程喜平，賴梅生，范 萍，梁康禮，胡小倩，凡 慧，陳金中

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510120；2南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510515；3復(fù)旦大學(xué)遺傳所，上海200433）

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滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓EMP及血清抗ds?DNA抗體的影響

程喜平1，賴梅生2，范 萍1，梁康禮1，胡小倩1，凡 慧1，陳金中3

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510120；2南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510515；3復(fù)旦大學(xué)遺傳所，上海200433）

【摘 要】目的：觀察滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓EMP及血清抗ds?DNA抗體的影響.方法：以滋陰清熱方干預(yù)狼瘡鼠，免疫組化方法觀察EMP陽性細(xì)胞在骨髓的組織形態(tài)，定量PCR檢測EMP基因表達(dá)，同時檢測血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白.結(jié)果：狼瘡模型鼠骨髓EMP陽性細(xì)胞比正常對照組密集，基因表達(dá)增高，血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白也更高；滋陰清熱藥狼瘡模型鼠組與生理鹽水狼瘡模型鼠組EMP的基因表達(dá)組間比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白也明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.結(jié)論：EMP可能是滋陰清熱藥治療SLE新的作用靶點(diǎn).

【關(guān)鍵詞】滋陰清熱藥；幼紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞連接蛋白；抗ds?DNA抗體；紅斑狼瘡

0 引言

國醫(yī)大師禤國維教授總結(jié)的滋陰清熱方對系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）有確切療效，探索滋陰清熱方作用機(jī)理具有積極意義.哺乳動物紅細(xì)胞脫核現(xiàn)象循環(huán)發(fā)生.目前已知骨髓造血島巨噬細(xì)胞和有核幼紅細(xì)胞之間的主要連接蛋白是幼紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞連接蛋白（erythroblast macro?phage protein，EMP），而SLE病情重度活動時，骨髓組織可以發(fā)現(xiàn)噬血細(xì)胞，噬血細(xì)胞的本質(zhì)是骨髓巨噬細(xì)胞吞噬有核紅細(xì)胞［1－2］.據(jù)此，我們推測EMP參與SLE發(fā)病并可能是中西醫(yī)藥物作用的靶點(diǎn)，為此本研究探討了滋陰清熱方對骨髓組織EMP的影響，同時觀察對血清抗DS?DNA抗體濃度，結(jié)果具有積極的意義.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組 16只雌性MRL／LPR狼瘡鼠模型鼠，12周齡，體質(zhì)量25.1～30.4（平均27.6）g，隨機(jī)分為兩組：滋陰清熱方模型鼠組8只，模型鼠對照組8只.16只正常B6小鼠，隨機(jī)分為兩組：滋陰清熱方中藥正常鼠對照組8只，正常鼠對照組8只.動物均購自南京大學(xué)動物模型實(shí)驗(yàn)中心.

1.2 試驗(yàn)用藥 滋陰清熱方組：山萸肉15 g、生地黃20 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、牡丹皮15 g、青蒿8 g、甘草6 g（由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供），水煎后，濃縮處理（中藥含藥量為94 g），生藥濃度1.5 mg／mL，0.02 mL·g－1·d－1，灌胃1次／d；空白對照組：生理鹽水0.6 mL，灌胃1次／d，均干預(yù)治療6周.處死前代謝籠收集各組實(shí)驗(yàn)鼠24 h尿液.用考馬斯亮藍(lán)法測定尿蛋白含量.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法和試劑 脫頸處死小鼠，心臟取血進(jìn)行抗ds?DNA抗體檢測，骨髓進(jìn)行定量PCR和免疫組化檢測.剝離四肢肌肉，前肢長骨固定石蠟做免疫組化檢測，后肢剪去兩端軟骨露出紅色的骨髓腔.冰上操作，吸取5 mL冷凍的PBS液沖洗骨髓腔，離心去上清，提取總RNA進(jìn)行EMP基因表達(dá)檢測，引物購自上海Life Technology公司訂購，引物序列：上游5’?ACCCGACCCTCAAGGTGCCC?3’，下游5’?GTGGC?CG TCTCACGCCTCTC?3’.

