，標準偏差均小于10%；粒徑為(167.77±14.91)nm，多分散系數(shù)為(0.41±0.20)(n=3)，變形性良好。結(jié)論采用Box-Behnken效應(yīng)面法對芍藥苷醇質(zhì)體處方進行優(yōu)化是可行和有效的。

【關(guān)鍵詞】芍藥苷；醇質(zhì)體；Box-Behnken效應(yīng)面法；粒徑；變形性

芍藥苷(paeoniflorin，PF)作為白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)的主要活性成分，在臨床上可用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]。實驗結(jié)果表明，芍藥苷可以通過抑制白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的分泌抑制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的原發(fā)和繼發(fā)性炎癥[2]。有文獻報道[3-4]，芍藥苷微乳在降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)、下調(diào)增高的T細胞和B細胞增殖反應(yīng)、促進T細胞分泌IL-2等方面的作用較明顯。

然而藥代動力學(xué)表明芍藥苷的口服生物利用度極低[5-6]，單獨給大鼠灌胃芍藥苷，其生物利用度只有0.3%；同時由于小腸的滲透性較差，導(dǎo)致芍藥苷吸收效果差[7]。芍藥苷的半衰期為(88.87±5.3)分鐘[8]，因此，臨床治療關(guān)節(jié)炎時，需要多次、長期給藥以達到有效的關(guān)節(jié)腔濃度，服用次數(shù)每天需3次，每天用量達600 mg(以芍藥苷計)，平均用藥周期達48天[9]。因此為充分發(fā)揮芍藥苷的藥效，需改變傳統(tǒng)口服給藥方式。

醇質(zhì)體是一種含醇脂質(zhì)體。醇質(zhì)體在傳遞過程中，一方面可能與角質(zhì)層脂質(zhì)融合將藥物直接釋放到細胞內(nèi)發(fā)揮作用，另外醇質(zhì)體還可以通過變形透過比自身小的角質(zhì)層細胞間隙并進入血液循環(huán)，易于到達皮膚深部，提高藥物的經(jīng)皮速率，增加藥物在皮膚內(nèi)的滯留時間[10]。本實驗擬制備高滲透性芍藥苷醇質(zhì)體載藥系統(tǒng)，以充分發(fā)揮芍藥苷的藥效，為后期新型透皮給藥系統(tǒng)的研究提供參考和依據(jù)。

1材料

日本島津高效液相色譜儀(LC-20AT四元泵、Model 1690柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器)；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SCIENTZ IID型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；渦旋混合器(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；Ultracel YM-30超濾管(Millipore)；Zetasize Nano ZS納米粒度儀(英國 Malvern公司)；恒溫磁力攪拌器(金壇市鴻科儀器廠)；氣體減壓器(上海減壓器廠有限公司)；純氮氣(氧立來有限公司)。

芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110736-201438)；芍藥苷提取物(≥98%，南京澤朗生物科技有限公司)；大豆磷脂酰膽堿S-100(Lipoid S 100，德國Lipoid公司，批號F20090050)；膽固醇(Cholesterol，美國Amresco公司)；純凈水(娃哈哈集團有限公司)；無水乙醇(北京化工廠)；無水乙醚(北京化工廠)；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1醇質(zhì)體的制備

將磷脂和膽固醇的無水乙醚溶液作為油相；于室溫下將芍藥苷的醇溶液加入油相中，搖勻后冰浴探頭式超聲，使形成油包水型乳劑；將上述乳劑快速轉(zhuǎn)移至250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，室溫減壓蒸發(fā)至凝膠狀；渦旋使凝膠部分塌陷，減壓蒸發(fā)殘留乙醚得醇質(zhì)體混懸液；探頭式超聲，即得。4℃遮光密閉保存。

2.2包封率的測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Merck C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液(14：86)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.2.2低速離心-超濾法測定包封率精密移取醇質(zhì)體0.4 mL，置于截留分子量為30 kd的超濾離心管6000 rpm[11]中，離心30分鐘，吸取0.2 mL濾液，定容至2 mL，超聲處理后，測定芍藥苷含量為W1；精密移取醇質(zhì)體溶液0.2 mL，加甲醇定容至5.0 mL，超聲溶解，測定芍藥苷含量為W2，計算包封率公式為EE%=(1-W1/W2)×100%。

2.3芍藥苷醇質(zhì)體的單因素考察

以包封率為指標，分別對磷脂和膽固醇質(zhì)量比、磷脂濃度和芍藥苷濃度進行單因素考察。結(jié)果顯示：隨著磷脂和膽固醇質(zhì)量比的增加包封率逐漸增大，當磷脂和膽固醇比例為5∶1時，包封率最高為(24.85±4.14)%；隨著磷脂濃度的增加，包封率也逐漸增大，當磷脂濃度為13.6 mg/mL時，芍藥苷濃度為2.8 mg/mL時，包封率達到最大為(36.87±5.11)%。

