王 越，王士博，于曉雯，楊 玲，拓西平

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院老年病科，上海200433)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，以 β淀粉樣蛋白(β amyloid protein，Aβ)沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及引起神經(jīng)元死亡和認(rèn)知功能障礙的炎性反應(yīng)為特點(diǎn)[1]。AD的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)密切相關(guān)[2]。正常老年人腦組織中也會(huì)有Aβ的沉積，但并沒有認(rèn)知功能減退，AD患者的腦組織中除了有Aβ沉積外，還有神經(jīng)炎性反應(yīng)[3]。神經(jīng)炎性反應(yīng)可刺激腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6 和活性氮氧物質(zhì)等炎性因子釋放增加[4]。而在慢性炎性反應(yīng)過程中，炎性因子的不斷積累又可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，加重認(rèn)知功能減退[5]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB) 的活性可下調(diào) IL-1β 和TNF-α的表達(dá)，改善由Aβ介導(dǎo)的動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力損害[6]。

臨床資料顯示，服用阿司匹林(aspirin)的人群AD患病率較未服用者明顯減少[7]。鑒于阿司匹林具有抗炎作用，推測(cè)其降低AD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可能與抗炎作用有關(guān)。AD作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其治療藥物需能透過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)進(jìn)入腦組織中發(fā)揮作用。Prinsa等[8]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)阿司匹林可部分穿透BBB，其在腦組織和血液中藥物濃度之比約為0.49。本研究使用Aβ25-35制造AD神經(jīng)損傷模型，通過阿司匹林的干預(yù)來探究其對(duì)神經(jīng)炎性反應(yīng)中 TNF-α、IL-1β、NF-κB/p65和磷酸化核因子κB抑制蛋白α(phosphorylated inhibitor protein α of nuclear factor κB，pIκB-α)表達(dá)的影響及其作用機(jī)制，以期能為AD的防治提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

孕齡17～18 d SD大鼠，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。特級(jí)胎牛血清購自Biosun公司，Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基：營養(yǎng)混合物 F-12(DMEM/F-12)、Neurobasal培養(yǎng)基、B27添加劑均購自Gibco公司，胰蛋白酶、多聚-L-賴氨酸、Aβ25-35和阿司匹林均購自Sigma公司，青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)購自 HyClone公司，大鼠 TNF-α和 IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自欣博盛公司，大鼠NF-κB/p65和 pIκB-α 蛋白檢測(cè)用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)一抗試劑盒均購自武漢谷歌生物科技公司。

1.2 胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

孕鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，打開腹腔，取出胎鼠，75%乙醇中消毒后，斷頭處死。打開顱骨，取出全腦，解剖顯微鏡下剝離大腦皮質(zhì)，取出海馬，并去除被膜及血管。用組織剪將其剪碎成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，然后加入等量0.25%胰酶，置于37℃，5%CO2孵箱中消化20 min。再加入種植培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F-12)終止消化，用藍(lán)槍頭緩慢均勻吹打約20次后，以800轉(zhuǎn)/min離心4 min，棄上清液，再加入種植培養(yǎng)基，100 μm篩網(wǎng)過濾后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器調(diào)整懸液密度為1×106/ml。然后將細(xì)胞接種在預(yù)先鋪有0.1 g/L多聚賴氨酸的6孔板上，將其置于孵箱中。孵育4～6 h后去除種植培養(yǎng)基，換用維持培養(yǎng)基(含2%B27和1%雙抗的Neurobasal培養(yǎng)基)。之后每2 d更換半量培養(yǎng)基，第7天更換全量培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞分組及處理

將Aβ25-35溶于 DMSO中，加入三蒸水配成1 mmol/L的母液，再加入維持培養(yǎng)基稀釋至50 μmol/L，置于 37 ℃，5%CO2孵箱中老化 3 d 備用。將阿司匹林溶于無水乙醇，配成100 mmol/L的母液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將培養(yǎng)至第7天的神經(jīng)元隨機(jī)分為4組：(1)Aβ組加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35;(2)低劑量阿司匹林組加入終濃度為50 μmol/L的 阿 司 匹 林 和 20 μmol/L 的 Aβ25-35;(3)高劑量阿司匹林組加入終濃度為100 μmol/L的阿司匹林和20 μmol/L的Aβ25-35;(4)空白對(duì)照組加入等量維持培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，分別取上清液及細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4 TNF-α 和 IL-1β 定量ELISA 測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定上清液中TNF-α和IL-1β含量。