1.3.1 RT?PCR 總RNA提取，用TRizol試劑按試劑盒進(jìn)行；PCR實(shí)驗(yàn)：Roche Light Cycle 480軟件，在“Template”下拉菜單中選擇“kappa”，反應(yīng)條件，40個循環(huán).

1.3.2 免疫組化 小鼠后肢骨標(biāo)本采用EDTA脫鈣液，微波修復(fù)，二甲苯脫蠟，高壓抗原修復(fù)，常規(guī)免疫組化操作.

1.3.3 血清抗ds?DNA抗體檢測 按試劑盒說明進(jìn)行相關(guān)操作在分光檢側(cè)儀上讀取450 nm波長的OD值.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)，以α＝0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓組織EMP的影響

2.1.1 小鼠骨髓組織EMP免疫組化染色 狼瘡模型小鼠和正常小鼠骨髓組織均可見EMP染色陽性細(xì)胞（圖1）.EMP染色陽性細(xì)胞為棕黃色細(xì)胞，細(xì)胞漿、和細(xì)胞膜細(xì)胞核均被染色，但以細(xì)胞漿、細(xì)胞膜染色明顯.在骨髓中，EMP染色陽性細(xì)胞均是大細(xì)胞，大細(xì)胞周圍均有數(shù)目不等的有核細(xì)胞圍繞，狼瘡模型鼠EMP染色陽性細(xì)胞比正常鼠密度高，滋陰清熱藥狼瘡模型鼠組EMP染色陽性細(xì)胞密度比狼瘡模型鼠對照組低.

圖1 小鼠骨髓組織EMP免疫組化染色

2.1.2 滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓組織EMP的mRNA表達(dá)的影響 生理鹽水組的狼瘡模型鼠組與正常鼠對照組EMP的mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）；滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和生理鹽水狼瘡模型鼠組EMP的mRNA表達(dá)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）.

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓組織EMP的mRNA表達(dá)

2.2 滋陰清熱藥對狼瘡鼠血清抗ds?DNA抗體的影響 生理鹽水組的狼瘡模型鼠組與正常鼠對照組抗dsDNA抗體表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2），滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和生理鹽水狼瘡模型鼠組抗dsDNA抗體表達(dá)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）.同時生理鹽水組的狼瘡模型鼠組與正常鼠對照組尿蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2），滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和生理鹽水狼瘡模型鼠組尿蛋白表達(dá)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）.

表2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清抗dsDNA抗體情況

3 討論

哺乳動物骨髓紅細(xì)胞脫核成熟時，幼紅細(xì)胞脫落的核被巨噬細(xì)胞吞噬，在SLE狼瘡病情極度活動時，巨噬細(xì)胞活化并吞噬幼紅細(xì)胞，出現(xiàn)噬血細(xì)胞［1－2］，二者可能存在一定聯(lián)系.EMP是巨噬細(xì)胞和有核幼紅細(xì)胞連接蛋白，EMP的缺乏會造成紅細(xì)胞脫核成熟的失敗［3－6］，影響巨噬細(xì)胞分化發(fā)育及極化［7］，我們推測EMP參與SLE疾病發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮重要作用.國醫(yī)大師禤國維教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)了滋陰清熱方，對SLE有確切療效，闡明其機(jī)理一直是人們的努力方向.為此本研究探討了滋陰清熱方對骨髓EMP的作用變化，并以血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白作參考，分析滋陰清熱方對骨髓EMP的作用及意義.

本研究結(jié)果顯示，狼瘡鼠和正常鼠骨髓EMP均可見陽性細(xì)胞，正常鼠骨髓組織中的細(xì)胞密度低，無細(xì)胞的空白背景清晰散在均勻，病理切片上的EMP陽性細(xì)胞體積形態(tài)是周圍有核細(xì)胞10倍左右，棕黃色染色在細(xì)胞膜處明顯加深，EMP陽性細(xì)胞周圍圍繞有核細(xì)胞.EMP由骨髓的巨噬細(xì)胞生成，逐漸從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜過渡，最后聚集細(xì)胞膜發(fā)揮連接巨噬細(xì)胞和幼紅細(xì)胞的作用，形成骨髓造血島，EMP陽性細(xì)胞周圍圍繞有核細(xì)胞結(jié)構(gòu)符合骨髓造血島形態(tài).