2.4Box-Behnken法優(yōu)化醇質(zhì)體處方

2.4.1Box-Behnken 法分析因素水平的選取和試驗設(shè)計在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇對芍藥苷醇質(zhì)體包封率影響顯著的三個因素：磷脂與膽固醇比例(X1)、磷脂濃度(X2)、芍藥苷濃度(X3)作為因素，設(shè)計因素水平見表1。以包封率(Y)作為響應(yīng)值，共設(shè)計了17次試驗。試驗結(jié)果見表2。

表1　Box-Behnken設(shè)計因素水平表

2.4.2多元二項式模型回歸擬合結(jié)果根據(jù)各項指標F檢驗的結(jié)果，再采用Design-Expert 8.0進行二次擬合，得到如下簡化模型：Y=42.87+0.67×X1+1.65×X2-3.50×X3+0.83×X1×X2+0.47×X1×X3-3.11×X2×X3-21.34×X12-17.44×X22-12.70×X32(R2=0.9777)。

通過方程可以看出，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對芍藥苷醇質(zhì)體包封率的影響為：X3>X2>X1，同時各因素存在交互作用。

2.4.3方差和顯著性檢驗方程Y的R2為0.9777，方差分析結(jié)果顯示Y失擬檢驗的P>0.05，說明方程Y回歸模型擬合情況理想，其校正決定系數(shù)Radj2為0.9490，表明模型響應(yīng)值的變化有94.90%來源于自變量，實驗誤差較小，可較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，故可以準確分析和預(yù)測包封率；顯著性檢驗可知，模型的一次項中，X3(芍藥苷濃度)最顯著(P=0.0360)；二次項X12和X22(P<0.0001)極顯著，X32(P<0.05)顯著。

表2　Box-Behnken 實驗設(shè)計及響應(yīng)值(n=3)

2.4.4工藝參數(shù)預(yù)測和優(yōu)化根據(jù)二次多項回歸方程擬合結(jié)果，固定其中一個因素水平，即作為中心點值，繪出Y與其他兩個因素的三維效應(yīng)曲面圖和等高線圖，預(yù)測芍藥苷醇質(zhì)體最佳處方配比，見圖1。

從圖1三維曲面圖可看出，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，醇質(zhì)體包封率在X1值、X2值和X3值均存在極大值。當磷脂和膽固醇比例(X1)值大于5時，Y值隨著X1值的增大而減??；當磷脂濃度(X2)值大于17 mg/mL時，Y值隨著X2值的增大而降低；當芍藥苷濃度(X3)大于5.6 mg/mL時，Y值隨著X3值的增大而降低。

2.4.5根據(jù)Box-Behnken法優(yōu)化醇質(zhì)體處方的試驗結(jié)果進行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的處方磷脂與膽固醇比例(mg/mg)=5.03，磷脂濃度(mg/mL)=17.62 mg/mL，芍藥苷濃度(mg/mL)=5.19 mg/mL?？紤]操作可行性，按照處方磷脂與膽固醇比例(mg/mg)=5.0，磷脂濃度(mg/mL)=18.0 mg/mL，芍藥苷濃度(mg/mL)=5.2 mg/mL制備3批芍藥苷醇質(zhì)體，測定包封率。結(jié)果見表3。試驗值和模型預(yù)測值對比，結(jié)果絕對偏差小于10%，說明模型Y可以較好地描述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，能較好地預(yù)測分析芍藥苷醇質(zhì)體的處方。

圖1　效應(yīng)值Y與(X1和X2)、(X1和X3)、(X2和X3)三因素的三維曲面圖(A)和等高線圖(B)

指標預(yù)測值觀察值預(yù)測誤差包封率(%)43.1844.27±0.273.43

注： 預(yù)測誤差=(預(yù)測值-觀察值)/觀察值

2.5芍藥苷醇質(zhì)體的粒徑分布

按照優(yōu)化處方制備3批芍藥苷醇質(zhì)體，分別稀釋100倍后，通過激光粒度分析儀測定粒徑分布，結(jié)果呈單峰正態(tài)，平均粒徑為(167.77±14.91)nm，多分散系數(shù)為(0.41±0.20)(n=3)，見圖2。