1.5 NF-κB/p65 和 pIκB-α 蛋白含量檢測(cè)

收集細(xì)胞后提取總蛋白和核蛋白，經(jīng)過蛋白濃度測(cè)定、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光后，對(duì)所得圖像進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組上清液中TNF-α和IL-1β含量

各組上清液中TNF-α和IL-1β含量分別見圖1和圖2。與對(duì)照組比較，Aβ組TNF-α和IL-1β含量均明顯升高(P＜0.01)，表明Aβ組炎性反應(yīng)較為明顯;與Aβ組比較，低劑量阿司匹林組TNF-α和IL-1β含量均降低(P＜0.05)，高劑量阿司匹林組TNF-α含量明顯降低(P＜0.01)，IL-1β 含量也降低(P＜0.05)，表明低劑量和高劑量阿司匹林組炎性反應(yīng)受到抑制;低劑量和高劑量阿司匹林組兩組TNF-α和IL-1β含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 各組上清液中TNF-α含量Figure 1 Levels of TNF-α in four groups

圖2 各組上清液中IL-1β含量Figure 2 Levels of IL-1β in four groups

2.2 各組細(xì)胞中 NF-κB/p65 核蛋白和 pIκB-α 總蛋白表達(dá)水平

各組細(xì)胞中NF-κB/p65核蛋白和pIκB-α總蛋白表達(dá)水平分別見圖3和圖4。與對(duì)照組比較，Aβ組NF-κB/p65核蛋白和pIκB-α總蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)，表明Aβ組NF-κB被激活并進(jìn)入核內(nèi);與Aβ組比較，低劑量阿司匹林組NF-κB/p65核蛋白表達(dá)水平偏低(P＜0.05)，pIκB-α 總蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，高劑量阿司匹林組 NF-κB/p65核蛋白表達(dá)水平偏低(P＜0.05)，pIκB-α 總蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，表明低劑量和高劑量阿司匹林組NF-κB的激活受到抑制。低劑量和高劑量阿司匹林組兩組NF-κB/p65核蛋白和pIκB-α總蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖3 各組細(xì)胞中NF-κB/p65核蛋白表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of nucleoprotein NF-κB/p65 in four groups

圖4 各組細(xì)胞中pIκB-α總蛋白表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of total protein pIκB-α in four groups

3 討論

Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid-β protein precursor，APP)的分解產(chǎn)物，由39～43個(gè)多肽組成[9]。Aβ的沉積，不論是以可溶性低聚物還是淀粉樣斑塊的形式，在AD的病理發(fā)展中都具有關(guān)鍵的啟動(dòng)作用[10]。本研究中使用的Aβ25-35片段處于Aβ全長(zhǎng)片段的核心毒性區(qū)域，是可產(chǎn)生與全長(zhǎng)Aβ片段相似神經(jīng)毒性的最短活性區(qū)[11，12]。而與 Aβ1-40和Aβ1-42相比，Aβ25-35由于毒性片段更小，因此更易滲透進(jìn)入細(xì)胞膜[13]。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，側(cè)腦室注射Aβ25-35可使小鼠出現(xiàn)神經(jīng)炎性反應(yīng)、反應(yīng)性膠質(zhì)增生、氧化應(yīng)激、海馬錐體細(xì)胞層神經(jīng)元減少、膽堿能神經(jīng)元丟失和記憶功能障礙等典型 AD表現(xiàn)[14]。Aβ25-35可通過化學(xué)簡(jiǎn)易合成，諸多實(shí)驗(yàn)已證明其性能穩(wěn)定，可在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中模擬出AD特征性的神經(jīng)損傷癥狀，因此本研究選擇這一片段來制造AD神經(jīng)損傷模型。

本研究結(jié)果顯示，Aβ25-35可使神經(jīng)元表達(dá)IL-1β和TNF-α增多，炎性反應(yīng)較為明顯。炎性反應(yīng)是機(jī)體固有的生理防御機(jī)制，具有消除生理危險(xiǎn)因素和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的功能，目的是在感染和創(chuàng)傷時(shí)保護(hù)健康組織[15]。然而AD中的慢性或持久性炎性反應(yīng)則為有害的過程，可引起細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂，最終導(dǎo)致海馬和額葉皮質(zhì)神經(jīng)元死亡和進(jìn)行性神經(jīng)退行性變[16]。Aβ沉積可引起機(jī)體對(duì)其清除的慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)。在這種慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放出細(xì)胞因子、趨化因子、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等，不僅會(huì)對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接毒性作用，還會(huì)進(jìn)一步增加Aβ的產(chǎn)生，潛在加速疾病進(jìn)展[17]。IL-1β和TNF-α是AD炎性反應(yīng)中常見的兩種炎性因子，在AD的病理機(jī)制中起到了一定的作用。álvarez等[18]研究發(fā)現(xiàn)輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)和 AD患者較對(duì)照組血清TNF-α水平明顯升高。IL-1β可增加神經(jīng)元產(chǎn)生 APP 和 Aβ[19]。Centonze等[20]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α具有神經(jīng)毒性作用，可影響神經(jīng)突觸的傳遞功能。