EMP的定量PCR檢測結(jié)果顯示，未用藥的狼瘡模型鼠組比正常鼠對照組EMP的mRNA表達(dá)顯著性升高，說明EMP參與SLE發(fā)病；而滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和未用藥狼瘡模型鼠組EMP的mRNA表達(dá)組間比較明顯下降，說明滋陰清熱藥可能通過調(diào)控EMP發(fā)揮治療SLE的作用.

我們研究滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓組織EMP的影響時，選用血清抗dsDNA抗體濃度和尿蛋白作為參照，結(jié)果顯示，血清中抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白變化規(guī)律與骨髓組織中的EMP變化規(guī)律類似，相關(guān)結(jié)果結(jié)合分析提示，EMP可能參與狼瘡發(fā)病機(jī)理并與狼瘡病情活動及器官損害有關(guān).

值得指出的是，巨噬細(xì)胞不僅是紅細(xì)胞脫核成熟的關(guān)鍵功能細(xì)胞，同時也是機(jī)體的重要免疫功能細(xì)胞.我們尤其關(guān)注的是EMP由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是紅細(xì)胞脫核成熟重要功能蛋白，協(xié)助巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞脫落的細(xì)胞核［8］，而包括SLE在內(nèi)的結(jié)締組織病核心機(jī)理之一是機(jī)體產(chǎn)生抗核抗體，本研究提示EMP的變化規(guī)律與抗ds?DNA抗體變化規(guī)律及尿蛋白密切相關(guān).我們推測EMP可能是巨噬細(xì)胞參與SLE核心發(fā)病機(jī)理并調(diào)控抗核抗體產(chǎn)生的功能蛋白之一，也可能是滋陰清熱藥等防治SLE藥物作用靶點(diǎn)，值得我們深入研究.

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·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

METHODS：Lupus mice were treated with Nourishing Yin Clear?ing Heat herbs.The histomorphology of EMP positive cells in bone marrow were observed by immunohistochemistry，EMP gene expression were detected by quantitative PCR，and the concentra?tion of serum anti ds?DNA antibody and Proteinuria was detected respectively.RESULTS：Compared with normal control group，the lupus mice had more intensive of EMP positive cells and high?er EMP gene expression in bone marrow，also had higher concen?tration of serum anti ds?DNA antibody and Proteinuria.Compared with lupus mice control group，the intensive of EMP positive cells and EMP gene expression of the Nourishing Yin Clearing Heat Herbs lupus mice group was decreased，and concentration of ser?um anti ds?DNA antibody and Proteinuria was also decreased.

CONCLUSION：EMP may be a new target of treatment for sys?temic lupus erythematosus（SLE）by Nourishing Yin and Clearing Heat Herbs.

Effects of Nourishing Yin and Clearing Heat Herbs on bone marrow EMP and anti ds?DNA antibody in tissue of lupus mice

CHENG Xi?Ping1，LAI Mei?Sheng2，F(xiàn)AN Ping1，LIANG Kang?Li1，HU Xiao?Qian1，F(xiàn)AN Hui1，CHEN Jin?Zhong31The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong 510120，China；2Department of Traditional Chinese Medicine of Southern Medical University，Guangdong 510515，China；3State Key Laboratory of Genetic Engineering，Institute of Genetics，School of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200433，China

【Abstract】AIM：To observe the effect on erythroblast macro?phage protein（EMP）and anti ds?DNA antibody in bone marrow tissue of lupus mice with Nourishing Yin Clearing Heat Herbs.

【Keywords】Nourishing Yin Clearing Heat Herbs；erythroblast macrophage protein；anti ds?DNA antibody；lupus erythematosus

通訊作者：范 萍.E?mail：fanping18＠163.com

作者簡介：程喜平.E?mail：cxpgz＠126.com

收稿日期：2015－11－12；接受日期：2015－11－29

文章編號：2095?6894（2016）02?08?03

【中圖分類號】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A