馮仕云，龔萍，蔣德意，韓迪

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海201700）

嬰兒雙歧桿菌BI-G201的分離與鑒定

馮仕云，龔萍，蔣德意，韓迪

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海201700）

從由健康母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道內(nèi)容物中取得的5份樣品中，利用選擇性培養(yǎng)基和需氧條件分離篩選得到6株雙歧桿菌。經(jīng)菌落形態(tài)特征、生理生化特性及糖發(fā)酵試驗，6株乳酸菌的鑒定結(jié)果為：2株長雙歧桿菌（Bi fi dobacterium longum），2株乳雙歧桿菌（Bi fi dobacterium lactis），2株嬰兒雙歧桿菌（Bi fi dobacterium infantis）。再經(jīng)過16S rRNA基因序列測序分析對比，確認(rèn)分別為長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌BI-G201。

嬰兒腸道；雙歧桿菌；分離；鑒定；16S rRNA基因序列測序

1899年，法國巴黎兒童醫(yī)院的蒂賽（Henry Tissier），從嬰兒糞便中分離了第1株雙歧桿菌（當(dāng)時稱為分叉桿菌）[1]，并且他發(fā)現(xiàn)雙岐桿菌與嬰兒患腹瀉的頻率及營養(yǎng)都有關(guān)系。雙歧桿菌是人體腸道菌群中的重要成員，有著至關(guān)重要的作用，維持著腸道菌群的微生態(tài)平衡，有調(diào)節(jié)腸胃、增強免疫力、抗菌、防腫瘤甚至影響人體認(rèn)知等多種重要的生理功能[2-6]。在人體腸道中，隨著年齡的增長，有益菌的種類與數(shù)量明顯有所下降。所以，在母乳喂養(yǎng)的嬰兒體內(nèi)是最多的，尤其雙歧桿菌在母乳喂養(yǎng)兒腸道內(nèi)大量存在，對嬰幼兒有許多生理功能方面的好處，其中嬰兒雙歧桿菌就是其中一種菌種。

近年來，隨著人們對健康意識的逐漸提升，雙歧桿菌也被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品或食品中[7]。該文從嬰兒腸道內(nèi)容物中分離出嬰兒雙歧桿菌，對其進(jìn)行生化研究及鑒定，從而為以后長期的研究和應(yīng)用打下良好的種質(zhì)資源基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采集由健康母乳喂養(yǎng)的嬰兒的腸道內(nèi)容物樣品5份。

1.2 參考菌株

Bifidobacterium longumATCC15707（GK1）、Bi fi dobacterium infantisATCC 15697、Bi fi dobacterium lactisATCC 25527，均購自中國科學(xué)院微生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

BS培養(yǎng)基、NPNL瓊脂培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基、10%脫脂乳培養(yǎng)基和糖類發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基等。

1.4 儀器設(shè)備

OLYMPUSBX50型光學(xué)顯微鏡及OLYMPUSPM-2型攝像系統(tǒng)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；蘇州佳寶JB-VS-1300U型潔凈工作臺等。

1.5 樣品的采集

將樣品在容器中攪拌均勻后，用滅菌吸管分別吸取2份裝入無菌容器中。將收集的樣品用航空冰袋冷藏，保持全程低溫。樣品保存在潤盈生物工程（上海）有限公司4℃冰箱中，用于乳酸菌的分離。

1.6 菌株的分離與純化

樣品經(jīng)無菌生理鹽水稀釋后，取合適稀釋度，涂布于BS和NPNL瓊脂平板上，放于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48～72h。然后挑選具有一定規(guī)則的與雙歧桿菌菌落形態(tài)類似的菌落，接種于TPY瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)。待長出菌落后，挑取多個菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，挑取具有雙歧桿菌形態(tài)的菌落，進(jìn)一步在TPY瓊脂培養(yǎng)基上純化，鏡檢至純菌株。將純化得到的菌株分別進(jìn)行需氧與厭氧培養(yǎng)，排除均能在需氧和厭氧條件下生長的菌落，挑取僅能在厭氧條件下生長的菌落。

1.7 雙歧桿菌的鑒定

純化后的菌株經(jīng)革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)，并觀察記錄菌落形態(tài)及革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)特征。對純化后的菌株進(jìn)行生理生化試驗，包括糖發(fā)酵試驗、觸酶試驗、明膠液化試驗及淀粉水解試驗等[8，9]。在上述試驗基礎(chǔ)上對所得的雙歧桿菌進(jìn)行DNA提取、PCR擴增，將所得的PCR擴增片段送至中國科學(xué)院微生物研究完成序列測定，在GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）同源性比對分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察

對篩選得到的菌株在BS培養(yǎng)基和NPNL培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)不同，大小不一，有呈淡黃色與白色2種，挑取其中菌落特征為光滑、凸圓、邊緣整齊白色或乳脂色、質(zhì)地柔軟的中小菌落。將菌落分別進(jìn)行純化，至鏡檢為純菌株。然后挑取獲得的純菌落分別在需氧和厭氧條件下培養(yǎng)后，剔除兼性厭氧的菌落，挑取僅能在厭氧條件下生長的菌落6個，以便進(jìn)一步提高雙歧桿菌的純化率。6個菌落分別經(jīng)過革蘭氏染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)6個菌落的菌株呈各種分叉，V型、Y型、單個、成對等不規(guī)則形狀，所以可基本判定這6個菌落是雙歧桿菌。將該6株雙歧桿菌疑似菌株進(jìn)行編號，分別為B1、B2、B3、B4、B5、B6。