本研究還發(fā)現(xiàn)Aβ25-35可上調(diào)NF-κB/p65核蛋白和pIκB-α總蛋白水平。NF-κB通路在基因調(diào)節(jié)中起著重要的作用，與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡息息相關(guān)[21]。NF-κB 家族包括 5 個(gè)亞單位：p50、p65、c-Rel、p52和RelB。最常見的NF-κB二聚體由p65與p50組成。在靜息細(xì)胞中，NF-κB與其抑制因子IκB結(jié)合，以無活性形式存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、凋亡介質(zhì)和細(xì)菌產(chǎn)物等刺激后，可活化 IκB 激酶(IκB kinase，IKK)復(fù)合體，使 IκB 磷酸化為pIκB，并活化NF-κB兩個(gè)亞單位，使之從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)，與特異性炎性基因結(jié)合，誘導(dǎo)炎性因子轉(zhuǎn)錄，從而誘發(fā)炎性反應(yīng)[22]。有學(xué)者經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，炎性因子TNF-α和IL-1β是NF-κB最有效的刺激因子[23]。而激活的 NF-κB 可繼續(xù)誘導(dǎo) IL-1β、TNF-α、Toll樣受體和脂多糖等細(xì)胞因子表達(dá)，形成慢性炎性反應(yīng)的惡性循環(huán)[24]。

在本研究結(jié)果中，阿司匹林可降低神經(jīng)元中IL-1β和 TNF-α 的表達(dá)，并下調(diào) NF-κB/p65核蛋白和pIκB-α總蛋白水平，表明阿司匹林可能通過抑制NF-κB的活化從而減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)。雖然目前還未證實(shí)阿司匹林對(duì)AD的治療效果，但其在防治AD中的潛在作用已經(jīng)吸引了越來越多學(xué)者的注意。Doost Mohammadpour等[25]用阿司匹林干預(yù) AD 大鼠，發(fā)現(xiàn)阿司匹林可恢復(fù)其已受損的記憶，改善突觸功能障礙。Lee等[26]在使用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)/干擾素(interferon，IFN)γ刺激的人小膠質(zhì)細(xì)胞中預(yù)先加入阿司匹林，其條件培養(yǎng)液可使SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白表達(dá)明顯減少。2014年的一篇薈萃分析[27]也認(rèn)為阿司匹林和非阿司匹林的非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)均可預(yù)防 AD的發(fā)生，并且長(zhǎng)期使用NSAIDs較短期使用有更明顯的預(yù)防保護(hù)作用。然而，也有研究認(rèn)為阿司匹林可能會(huì)增加認(rèn)知功能損傷的風(fēng)險(xiǎn)[28]。之所以會(huì)有不同的結(jié)論，可能是由于許多臨床對(duì)照研究具有短期性、干預(yù)時(shí)間較晚、樣本量小以及使用藥物的劑量和評(píng)價(jià)指標(biāo)不同[29]。因此，對(duì)阿司匹林在長(zhǎng)期AD一級(jí)預(yù)防中的風(fēng)險(xiǎn)與獲益的研究還需要不斷完善試驗(yàn)設(shè)計(jì)、選擇合適的人群和分析方法[30]。

本研究中高劑量和低劑量阿司匹林組兩組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，若進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為了避免高劑量阿司匹林產(chǎn)生的胃腸道副作用，建議使用低劑量阿司匹林。綜上所述，我們從本研究的初步結(jié)果中推測(cè)阿司匹林可能通過抑制NF-κB的活化，減少TNF-α和IL-1β的生成，從而對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元炎性損傷起到保護(hù)作用。提示炎性反應(yīng)可能在AD發(fā)生發(fā)展中具有不可忽視的作用，以及AD抗炎治療的潛在可能性。

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