圖2　芍藥苷醇質(zhì)體的粒徑分布圖

2.6變形性考察

考察芍藥苷醇質(zhì)體在外壓(0.1、0.2和0.3 Mpa)作用下，具有變形透過孔徑為0.22 μm微孔濾膜的能力[12]。先觀測芍藥苷醇質(zhì)體3 mL透過濾膜的時間，再觀測3 mL水透過濾膜的時間，計算相對透過速率(P)，見公式，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，隨著壓力的升高，P值相應(yīng)變大。在0.3 MPa壓強作用下，芍藥苷醇質(zhì)體的P值平均達到62%，可見芍藥苷醇質(zhì)體具有較好的變形性。

表4　芍藥苷醇質(zhì)體透過濾膜時間(n=3， s)

注：P=V醇質(zhì)體/V水×100%

3討論

全文曾嘗試引入包封率、載藥量和綜合評價指標OD值[13]，結(jié)果以載藥量和OD值得到的方程擬合情況不好，故無法兼顧包封率和載藥量兩個指標。最終選擇包封率作為優(yōu)化指標，通過Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方并構(gòu)建Y模型，模型擬合情況良好，能反映處方的包封率。經(jīng)驗證，優(yōu)化處方的包封率的預(yù)測值與試驗值吻合情況良好。

通過擬合方程和方差分析，發(fā)現(xiàn)處方因素之間存在一定的交互作用，按照對包封率的影響排序：X2X3>X1X2>X1X3，但進一步通過方差分析可見交互作用并不顯著；從擬合方程和方差分析得到二次項X12、X22和X32對Y值影響均顯著。三維曲面圖可看出，響應(yīng)值均為一曲面，均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。X1=5時包封率存在極大值，這是因為膽固醇可增加醇質(zhì)體膜的致密性，穩(wěn)定醇質(zhì)體膜，隨著膽固醇用量的相對減小，在相同質(zhì)量的脂質(zhì)膜中，醇質(zhì)體膜的剛性降低，總表面積增大，所包封的藥物含量增加，包封率增加，但隨著磷脂用量的相對增加，醇質(zhì)體膜的不對稱性和通透性隨之增加，藥物滲漏增加，致使包封率下降；X2=17時，包封率存在極大值，這是因為包封率通常隨著磷脂濃度的升高而增大，但如果磷脂濃度過大，容易形成多室脂質(zhì)體，使內(nèi)水相體積變小，導(dǎo)致包封率也變小[14]；X3=5.6時，包封率存在極大值，這是由于當藥物用量過小，醇質(zhì)體膜內(nèi)外藥物濃度差較小，不利于藥物的包裹，導(dǎo)致包封率降低；同時，磷脂對藥物的結(jié)合量存在飽和值[15]，當達到該飽和濃度時，藥物將以游離態(tài)存在，包封率也將降低。

文獻報道的水溶性藥物的醇質(zhì)體的包封率從10%～86.42%不等[16-17]，這與制備方法、載體材料、處方水平等多種因素有關(guān)。實驗制備的芍藥苷醇質(zhì)體包封率并不高，若進一步提高芍藥苷這種水溶性藥物的包封率，下一步可以考慮從優(yōu)選載體材料、擴大各因素水平的設(shè)置以及在逆相蒸發(fā)法的第一步首先制備成更加穩(wěn)定的乳劑等方面進行研究。

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(本文編輯： 董歷華)

Preparationand formula optimization of Paeoniflorin ethosomes by Box-Behnken design and response surface method

FENJian-nan,DUShou-ying,BAIjie,etal.

DepartmentofParmarcy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

【Abstract】ObjectiveTo optimize the preparation technique for Paeoniflorin ethosome by Box-Behnken design and response surface method. MethodsPaeoniflorin ethosomes was prepared by reverse phase evaporation.The effects of SPC- Cholesterol(X1),concentration of SPC(X2) and concentration of Paeoniflorin(X3)were observed as metrics.The encapsulation efficiency(Y)was evaluated and the formula was optimized by Box-Behnken design and response surface method. ResultsThe optimal formula was ： X1=5.0，X2=18.0，and X3=5.2. The encapsulation efficiency was (44.27±0.27)%.The standardized deviations was below 10%.The average particle size was (167.77±14.91)nm，PDI was (0.41±0.20)(n=3)， deformability was satisfactory. ConclusionUsing Box-Behnken design and response surface method to prepare Paeoniflorin ethosomes is feasible and effective.

【Key words】Paeoniflorin；Ethosomes；Box-Behnken design；Size；Deformability

(收稿日期：2015-12-22)

Corresponding author：DU Shou-ying，E-mail：dushouying@263.net

【中圖分類號】R283

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.04.007

作者簡介：馮健男(1989- )，2013級在讀碩士研究生。研究方向：新劑型與新技術(shù)。E-mail：982166557@qq.com通訊作者： 杜守穎(1960- )，女，博士，教授。研究方向：新劑型與新技術(shù)。E-mail：dushouying@263.net

基金項目：國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制專項(2014ZX09301306-009)