2.2 生理生化試驗結(jié)果

以Bifidobacterium longumATCC 15707、Bi fi dobacterium infantisATCC 15697、Bi fi dobacterium lactisATCC 25527等為乳酸菌參考菌株，對6株乳酸菌進(jìn)行生理生化試驗、糖發(fā)酵試驗，結(jié)果如表1所示。根據(jù)試驗結(jié)果，參照已有研究[10]，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，經(jīng)檢索6株乳桿菌可歸到3個類群，B1～B6均不能在空氣中生長，其中桿菌分離株B1、B5發(fā)酵阿拉伯糖、核糖、甘露糖等產(chǎn)酸，不發(fā)酵纖維二糖、甘露醇、山梨醇和水楊苷等糖類產(chǎn)酸，與參考菌株Bi fi dobacterium infantisATCC 15697的試驗結(jié)果一致，符合Bi fi dobacterium infantis的特征，因而將B1、B5鑒定為Bi fi dobacterium infantis；B2和B4不能發(fā)酵核糖、甘露糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇和水楊苷等糖類產(chǎn)酸等，能發(fā)酵阿拉伯糖、蔗糖等糖類，與參考菌株Bi fi dobacterium longumATCC 15707發(fā)酵特征相似，鑒定為Bi fi dobacterium longum；B3和B6菌株不發(fā)酵阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖等糖類，但其均能發(fā)酵核糖、纖維二糖、水楊苷、苦杏仁苷和a-甲基葡萄糖苷，與參考菌株Bi fi dobacterium lactisATCC 25527發(fā)酵特征相似，鑒定為Bi fi dobacterium lactis。

表1 乳酸菌屬種鑒定結(jié)果

2.3 16S rRNA基因序列測定

將上述經(jīng)生理生化試驗所推測出來的乳酸菌B1-B6，進(jìn)行PCR擴增，然后將其送至中國科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行測序鑒定。登錄NCBI（The National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站，將乳酸菌16S rRNA測序結(jié)果與該網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對，結(jié)果見表2。

表2 乳酸菌16S rRNA序列鑒定結(jié)果

從表2中可見，B1、B5菌株與嬰兒雙歧桿菌的同源性達(dá)到100%，所以將其鑒定為嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）；B2、B4菌株與長雙歧桿菌的同源性達(dá)到99%以上，所以將其鑒定為長雙歧桿菌（B.longum）；B3、B6菌株與乳雙歧桿菌的同源性達(dá)到100%，所以將其鑒定為乳雙歧桿菌（B.lactis）。

經(jīng)基因?qū)Ρ辱b定分析，得出B1、B5菌株為長雙歧桿菌嬰兒亞種（Bi fi dobacterium longum subsp.infantis），且將該株菌標(biāo)記為Bi fi dobacterium infantisBI-G201。

3 結(jié)論

本研究從健康嬰兒腸道內(nèi)容物采集的5份樣品中，共分離出6株雙歧桿菌。經(jīng)生理生化初 步 鑒 定，得 到Bi fi dobacterium longum2株，Bifidobacterium infantis2株，Bifidobacterium lactis2株。凍干保存這些菌株，將其中Bi fi dobacterium infantis菌株進(jìn)行16srRNA鑒定，最終確定為嬰兒雙歧桿菌Bi fi dobacterium infantis，并將其編號為Bi fi dobacterium infantisBI-G201。

[1]金世琳.乳酸菌的科學(xué)與技術(shù)[J].中國乳品工業(yè),1998,26(2):14-20.

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[9]東秀株,蔡妙英.常見細(xì)菌鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001:1-30．

[10]伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1984:1-8．

The Separation and Identification of Bi fi dobacterium infantis BI-G201

Feng Shi-yun,Gong Ping,Jiang De-yi,Han Di
(Growing Bio-Engineering (Shanghai) Co.Ltd.,Shanghai 201 700)

From five healthy intestinal contents of the infants by healthy breastfeeding,six strains of bifidobacterium were isolated and screened by selective medium and aerobic condition.According to the morphological,physiological,biochemical characteristics and the sugar-fermentation testing,the identification results of six strains of lactic acid bacteria were as follows:two strains ofBifidobacterium longum,two strains ofBifidobacterium lacits,and two strains ofBifidobacterium infanits.Then through the analysis of sequence of 16S rRNA gene,it was confirmed that these were respectivelyB.longum,B.lactisandB.infanitsBI-G201.

Intestinal contents of the infants;Bifidobacterium;Isolation;Identification;The sequence of 16S rRNA gene

TS252

A

2096-0387（2016）06-0041-04

馮仕云(1988-)，江蘇如東人，碩士，助理工程師，研究方向：食品生物技術(shù)。